Obrazowanie in vivo mózgu larw danio pręgowanego w celu wizualizacji neuronów móżdżku

Zacznij od znieczulonych transgenicznych larw danio pręgowanego w komorze montażowej zawierającej natleniony bufor fizjologiczny pod mikroskopem stereoskopowym.

Móżdżek w mózgu zawiera genetycznie zmodyfikowane neurony Purkinjego wyrażające fluorescencyjne białka cytoplazmatyczne.

Usuń nadmiar pożywki, a następnie dodaj stopioną agarozę, aby unieruchomić larwy w celu stabilnego obrazowania.

Ustaw larwy grzbietową stroną do góry, aby uwidocznić móżdżek.

Po zestaleniu odetnij nadmiar agarozy. Za pomocą szklanej igły wytnij pigmentowaną skórę pokrywającą mózg, aby ją odsłonić.

Odwróć blok agarozy do komory obrazowania zawierającej stopioną agarozę do obrazowania pod odwróconym mikroskopem.

Dodaj bufor fizjologiczny, aby zachować funkcje neuronów.

Umieść komorę pod odwróconym mikroskopem konfokalnym. Zastosuj światło wzbudzenia do wzbudzenia białek fluorescencyjnych, umożliwiając wizualizację znakowanych neuronów.

Pigmentowane komórki skóry, jeśli nie zostaną usunięte, rozpraszają i pochłaniają światło wzbudzające, zmniejszając intensywność fluorescencji.

Usuwanie skóry poprawia przenikanie światła, aby zwiększyć intensywność fluorescencji, ułatwiając wizualizację neuronów.

Aby osadzić larwę, użyj pipety Pasteura, aby przenieść znieczuloną larwę do komory montażowej pod mikroskopem stereoskopowym. Jeśli jakakolwiek larwa jest nadal w stanie się poruszać, nie używaj ryb do eksperymentu, dopóki ryby nie będą całkowicie niezdolne do poruszania się. Gdy larwy są nieruchome, ostrożnie usuń nadmiar pożywki i natychmiast dodaj na larwę co najmniej 1 mililitr niskotopliwej agarozy.

Ustaw danio pręgowanego tak, aby obszar grzbietowy był skierowany do góry jak najbliżej powierzchni agarozy. Jeśli larwy będą obrazowane za pomocą odwróconego mikroskopu, po zestaleniu należy przyciąć agarozę zawierającą larwę do małego prostopadłościennego bloku. Aby wystawić mózg na obrazowanie, w razie potrzeby odetnij nadmiar agarozy nad obszarem mózgu będącym przedmiotem zainteresowania i użyj szklanej igły, aby wykonać małe nacięcie przez skórę w pobliżu, ale nie nad obszarem zainteresowania, bez wnikania zbyt głęboko w tkankę.

Ledwo przesuwając igłę tuż pod powierzchnią skóry, kontynuuj ostrożne wykonywanie bardzo małych nacięć wokół obszaru zainteresowania, aż skóra nad obszarem zainteresowania będzie mogła zostać usunięta lub odsunięta na bok. Po usunięciu tkanki ze wszystkich zarodków dodaj małą kroplę niskotopliwej agarozy do wcześniej przygotowanej komory obrazowania mikroskopu odwróconego i za pomocą małej szpatułki obróć prostopadłościenny blok agarozy o 180 stopni na kroplę agarozy w komorze obrazowania. Gdy agaroza zastygnie, napełnij komorę obrazowania świeżym ACSF i rozpocznij obrazowanie larwy.