Name: Eksperymentalna manipulacja wielkością ciała w celu oszacowania morfologicznych zależności skalowania u Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Poznaj metodę manipulacji dietą w celu zwiększenia zmienności wielkości ciała u Drosophila i szacowania relacji skalowania między rozmiarem ciała a skrzydła. Ta technika pozwala badać ewolucję cech morfologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania opisane w niniejszej pracy były finansowane z grantu National Science Foundation (DEB-0805818) przyznanego W.A.F., A.W.S. oraz I.D. Badanie to było również wspierane przez granty IOS-0845847 dla A.W.S., IOS-0919855 dla A.W.S. i I.D. oraz IOS-0920720 dla W.A.F.

1. Hodowla i manipulacja dietą w celu uzyskania zmienności wielkości ciała i wielkości skrzydeł
Uzasadnienie i Przegląd. Ekspresja zależności skalowania zależy ostatecznie od rozwojowych procesów regulacyjnych, które generują zmienność końcowej wielkości organów i ciała. Procesy te są najlepiej opisane w pracach nad owadami przechodzącymi pełną przeobraźkę (tzn. holometabolnymi), takimi jak D. melanogaster, w których organy rozwijają się jako niezróżnicowane „dyski imaginalne” wewnątrz larwy przypominającej gąsienicę11,15-17. U Drosophila końcowa wielkość organów i ciała jest regulowana przez wzrost podczas stadiów larwalnych; larwy rosną przez pierwsze i drugie stadium larwalne, aż osiągną minimalną masę niezbędną do wylochania (MVWE) pod koniec trzeciego stadium larwalnego18. Głodzenie przed osiągnięciem MVWE uniemożliwia wylochanie osobników dorosłych. Jednak larwy głodzone przy osiągnięciu MVWE dają żywotne osobniki dorosłe, choć o bardzo małych rozmiarach. Dzieje się tak dlatego, że ograniczone odżywienie podczas rozwoju zmniejsza końcową wielkość ciała i organów, nie tylko u muszek, ale u niemal wszystkich zwierząt19-21. Poprzez manipulację dostępnością pokarmu po osiągnięciu MVWE, lecz przed zapoczątkowaniem przepoczwarzenia, możliwe jest wywołanie ekstremalnej plastyczności fenotypowej wielkości ciała, która znacznie przewyższa inne źródła zmienności (np. indywidualną zmienność genetyczną).
<ol>
	<li>Jaja są zbierane z populacji przeznaczonej do fenotypowania, dzielone na partie po 50 sztuk i umieszczane w fiolkach zawierających 10ml standardowej pożywki dla much. Ponieważ składanie jaj odbywa się w sposób ciągły, są one zbierane co 24h przez trzy dni, co pozwala na utworzenie trzech kohort wiekowych.</li>
	<li>W momencie, gdy najstarsza kohorta osiągnie stadium wędrowania lub właśnie zacznie przepoczwarzać się, stosuje się manipulację dietą. Na tym etapie najstarsza kohorta znajduje się znacznie powyżej MVWE, najmłodsza kohorta jest bardzo blisko MVWE, a pozostała kohorta znajduje się pomiędzy tymi ekstremami. Zatem usunięcie pożywki w tym momencie spowoduje uzyskanie bardzo dużych osobników dorosłych z najstarszej kohorty, bardzo małych z najmłodszej oraz osobników o średniej wielkości z pozostałej kohorty. Aby usunąć larwy z fiolek, do wszystkich naczyń dodaje się około 5ml 40% roztworu sacharozy. W celu uwolnienia larw, pożywkę miesza się przez 15-20 minut na stołach wstrząsowych ustawionych na średnią prędkość.</li>
	<li>Pływające larwy są usuwane z roztworu sacharozy za pomocą cienkiego (00) pędzla, przenoszone do fiolek z wilgotnym czopem watowym i pozostawiane do przepoczwarczenia. Alternatywnie larwy można umieścić na nietrawionym dodatku do pożywki, takim jak metyloceluloza22.</li>
</ol>
2. Pomiar wielkości ciała
Uzasadnienie i przegląd. Poprzednie badania wskazują, że długość klatki piersiowej nie jest idealnym wskaźnikiem całkowitej wielkości ciała22. Zamiast tego, jako miarę wielkości ciała wykorzystujemy rozmiar poczwarki. Maksymalna wielkość ciała zostaje ustalona w momencie zaprzestania żerowania poprzedzającego przepoczwarczenie. W rezultacie istnieje ścisła korelacja między rozmiarem poczwarki a wielkością ciała osobnika dorosłego23.
<ol>
	<li>Pokrywy są układane stroną brzuchową do góry na szklanych lamelkach i obrazowane za pomocą kamery cyfrowej przymocowanej do mikroskopu stereoskopowego. Każdy obraz jest rejestrowany, przypisany do unikalnego kodu identyfikacyjnego i przesyłany do komputera poprzez transmisję na żywo łączącą kamerę cyfrową z komputerem.</li>
	<li>Obrazowane pokrywy przenosi się do poszczególnych probówek typu epitube o pojemności 2 ml zawierających 1 ml pożywki dla much, etykietuje unikalnym kodem przypisanym do danej osobnika i nakłuwa otworami powietrznymi, aby umożliwić wymianę gazową.</li>
	<li>Wielkość pokrywy szacuje się jako liczbę pikseli sylwetki pokrywy. Można również zastosować inne wskaźniki wielkości.</li>
</ol>
3. Szacowanie wielkości cechy (skrzydła)
Uzasadnienie i przegląd. Do obrazowania skrzydeł używamy tzw. „chwytaka do skrzydeł”24, który wyciąga i utrzymuje skrzydło żywej, znieczulonej muchy prostopadle do jej ciała. Dzięki przyciśnięciu między dwiema szybkami skrzydło może być obrazowane jako obiekt dwuwymiarowy.
<ol>
	<li>Muchy są lekko znieczulone CO2 i umieszczane w uchwycie do skrzydeł pod mikroskopem sekcyjnym wyposażonym w kamerę cyfrową podłączoną do komputera.</li>
	<li>Wykonuje się obraz skrzydła i zapisuje go pod unikalnym kodem przypisanym do danej osobnicy.</li>
	<li>Wielkość skrzydła można oszacować, wykorzystując minimalny wielokąt wypukły obejmujący marginalne punkty orientacyjne lub obliczając liczbę pikseli sylwetki skrzydła.</li>
</ol>
4. Szacowanie zależności skalowania
<ol>
	<li>Dane z różnych kohort są łączone, ale rozdzielane według płci i poddawane transformacji logarytmicznej.</li>
	<li>Relacje skalowania są dopasowywane do danych o rozmiarze przy użyciu regresji typu II (tj. zredukowanej osi głównej – Reduced Major Axis) (patrz przegląd w 12), a parametry są szacowane dla każdej grupy.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
Nasza manipulacja dietą spowoduje powstanie szerokiego zakresu wielkości ciała (Rysunek 1) oraz wielkości cech (Rysunek 2). Wykreślenie logarytmowanych cech względem siebie ujawnia wzorzec ich współzmienności w ramach danej grupy biologicznej i pozwala na dopasowanie relacji skalowania do tej grupy (Rysunek 3). Wyznaczenie parametrów relacji skalowania, które opisują, w jaki sposób kształt skaluje się wraz z wielkością ciała, umożliwia porównanie współzmienności kształtu i rozmiaru pomiędzy grupami.
<img alt="Analiza morfologii owadów; obrazowanie wysokokontrastowe formy larwalnej; wykres badania porównawczego." src="/files/ftp_upload/3162/3162fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Poczwarki z ekstremów rozkładu wielkości, uzyskane poprzez manipulację dietą po osiągnięciu przez osobniki MVWE. Po lewej stronie przedstawiono rzeczywiste obrazy poczwarek, a po prawej odpowiadające im sylwetki służące do pomiaru wielkości poczwarki. Pasek skali wynosi 1mm.
<img alt="Schemat morfologii skrzydeł owadów, wyróżniający wzory żyłkowania i porównawczą analizę kształtu." src="/files/ftp_upload/3162/3162fig2.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Skrzydła pobrane z ekstremów rozkładu wielkości ciała uzyskanego poprzez manipulację dietą po osiągnięciu przez osobniki MVWE. Po lewej stronie przedstawiono rzeczywiste zdjęcia skrzydeł, a po prawej odpowiadające im sylwetki służące do pomiaru wielkości skrzydeł. Pasek skali wynosi 1mm.
<img alt="Wykresy rozrzutu powierzchni skrzydeł w stosunku do powierzchni poczwarki dla samców i samic; analiza danych, wyniki badań biologicznych." src="/files/ftp_upload/3162/3162fig3.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Skalowanie wielkości skrzydeł względem ciała u Drosophila melanogaster w zależności od płci. Logarytmowane dane dla osobników każdej płci, które w stadium larwy były w pełni karmione (ciemne kółka), głodzone przez jeden dzień (szare kółka) lub dwa dni (puste kółka). Dla każdej płci przedstawiono linię regresji typu II. Między poszczególnymi kohortami wiekowymi występuje spadek średniej powierzchni skrzydeł o ok. 0,1 mm (~7%) i ok. 0,2 mm (~8%), co zwiększa całkowity zakres obserwowanych fenotypów. Regresje wykazują, że samice wykazują lekką hypoallometrię w tej relacji skalowania (nachylenie 0,96), podczas gdy samce wykazują lekką hyperallometrię (nachylenie 1,06).

<ol><li>Schmidt-Nielsen, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchmidt-Nielsen%2C+K+%22Scaling%3A+Why+is+animal+size+so+important%22">Scaling: Why is animal size so important</a>. , Cambridge University Press. (1984).</li>
<li>Calder, W. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCalder%2C+WA+%22Size%2C+function+and+life+history%22">Size, function and life history</a>. , Harvard University Press. (1984).</li>
<li>Huxley, J. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHuxley%2C+JS+%22Problems+of+relative+growth%22">Problems of relative growth</a>. , Methuen & Co. (1932).</li>
<li>Gould, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allometry+and+size+in+ontogeny+and+phylogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Allometry and size in ontogeny and phylogeny.</a> Biol. Rev. 41, 587-640 (1966).</li>
<li>Alberch, P., Gould, S. J., Oster, G. F., Wake, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+and+shape+in+ontogeny+and+phylogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Paleobiology%22%5BJournal%5D)">Size and shape in ontogeny and phylogeny.</a> Paleobiology. 5, 296-317 (1979).</li>
<li>Thompson, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThompson%2C+DW+%22On+growth+and+form%22">On growth and form</a>. , Cambridge University Press. (1917).</li>
<li>Klingenberg, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochrony+and+allometry%3A+The+analysis+of+evolutionary+change+in+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Heterochrony and allometry: The analysis of evolutionary change in ontogeny.</a> Biol. Rev. 73, 79-123 (1998).</li>
<li>Dubois, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sur+le+rapport+de+l%27enc%C3%A9phale+avec+la+grandeur+du+corps+chez+les+Mammiferes%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+Soc.+Anthropol%22%5BJournal%5D)">Sur le rapport de l'encéphale avec la grandeur du corps chez les Mammiferes.</a> Bull. Soc. Anthropol. 8, 337-374 Forthcoming.</li>
<li>Huxley, J. S., Teissier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminology+of+relative+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Terminology of relative growth.</a> Nature. 137, 780-781 (1936).</li>
<li>Huxley, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constant+differential+growth-ratios+and+their+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Constant differential growth-ratios and their significance.</a> Nature. 114, 895-896 (1924).</li>
<li>Shingleton, A. W., Frankino, W. A., Flatt, T., Nijhout, H. F., Emlen, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+and+shape%3A+The+developmental+regulation+of+static+allometry+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Size and shape: The developmental regulation of static allometry in insects.</a> BioEssays. 29, 536-548 (2007).</li>
<li>Frankino, W. A., Emlen, D., Shingleton, A. W. Experimental approaches to studying the evolution of morphological allometries: The shape of things to come. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFrankino%2C+WA+%22Experimental+evolution%3A+Concepts%2C+methods%2C+and+applications%22">Experimental evolution: Concepts, methods, and applications</a>. Garland, T., Rose, M. , University of California Press. (2009).</li>
<li>Emlen, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+selection+on+horn+length-body+size+allometry+in+the+horned+beetle+Onthophagus+acuminatus%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Artificial selection on horn length-body size allometry in the horned beetle Onthophagus acuminatus.</a> Evolution. 50, (1996).</li>
<li>Emlen, D. J., Nijhout, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+evolution+of+exaggerated+morphologies+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">The development and evolution of exaggerated morphologies in insects.</a> Annu. Rev. Entomol. 45, 661-708 (2000).</li>
<li>Shingleton, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Body-size+regulation%3A+Combining+genetics+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Body-size regulation: Combining genetics and physiology.</a> Curr. Biol. 15, 825-827 (2005).</li>
<li>Nijhout, H. F., Davidowitz, G., Roff, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+analysis+of+the+mechanism+that+controls+body+size+in+Manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol%22%5BJournal%5D)">A quantitative analysis of the mechanism that controls body size in Manduca sexta.</a> J. Biol. 5, 16.11-16.15 (2006).</li>
<li>Davidowitz, G., Nijhout, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiological+basis+of+reaction+norms%3A+The+interaction+among+growth+rate%2C+the+duration+of+growth+and+body+size%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Comp.+Biol%22%5BJournal%5D)">The physiological basis of reaction norms: The interaction among growth rate, the duration of growth and body size.</a> Integr. Comp. Biol. 44, 443-449 (2004).</li>
<li>Stieper, B. C., Kupershtok, M., Driscoll, M. V., Shingleton, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaginal+discs+regulate+developmental+timing+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaginal discs regulate developmental timing in Drosophila melanogaster.</a> Dev. Biol. 321, 18-26 (2008).</li>
<li>Colombani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nutrient+sensor+mechanism+controls+Drosophila+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A nutrient sensor mechanism controls Drosophila growth.</a> Cell. 114, 739-749 (2003).</li>
<li>Mirth, C. K., Riddiford, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+assessment+and+growth+control%3A+How+adult+size+is+determined+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Size assessment and growth control: How adult size is determined in insects.</a> BioEssays. 29, 344-355 (2007).</li>
<li>Thissen, J. P., Ketelslegers, J. M., Underwood, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+regulation+of+the+insulin-like+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+Rev%22%5BJournal%5D)">Nutritional regulation of the insulin-like growth factors.</a> Endocr. Rev. 15, 80-101 (1994).</li>
<li>Boots, M., Begon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resource+limitation+and+the+lethal+and+sublethal+effects+of+a+viral+pathogen+in+the+Indian+meal+moth%2C+Plodia+interpunctella%5BTitle%5D)+AND+%22Ecol.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Resource limitation and the lethal and sublethal effects of a viral pathogen in the Indian meal moth, Plodia interpunctella.</a> Ecol. Entomol. 19, 319-326 (1994).</li>
<li>Shingleton, A. W., Mirth, C. K., Bates, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+model+of+static+allometry+in+holometabolous+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+R.+Soc.+B%22%5BJournal%5D)">Developmental model of static allometry in holometabolous insects.</a> Proc. R. Soc. B. 275, 1875-1885 (2008).</li>
<li>Stern, D. L., Emlen, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+basis+of+allometry+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The developmental basis of allometry in insects.</a> Development. 126, 1091-1101 (1999).</li>
<li>Emlen, D. J., Allen, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotype+to+phenotype%3A+Physiological+control+of+trait+size+and+scaling+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Comp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genotype to phenotype: Physiological control of trait size and scaling in insects.</a> Integr. Comp. Biol. 43, 617-634 (2003).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Skalowanie morfologiczne jest przedmiotem intensywnych badań w biologii ewolucyjnej od niemal wieku. W ostatnim czasie bezpośrednie podstawy regulacji wzrostu i skalowania stały się coraz ważniejsze w rozwoju, fizjologii i genetyce (np. patrz przeglądy w 12,15,23-25). Nasza metodologia umożliwia szacowanie relacji skalowania morfologicznego w całym zakresie wielkości cech i rozmiarów ciała. Może to mieć istotne znaczenie, ponieważ wielkość cechy może nie skalować się liniowo wraz z rozmiarem ciała (np. 13,14). Może to jednak nie być widoczne, jeśli zwierzęta są hodowane wyłącznie w idealnych warunkach laboratoryjnych.
Choć nasz protokół opracowano w celu umożliwienia oszacowania relacji skalowania między rozmiarem skrzydeł a rozmiarem ciała u Drosophila, może on zostać zastosowany – po wprowadzeniu modyfikacji specyficznych dla danej cechy – do oszacowania relacji skalowania dla dowolnej cechy morfologicznej u much. Podobnie, manipulacja dietą może prawdopodobnie służyć do uzyskania pełnego zakresu rozmiarów cech i ciała u innych owadów o pełnej przeobrażeniu; takie zastosowania wymagają jedynie określenia momentu osiągnięcia MVWE i zastosowania manipulacji w tym konkretnym punkcie ontogenezy.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content">Brak.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

eksperymentalna manipulacja rozmiarem ciała w celu oszacowania morfologicznych zależności skalowania u drosophila

Experimental Manipulation of Body Size to Estimate Morphological Scaling Relationships in Drosophila

Skalowanie części ciała jest centralną cechą morfologii zwierząt1-7. W obrębie gatunku cechy morfologiczne muszą być odpowiednio proporcjonalne do ciała, aby organizm mógł prawidłowo funkcjonować; osobniki większe zazwyczaj mają większe części ciała, a osobniki mniejsze zazwyczaj mają mniejsze części ciała, tak aby ogólny kształt ciała był zachowany w całym zakresie rozmiarów ciał osobników dorosłych. Wymóg zachowania prawidłowych proporcji sprawia, że osobniki w obrębie gatunku wykazują zazwyczaj niewielką zmienność w relatywnej wielkości cech. Z kolei relatywna wielkość cech może się drastycznie różnić między gatunkami i stanowi główny mechanizm, dzięki któremu powstaje różnorodność morfologiczna. Ponad stulecie badań komparatywnych pozwoliło ustalić te wzorce wewnątrz- i międzygatunkowe3,4.
Być może najszerzej stosowanym podejściem do opisu tej zmienności jest obliczanie zależności skalowania między rozmiarem dwóch cech morfologicznych przy użyciu równania allometrycznego y=bxα, gdzie x i y oznaczają rozmiary dwóch cech, takich jak rozmiar narządu i rozmiar ciała8,9. Równanie to opisuje wewnątrzgrupową (np. gatunkową, populacyjną) zależność skalowania między dwiema cechami w miarę zmiany ich rozmiarów. Logarytmiczna transformacja tego równania prowadzi do prostego równania liniowego log(y) = log(b) + αlog(x), a wykresy log-log rozmiarów różnych cech u osobników tego samego gatunku zazwyczaj wykazują liniowe skalowanie z punktem przecięcia log(b) i nachyleniem α, zwanym „współczynnikiem allometrycznym”9,10. Zmienność morfologiczną między grupami opisuje się poprzez różnice w punktach przecięcia lub nachyleniu zależności skalowania dla danej pary cech. W konsekwencji zmienność parametrów równania allometrycznego (b i α) w sposób elegancki opisuje zmienność kształtu uchwyconą w relacji między rozmiarem narządu a rozmiarem ciała w obrębie i pomiędzy grupami biologicznymi (patrz 11,12).
Nie wszystkie cechy skalują się liniowo względem siebie lub względem rozmiaru ciała (np. 13,14). Z tego powodu morfologiczne relacje skalowania są najbardziej informacyjne, gdy dane obejmują pełny zakres rozmiarów danej cechy. W niniejszej pracy opisujemy, w jaki sposób prosta eksperymentalna manipulacja dietą może zostać wykorzystana do uzyskania pełnego zakresu rozmiarów ciała u owadów. Pozwala to na oszacowanie pełnej relacji skalowania dla dowolnej pary cech, co umożliwia kompletny opis współzmienności kształtu i rozmiaru oraz rzetelne porównanie parametrów relacji skalowania pomiędzy grupami biologicznymi. Choć skupiamy się na Drosophila, nasza metodologia powinna być możliwa do zastosowania niemal u każdego owada przechodzącego pełną metamorfozę.

Morfologiczne zależności skalowania pozwalają uchwycić i opisać kształt organizmów. Przedstawiamy metodę pomiaru morfologicznych zależności skalowania w naturalnym zakresie wielkości ciała u owadów przechodzących pełny przeobrażenie. Dzięki prostej manipulacji dietą zwiększamy rozkład wielkości cech, co pozwala na dokładny opis współzmienności kształtu i wielkości.

Eksperymentalna manipulacja rozmiarem ciała w celu oszacowania morfologicznych zależności skalowania u Drosophila

Skalowanie części ciała jest kluczowym elementem morfologii zwierząt1-7. W obrębie gatunków cechy morfologiczne muszą być odpowiednio proporcjonalne do ciała...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest wykorzystanie manipulacji dostępnością pokarmu w określonych momentach rozwoju w celu uzyskania szerokiego zakresu rozmiarów ciała, co może następnie posłużyć do oszacowania zależności skalowania między cechami morfologicznymi. Najpierw przez trzy dni zbierane są jaja z tej samej populacji much, tworząc trzy kohorty wiekowe. Gdy najstarsza kohorta larw zaczyna przechodzić w stan wędrowny, larwy ze wszystkich kohort są usuwane z pożywki.Wynikiem tej modyfikacji diety jest zwiększony zakres zmienności wielkości poczwarek. Następnie wykonuje się zdjęcia pupili oraz skrzydeł osobników dorosłych wszystkich jednostek, aby umożliwić oszacowanie morfologicznej relacji skalowania między wielkością ciała a wielkością skrzydeł. Ostatecznie uzyskuje się wyniki pokazujące, w jaki sposób wielkość skrzydeł skaluje się w pełnym zakresie możliwej wielkości ciała, dopasowując do danych liniową regresję typu drugiego.W niniejszym badaniu wykorzystujemy manipulację dostępem do składników odżywczych w czasie rozwoju, aby eksperymentalnie zwiększyć zmienność wielkości ciała u dorosłych much. Pozwala nam to na oszacowanie zależności skalowania morfologicznego w pełnym zakresie wielkości ciała. Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowych kwestii dotyczących ekspresji i ewolucji skalowania morfologicznego, takich jak identyfikacja bezpośrednich podstaw zmienności parametrów zależności skalowania w grupach biologicznych.Przenieś populację much do komory kopulacyjnej, a następnie zbieraj jaja co 24 godziny przez trzy dni. W ten sposób, przy użyciu mikroskopu stereoskopowego, utwórz trzy grupy wiekowe. Przenieś partie po 50 jaj z każdej grupy do fiolek zawierających 10 ml standardowej pożywki dla much.Inkubuj fiolki w temperaturze odpowiedniej dla rozwoju larw. Gdy najstarsza kohorta osiągnie stadium wędrowania, należy zastosować manipulację dietą poprzez usunięcie larw z pożywki. Na tym etapie larwy w najstarszej kohorcie znacznie przekraczają minimalną wagę niezbędną do okluzji i osiągają rozmiar zbliżony do naturalnej maksymalnej wielkości ciała.Larwy w kohorcie pośredniej przekroczyły minimalną wagę przeżywalności, lecz wytworzą mniejsze osobniki dorosłe niż larwy z najstarszej kohorty. Larwy z najmłodszej kohorty znajdują się bardzo blisko minimalnej wagi przeżywalności, w związku z czym wytworzą bardzo małe osobniki dorosłe. Aby usunąć larwy z pożywki.Do probówek dodaj około 5 ml 40% roztworu sacharozy, a następnie inkubuj przez 15-20 minut na stole wytrząsowym przy ustawieniu średnim. Po wytrząsaniu usuń pływające larwy z roztworu sacharozy za pomocą cienkiego pędzla i przenieś je zgodnie z kohortami do probówek zawierających zwilżony czop bawełniany w celu utrzymania wilgotności. Inkubuj w pożądanej temperaturze aż do momentu przepocierzenia.Ułóż poczwarki na szkiełku przedmiotowym stroną brzuszną do góry. Po umieszczeniu poczwarek wykonaj zdjęcia za pomocą kamery cyfrowej zamocowanej do mikroskopu. Upewnij się, że ustawienia są skonfigurowane tak, aby każda poczwarka była widoczna jako ciemna sylwetka na białym tle.Po obrazowaniu przenieś każdą poczwarkę do oddzielnej probówki typu Eppendorf o pojemności dwóch mililitrów zawierającej jeden mililitr pożywki dla much. Oszacuj wielkość poczwarki jako liczbę pikseli sylwetki poczwarki. Pod stereotypem można również zastosować inne parametry wielkości, takie jak długość lub szerokość.Lekko znieczul muchę za pomocą dwutlenku węgla i ustaw ją, korzystając z chwytaka do skrzydeł – urządzenia ssącego, które wciąga skrzydło między dwa kawałki szkła i trzyma je prostopadle do ciała muchy. Do obrazowania, choć w niniejszym badaniu do obrazowania skrzydeł żywych much użyto chwytaka, skrzydła oraz inne cechy można wypreparować i obrazować za pomocą standardowych narzędzi. Wykonaj zdjęcie skrzydła za pomocą kamery mikroskopowej podłączonej do komputera i odnotuj płeć muchy. Po wykonaniu i zapisaniu obrazu skrzydła oszacuj jego rozmiar, stosując albo minimalny wielobok wypukły obejmujący marginalne punkty orientacyjne jako pomiary liniowe, albo liczbę pikseli sylwetki skrzydła. Przedstawione tutaj poczwarki wykazywały skrajności w rozkładzie wielkości wynikające z manipulacji dietą.Po osiągnięciu przez poczwarkę minimalnej masy niezbędnej do zamknięcia. Przedstawiono również odpowiadające im sylwetki służące do pomiaru wielkości źrenicy. Obrazy skrzydeł tych samych osobników z ekstremalnych krańców rozkładu wielkości są tutaj pokazane obok sylwetki.Służy do szacowania wielkości skrzydeł oraz wyznaczenia zależności skalowania. Parametry opisujące, w jaki sposób wielkość skrzydeł skaluje się wraz z wielkością ciała, pozwalają porównać, jak ogólny kształt współzmienia się z wielkością w różnych grupach. Tutaj przedstawiono dane dla osobników obu płci, które jako larwy były w pełni karmione, głodzone przez jeden dzień lub dwa dni.Choć poszczególne etapy tej procedury są szybkie, w ujęciu całościowym może być ona żmudna. Zazwyczaj przetworzenie około 3 500 much od stadium jaja do imago zajmuje około 350 roboczogodzin. Dzięki praktyce można znacznie skrócić czas manipulacji z muchami, a procedurę tę można wykorzystać do pomiaru innych cech morfologicznych, co pozwala na oszacowanie dodatkowych zależności skalowania morfologicznego.

experimental-manipulation-body-size-to-estimate-morphological-scaling

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Eksperymentalna manipulacja wielkością ciała w celu oszacowania morfologicznych zależności skalowania u Drosophila

Prezentujemy sposób wykorzystania techniki karmienia RNAi do wyciszania genów docelowych oraz oceny fenotypu wielkości ciała u C. elegans. Metoda ta może zostać zastosowana w szeroko zakrojonych badaniach przesiewowych w celu identyfikacji potencjalnych, interesujących komponentów genetycznych, takich jak te zaangażowane w regulację wielkości ciała poprzez sygnalizację DBL-1/TGF-β.

Wykorzystanie strategii karmienia w celu indukowania interferencji RNA do przesiewowej analizy genów zaangażowanych w regulację wielkości ciała u nicienia C. elegans

Obwód żywieniowy u larw Drosophila melanogaster służy prostemu, ale potężnemu modelowi, który pozwala na skorelowanie zmian w tempie karmienia ze zmianami w obwodach nerwowych stomatogastrycznych. Obwód ten składa się z centralnych neuronów serotoninergicznych, które wysyłają projekcje do haczyków ustnych, a także do jelita przedniego.

Analiza funkcjonalna obwodu żerowania larw u Drosophila

Tutaj szczegółowo opisujemy protokoły specjalnie zaprojektowane do monitorowania wad morfogenicznych, które występują podczas wczesnych i późnych faz wydłużania się embrionalnego nicienia Caenorhabditis elegans. Ostatecznie protokoły te mają na celu identyfikację genów, które regulują te fazy i scharakteryzowanie ich zróżnicowanych wymagań wzdłuż przednio-tylnej osi zarodka.

Nowe wskaźniki charakteryzujące wydłużenie embrionalne nicieni Caenorhabditis elegans

Ten artykuł opisuje test behawioralny, który wykorzystuje popęd godowy samców u Drosophila melanogaster do badania motywacji. Korzystając z tej metody, naukowcy mogą wykorzystać zaawansowane techniki neurogenetyczne much, aby odkryć mechanizmy genetyczne, molekularne i komórkowe, które leżą u podstaw tej motywacji.

Pomiar i zmiana popędu godowego u samca Drosophila melanogaster

Tutaj opisujemy metodę zmniejszania wielkości zarodków danio pręgowanego bez zakłócania normalnych procesów rozwojowych. Technika ta umożliwia badanie skalowania wzorca i odporności rozwojowej na zmiany rozmiaru.

Chirurgiczne zmniejszanie rozmiaru danio pręgowanego w celu zbadania skalowania wzorca embrionalnego

Chemikalia zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC) stanowią poważny problem dla organizmów i środowiska naturalnego. Drosophila melanogaster stanowi idealny model do badania efektów EDC in vivo. W tym miejscu przedstawiamy metody badania zaburzeń endokrynologicznych u Drosophila, odnosząc się do wpływu EDC na płodność, płodność, czas rozwoju i długość życia muchy.

Metody badania zaburzeń endokrynologicznych u Drosophila melanogaster

Tutaj przedstawiono protokół implementacji mikroskopii ekspansywnej we wczesnych zarodkach Drosophila w celu uzyskania obrazowania w superrozdzielczości przy użyciu konwencjonalnego laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego.

Wykorzystanie mikroskopii ekspansywnej do fizycznego powiększenia całych zarodków Drosophila w celu obrazowania w superrozdzielczości

Tutaj prezentujemy szybki, tani proces obrazowania w wysokiej rozdzielczości oczu dorosłego Drosophila w celu ilościowego określenia wzorców i wad wzrostu. Opisujemy nasz protokół przygotowania próbek poprzez montaż punktowy, akwizycję obrazu w wysokiej rozdzielczości i analizę obrazu.

Szybki i prosty proces oznaczania ilościowego zewnętrznych struktur dorosłego osobnika Drosophila

Opisujemy metodę fizycznego zwężania do tworzenia mini embrionów z zarodków Xenopus laevis o jednokomórkowej liczbie komórek.

Manipulacja fizyczna w celu generowania mini embrionów Xenopusa

Metody eksperymentalne w inżynierii tkankowej

Poznaj metodę manipulacji dietą w celu zwiększenia zmienności wielkości ciała u Drosophila i szacowania relacji skalowania między rozmiarem ciała a skrzydła. Ta technika pozwala badać ewolucję cech morfologicznych.

Eksperymentalna manipulacja rozmiarem ciała w celu oszacowania morfologicznych zależności skalowania u Drosophila

Przeglądaj więcej filmów