Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa do celowanej edycji genów neuronalnych w mózgu myszy

Zabezpiecz znieczuloną mysz w stereotaktycznej ramce.

Zdezynfekuj ogoloną skórę głowy, a następnie wykonaj nacięcie w linii środkowej, aby odsłonić czaszkę.

Osusz czaszkę i nałóż nadtlenek wodoru, aby poprawić widoczność bregma.

Zlokalizuj bregma i lambda, a następnie zidentyfikuj lokalizacje docelowe.

Ostrożnie przewiercić czaszkę w miejscach docelowych.

Podłącz strzykawkę wypełnioną wirusem do instrumentu stereotaktycznego.

Wirus koduje Cas9 i jednoprowadnicowy RNA do edycji genomu w neuronach zakrętu zębatego, wraz z fluorescencyjnym reporterem do znakowania zainfekowanych neuronów.

Opuścić strzykawkę, aby dotrzeć do zakrętu zębatego, a następnie powoli wstrzyknąć wirusa, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie.

Stopniowo podnosić strzykawkę i powtarzać wstrzyknięcie na dodatkowych współrzędnych.

Zrób krótką przerwę, aby zapobiec cofaniu się, a następnie powoli wyjmij igłę.

Powtórz procedurę na przeciwnej półkuli.

Na koniec zszyj nacięcie.

Model jest teraz gotowy do dalszych badań.

Ogolić głowę znieczulonej myszy w celu przygotowania się do miejsca wstrzyknięcia. Skierować 4% izofluranu do stożka nosowego. Następnie umieść mysz w instrumencie stereotaktycznym. Włóż pręt do gryzienia do pyska, aż zęby wpadną do szczeliny przed zabezpieczeniem nauszników.

Upewnij się, że ciało zwierzęcia znajduje się na poduszce grzewczej, a nos znajduje się w stożku nosowym. Następnie potwierdź znieczulenie, szczypiąc stopę. Następnie zastosuj sztuczne łzy, aby nawilżyć oczy. Następnie przetrzyj ogoloną głowę jodonem i lidokainą.

Teraz wykonaj małe nacięcie wzdłuż linii środkowej skóry głowy. Osusz czaszkę wacikiem i nałóż nadtlenek wodoru, aby pomóc uwidocznić bregmę. Za pomocą lunety sekcyjnej zlokalizuj bregmę na czaszce i umieść nad nią wiertło. Ustaw cyfrowe współrzędne stereotaktyczne płaszczyzn x, y i z na 0.

Aby upewnić się, że głowica jest wypoziomowana na rostralnej ogonowej osi y, umieść wiertło na lambda i wypoziomuj głowicę tak, aby współrzędna z była w przybliżeniu równa 0 przy bregma i lambda. Aby upewnić się, że głowica jest wypoziomowana wzdłuż osi x, umieść wiertło w punkcie środkowym między bregmą a lambdą i zmierz współrzędne z w odległości 1 milimetra od punktu środkowego po obu stronach, aby upewnić się, że są równe.

Następnie obniż izofluran do 2% przed umieszczeniem wiertła nad żądanymi współrzędnymi i ostrożnie przewiercić czaszkę. Po wywierceniu wszystkich otworów przymocuj strzykawkę wypełnioną wirusem do instrumentu stereotaktycznego. Wyśrodkuj strzykawkę nad otworem i ustaw współrzędną z na czaszce na 0. Powoli opuścić strzykawkę do najgłębszej głębokości z i rozpocząć wstrzykiwanie z szybkością 0,25 mikrolitra na minutę za pomocą wstrzykiwacza stereotaktycznego.

Po zakończeniu iniekcji na najgłębszej głębokości z, należy odczekać minutę przed podniesieniem jej do następnej współrzędnej i ponownie rozpocząć wstrzykiwanie. Kontynuuj ten wzór, aż wszystkie współrzędne wtrysku z zostaną wstrzyknięte. Po ostatnim wstrzyknięciu należy odczekać dwie minuty przed wyjęciem strzykawki. Następnie wyjmij mysz z instrumentu stereotaktycznego i zszyj skórę głowy. Nałóż lidokainę i krem przeciwbakteryjny na miejsce operacji i podaj leki przeciwbólowe przed przeniesieniem zwierzęcia do podgrzewanej komory rekonwalescencji.