JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:15 min • June 17th, 2025
Zacznij od żywego eksplantatu siatkówki myszy po urodzeniu zamontowanego na filtrze membranowym i umieszczonego w komorze inkubacyjnej pod mikroskopem konfokalnym.
Siatkówka jest transfekowana w celu ekspresji białka fluorescencyjnego w błonach interneuronów amakrynowych gwiazdotwórczych.
Umieść wstępnie zwilżoną próbkę masy na siatkówce, aby ją ustabilizować.
Napełnij komorę buforem.
Utrzymuj optymalny przepływ buforowy i temperaturę w komorze, aby zachować żywotność neuronów.
Umieść obiektyw zanurzony w wodzie w komorze obrazowania.
Rozpocznij obrazowanie epifluorescencyjne.
Światło lasera, skierowane przez obiektyw, wzbudza białko fluorescencyjne w komórkach amakrynowych.
Emitowana fluorescencja jest wychwytywana przez ten sam obiektyw, co pozwala na wizualizację znakowanych komórek amakrynowych.
Zidentyfikuj jaskrawo fluorescencyjną komórkę do obrazowania.
Ustaw parametry obrazowania.
Przechwytuj obrazy w wielu płaszczyznach Z, aby uzyskać wizualizację 3D pełnej morfologii dendrytycznej.
Wykonaj obrazowanie poklatkowe, aby śledzić zmiany w morfologii dendrytycznej w czasie.
Zmontować komorę inkubacyjną do obrazowania na żywo i napełnić ją natlenionym aCSF. Włącz pompę i regulator temperatury, upewniając się, że temperatura nie wzrośnie powyżej 34 stopni Celsjusza. Ustabilizowanie się temperatury w komorze może potrwać do godziny. Zaleca się ustawienie komory inkubacyjnej przed rozpoczęciem rozwarstwienia siatkówki. Stabilna temperatura w komorze pomaga zmniejszyć dryft próbki.
Aby przenieść płaski wzgórek siatkówki do komory perfuzyjnej, zatrzymaj pompę i usuń aCSF, który znajduje się w komorze. Następnie umieść krążek MCE z płaskim mocowaniem siatkówki w komorze inkubacyjnej. Wstępnie zwilż wzorzec próbki, aby złamać napięcie powierzchniowe, a następnie umieść ją na płaskim kopcu, upewniając się, że masa próbki jest umieszczona na papierze MCE, aby zmniejszyć dryft próbki. Napełnij komorę podgrzanym aCSF i cyrkuluj aCSF z prędkością około 1 mililitra na minutę.
Umieść końcówkę nosową z obiektywem zanurzającym 25 razy w wodzie w komorze obrazowania. Wykonaj badanie przesiewowe w poszukiwaniu oznaczonych komórek zainteresowania za pomocą światła epifluorescencyjnego i dostosuj głośność obrazowania, aby uchwycić interesujące cechy dendrytyczne.
Korzystając z tabeli przeglądowej, która identyfikuje zarówno przesycone, jak i nienasycone piksele, dostosuj moc lasera w taki sposób, aby żadne piksele nie były przesycone. Uzyskaj objętość obrazowania 3D i powtórz akwizycję z żądaną liczbą klatek na sekundę. Objętość obrazowania można regulować między poszczególnymi punktami czasowymi, aby skompensować dryft próbki.