JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 2:23 min • June 17th, 2025
Weźmy na przykład kokulturę unieśmiertelnionych ludzkich komórek glejowych lub OEG i aksotomijnych neuronów zwojowych siatkówki szczura lub RGN na szkiełku nakrywkowym.
Komórki OEG wykazują właściwości neuroregeneracyjne, które ułatwiają regenerację aksonów w RGN.
RGN są znakowane immunologicznie, dzięki czemu ich somy lub ciała komórkowe fluoryzują na czerwono, podczas gdy ich aksony fluoryzują na zielono.
Za pomocą nośnika montażowego zamontuj szkiełko nakrywkowe zawierające ogniwa.
Użyj mikroskopu epifluorescencyjnego, aby uchwycić wiele obrazów RGN.
Otwórz obraz w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu.
Określ ilościowo procent neuronów z aksonami w stosunku do całkowitej liczby RGN.
Następnie prześledź akson, zaczynając od somy do końca i rozpocznij śledzenie aksonów, aby określić długości wszystkich aksonów.
Określ ilościowo wskaźnik regeneracji aksonów, dzieląc sumę wszystkich długości aksonów przez całkowitą liczbę RGN.
Zamontuj szkiełka nakrywkowe za pomocą podłoża montażowego i utrzymuj je w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Użyj 40-krotnego obiektywu mikroskopu epifluorescencyjnego, aby określić ilościowo regenerację aksonów. Określ ilościowo odsetek neuronów z aksonami w stosunku do całkowitej populacji neuronów zwojowych siatkówki.
Użyj wtyczki NeuronJ w ImageJ, aby określić ilościowo wskaźnik regeneracji aksonów lub średnią długość aksonów, która jest sumą długości wszystkich zidentyfikowanych aksonów podzieloną przez całkowitą liczbę zliczonych neuronów, niezależnie od tego, czy prezentowały akson, czy nie. Po otwarciu obrazu kliknij Analizuj i ustaw skalę zgodnie z ustawieniami mikroskopu, pracując w pikselach na mikrometr. Wybierz opcję Dodaj śledzenia, aby rozpocząć śledzenie aksonów, a następnie śledź aksony od somy do końca. Kliknij Zmierz śledzenia, wyświetl pomiary śledzenia i Uruchom.