Stereotaktyczne mikrowstrzyknięcie wektora wirusowego do manipulacji genami u prążkowia szczeniąt myszy

Weźmy genetycznie zmodyfikowane szczenię myszy z kasetą STOP po bokach loxP, która blokuje ekspresję czerwonego białka fluorescencyjnego lub RFP.

Zabezpiecz szczeniaka na specjalnie wykonanej ramie stereotaktycznej i przykryj go lodem, aby utrzymać znieczulenie.

Zdezynfekuj skórę głowy i oznacz lambdę jako punkt odniesienia.

Ustawić igłę do wstrzykiwań zgodnie ze współrzędnymi prążkowia względem lambda i nakłuć czaszkę.

Cofnij igłę do powierzchni czaszki, a następnie włóż ją na docelową głębokość.

Wstrzyknąć wektor wirusowy zmieszany z barwnikiem do prążkowia w kontrolowanej szybkości. Wektor koduje białka zielonej fluorescencji lub GFP i rekombinazę Cre.

Powoli wyjmować igłę, aby zapobiec cofaniu się roztworu.

Usuń szczenię i pozwól na odzyskanie.

W komórkach prążkowia wirus uwalnia swój genom, umożliwiając ekspresję rekombinazy Cre i GFP. Cre wycina kasetę STOP z bokami loxP, aktywując wyrażenie RFP.

Jednoczesna ekspresja GFP i RFP potwierdza udaną manipulację genami.

Umieść szczeniaka z rękawicą w tacce na głowę i połóż trochę pokruszonego lodu wokół lateksowego rękawa, aby utrzymać znieczulenie hipotermią. Następnie wyszoruj głowę szczeniaka 70% etanolem i zlokalizuj punkt orientacyjny lambda. Zaznacz to markerem. Następnie skieruj końcówkę igły do lambdy i ustaw przednie, tylne i przyśrodkowe współrzędne boczne na zero.

Następnie, konsultując się z atlasem mózgu, przesuń ramię iniekcji do miejsca docelowego. Na przykład prążkowie szczeniąt P2 znajduje się 2,4 milimetra przed lambdą, 1,0 milimetra po każdej stronie linii środkowej i 1,7 milimetra brzusznej. Następnie zaznacz położenie szybkiego zielonego barwnika na probówce PE10 za pomocą długopisu. Następnie powoli zacznij penetrować igłę przez skórę i czaszkę, aż końcówka igły zetknie się z powierzchnią czaszki.

Ustaw współrzędną grzbietowo-brzuszną na zero. Następnie powoli opuść igłę do miejsca docelowego. Po ustawieniu na miejscu odczekaj minutę, aby miąższ powrócił do normalnego kształtu. Następnie uruchom program mikroiniekcji z prędkością 100 nanolitrów na minutę. Podczas wstrzykiwania obserwuj, jak szybko zielony barwnik porusza się w rurkach PE.

Bardzo ważne jest, aby powoli penetrować igłę przez skórę i czaszkę, aż końcówka igły zetknie się z powierzchnią czaszki. Podczas wstrzykiwania konieczne jest obserwowanie, jak barwnik Fast Green porusza się w rurkach PE.

Po zakończeniu wstrzyknięcia należy odczekać minutę, a następnie powoli podnieść igłę do połowy głębokości penetracji DV. Następnie odczekaj kolejne 30 sekund, zanim przystąpisz do powolnego wyciągania igły z głowy szczeniaka.

Po zakończeniu wstrzyknięcia ważne jest, aby odczekać minutę przed powolnym podniesieniem igły do połowy głębokości penetracji DV, a następnie odczekać kolejne 30 sekund przed powolnym wycofaniem igły z głowy szczeniaka.

Po wstrzyknięciu wszystkich docelowych miejsc rozgrzej szczenię przez 20 minut w inkubatorze o temperaturze 33 stopni Celsjusza.

Sprawdzaj szczenię co pięć minut, aż odzyska pozycję leżącą mostka. Następnie zwróć szczenię do jego matki.