JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 4:15 min • August 7th, 2025
Weźmy genetycznie zmodyfikowane szczenię myszy z kasetą STOP po bokach loxP, która blokuje ekspresję czerwonego białka fluorescencyjnego lub RFP.
Zabezpiecz szczeniaka na specjalnie wykonanej ramie stereotaktycznej i przykryj go lodem, aby utrzymać znieczulenie.
Zdezynfekuj skórę głowy i oznacz lambdę jako punkt odniesienia.
Ustawić igłę do wstrzykiwań zgodnie ze współrzędnymi prążkowia względem lambda i nakłuć czaszkę.
Cofnij igłę do powierzchni czaszki, a następnie włóż ją na docelową głębokość.
Wstrzyknąć wektor wirusowy zmieszany z barwnikiem do prążkowia w kontrolowanej szybkości. Wektor koduje białka zielonej fluorescencji lub GFP i rekombinazę Cre.
Powoli wyjmować igłę, aby zapobiec cofaniu się roztworu.
Usuń szczenię i pozwól na odzyskanie.
W komórkach prążkowia wirus uwalnia swój genom, umożliwiając ekspresję rekombinazy Cre i GFP. Cre wycina kasetę STOP z bokami loxP, aktywując wyrażenie RFP.
Jednoczesna ekspresja GFP i RFP potwierdza udaną manipulację genami.
Umieść szczeniaka z rękawicą w tacce na głowę i połóż trochę pokruszonego lodu wokół lateksowego rękawa, aby utrzymać znieczulenie hipotermią. Następnie wyszoruj głowę szczeniaka 70% etanolem i zlokalizuj punkt orientacyjny lambda. Zaznacz to markerem. Następnie skieruj końcówkę igły do lambdy i ustaw przednie, tylne i przyśrodkowe współrzędne boczne na zero.
Następnie, konsultując się z atlasem mózgu, przesuń ramię iniekcji do miejsca docelowego. Na przykład prążkowie szczeniąt P2 znajduje się 2,4 milimetra przed lambdą, 1,0 milimetra po każdej stronie linii środkowej i 1,7 milimetra brzusznej. Następnie zaznacz położenie szybkiego zielonego barwnika na probówce PE10 za pomocą długopisu. Następnie powoli zacznij penetrować igłę przez skórę i czaszkę, aż końcówka igły zetknie się z powierzchnią czaszki.
Ustaw współrzędną grzbietowo-brzuszną na zero. Następnie powoli opuść igłę do miejsca docelowego. Po ustawieniu na miejscu odczekaj minutę, aby miąższ powrócił do normalnego kształtu. Następnie uruchom program mikroiniekcji z prędkością 100 nanolitrów na minutę. Podczas wstrzykiwania obserwuj, jak szybko zielony barwnik porusza się w rurkach PE.
Bardzo ważne jest, aby powoli penetrować igłę przez skórę i czaszkę, aż końcówka igły zetknie się z powierzchnią czaszki. Podczas wstrzykiwania konieczne jest obserwowanie, jak barwnik Fast Green porusza się w rurkach PE.
Po zakończeniu wstrzyknięcia należy odczekać minutę, a następnie powoli podnieść igłę do połowy głębokości penetracji DV. Następnie odczekaj kolejne 30 sekund, zanim przystąpisz do powolnego wyciągania igły z głowy szczeniaka.
Po zakończeniu wstrzyknięcia ważne jest, aby odczekać minutę przed powolnym podniesieniem igły do połowy głębokości penetracji DV, a następnie odczekać kolejne 30 sekund przed powolnym wycofaniem igły z głowy szczeniaka.
Po wstrzyknięciu wszystkich docelowych miejsc rozgrzej szczenię przez 20 minut w inkubatorze o temperaturze 33 stopni Celsjusza.
Sprawdzaj szczenię co pięć minut, aż odzyska pozycję leżącą mostka. Następnie zwróć szczenię do jego matki.