Eksperymentalna manipulacja rozmiarem ciała w celu oszacowania morfologicznych zależności skalowania u Drosophila

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest wykorzystanie manipulacji dostępnością pokarmu w określonych momentach rozwoju w celu uzyskania szerokiego zakresu rozmiarów ciała, co może następnie posłużyć do oszacowania zależności skalowania między cechami morfologicznymi. Najpierw przez trzy dni zbierane są jaja z tej samej populacji much, tworząc trzy kohorty wiekowe. Gdy najstarsza kohorta larw zaczyna przechodzić w stan wędrowny, larwy ze wszystkich kohort są usuwane z pożywki.

Wynikiem tej modyfikacji diety jest zwiększony zakres zmienności wielkości poczwarek. Następnie wykonuje się zdjęcia pupili oraz skrzydeł osobników dorosłych wszystkich jednostek, aby umożliwić oszacowanie morfologicznej relacji skalowania między wielkością ciała a wielkością skrzydeł. Ostatecznie uzyskuje się wyniki pokazujące, w jaki sposób wielkość skrzydeł skaluje się w pełnym zakresie możliwej wielkości ciała, dopasowując do danych liniową regresję typu drugiego.

W niniejszym badaniu wykorzystujemy manipulację dostępem do składników odżywczych w czasie rozwoju, aby eksperymentalnie zwiększyć zmienność wielkości ciała u dorosłych much. Pozwala nam to na oszacowanie zależności skalowania morfologicznego w pełnym zakresie wielkości ciała. Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowych kwestii dotyczących ekspresji i ewolucji skalowania morfologicznego, takich jak identyfikacja bezpośrednich podstaw zmienności parametrów zależności skalowania w grupach biologicznych.

Przenieś populację much do komory kopulacyjnej, a następnie zbieraj jaja co 24 godziny przez trzy dni. W ten sposób, przy użyciu mikroskopu stereoskopowego, utwórz trzy grupy wiekowe. Przenieś partie po 50 jaj z każdej grupy do fiolek zawierających 10 ml standardowej pożywki dla much.

Inkubuj fiolki w temperaturze odpowiedniej dla rozwoju larw. Gdy najstarsza kohorta osiągnie stadium wędrowania, należy zastosować manipulację dietą poprzez usunięcie larw z pożywki. Na tym etapie larwy w najstarszej kohorcie znacznie przekraczają minimalną wagę niezbędną do okluzji i osiągają rozmiar zbliżony do naturalnej maksymalnej wielkości ciała.

Larwy w kohorcie pośredniej przekroczyły minimalną wagę przeżywalności, lecz wytworzą mniejsze osobniki dorosłe niż larwy z najstarszej kohorty. Larwy z najmłodszej kohorty znajdują się bardzo blisko minimalnej wagi przeżywalności, w związku z czym wytworzą bardzo małe osobniki dorosłe. Aby usunąć larwy z pożywki.

Do probówek dodaj około 5 ml 40% roztworu sacharozy, a następnie inkubuj przez 15-20 minut na stole wytrząsowym przy ustawieniu średnim. Po wytrząsaniu usuń pływające larwy z roztworu sacharozy za pomocą cienkiego pędzla i przenieś je zgodnie z kohortami do probówek zawierających zwilżony czop bawełniany w celu utrzymania wilgotności. Inkubuj w pożądanej temperaturze aż do momentu przepocierzenia.

Ułóż poczwarki na szkiełku przedmiotowym stroną brzuszną do góry. Po umieszczeniu poczwarek wykonaj zdjęcia za pomocą kamery cyfrowej zamocowanej do mikroskopu. Upewnij się, że ustawienia są skonfigurowane tak, aby każda poczwarka była widoczna jako ciemna sylwetka na białym tle.

Po obrazowaniu przenieś każdą poczwarkę do oddzielnej probówki typu Eppendorf o pojemności dwóch mililitrów zawierającej jeden mililitr pożywki dla much. Oszacuj wielkość poczwarki jako liczbę pikseli sylwetki poczwarki. Pod stereotypem można również zastosować inne parametry wielkości, takie jak długość lub szerokość.

Lekko znieczul muchę za pomocą dwutlenku węgla i ustaw ją, korzystając z chwytaka do skrzydeł – urządzenia ssącego, które wciąga skrzydło między dwa kawałki szkła i trzyma je prostopadle do ciała muchy. Do obrazowania, choć w niniejszym badaniu do obrazowania skrzydeł żywych much użyto chwytaka, skrzydła oraz inne cechy można wypreparować i obrazować za pomocą standardowych narzędzi. Wykonaj zdjęcie skrzydła za pomocą kamery mikroskopowej podłączonej do komputera i odnotuj płeć muchy. Po wykonaniu i zapisaniu obrazu skrzydła oszacuj jego rozmiar, stosując albo minimalny wielobok wypukły obejmujący marginalne punkty orientacyjne jako pomiary liniowe, albo liczbę pikseli sylwetki skrzydła. Przedstawione tutaj poczwarki wykazywały skrajności w rozkładzie wielkości wynikające z manipulacji dietą.

Po osiągnięciu przez poczwarkę minimalnej masy niezbędnej do zamknięcia. Przedstawiono również odpowiadające im sylwetki służące do pomiaru wielkości źrenicy. Obrazy skrzydeł tych samych osobników z ekstremalnych krańców rozkładu wielkości są tutaj pokazane obok sylwetki.

Służy do szacowania wielkości skrzydeł oraz wyznaczenia zależności skalowania. Parametry opisujące, w jaki sposób wielkość skrzydeł skaluje się wraz z wielkością ciała, pozwalają porównać, jak ogólny kształt współzmienia się z wielkością w różnych grupach. Tutaj przedstawiono dane dla osobników obu płci, które jako larwy były w pełni karmione, głodzone przez jeden dzień lub dwa dni.

Choć poszczególne etapy tej procedury są szybkie, w ujęciu całościowym może być ona żmudna. Zazwyczaj przetworzenie około 3 500 much od stadium jaja do imago zajmuje około 350 roboczogodzin. Dzięki praktyce można znacznie skrócić czas manipulacji z muchami, a procedurę tę można wykorzystać do pomiaru innych cech morfologicznych, co pozwala na oszacowanie dodatkowych zależności skalowania morfologicznego.