Wizualizacja sieci nerwowych i naczyniowych w zarodku kurczaka

Zacznij od okienkowanego, zapłodnionego jaja kurzego zawierającego zarodek we wczesnym stadium z wyciętą cewą nerwową na poziomie somitów od jednego do siedmiu.

Pobrać cewę nerwową dawcy znakowaną GFP z transgenicznego zarodka kurczaka dopasowanego do etapu i wszczepić go biorcy, zapewniając właściwą orientację anatomiczną.

Usuń nadmiar płynu wokół przeszczepu, aby zwiększyć przyczepność między tkankami dawcy i gospodarza.

Uszczelnij okno przezroczystą taśmą, aby zapobiec odwodnieniu i zanieczyszczeniu.

Wysiaduj jajo, aż zarodek rozwinie się do pożądanego etapu.

Usuń taśmę.

Zidentyfikuj żyłę witelinową na żółtku, która przenosi krew w kierunku zarodka i usuń leżącą nad nią błonę witeliny.

Za pomocą szklanej igły stopniowo wstrzykiwaj lipofilowy barwnik fluorescencyjny do żyły.

Wizualizuj zarodek pod mikroskopem stereofluorescencyjnym.

Wstrzyknięty barwnik wiąże się z komórkami śródbłonka wyściełającymi naczynia krwionośne, uwydatniając sieć naczyniową, podczas gdy cewa nerwowa znakowana GFP umożliwia śledzenie sieci neuronowych.

Gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia procedury szczepienia, ostrożnie przenieś wypreparowaną rurkę nerwową ze szkła zegarka do zarodka gospodarza. Ustaw cewę neuronową we właściwej orientacji. I delikatnie wepchnij eksplant przylegający do wyciętego obszaru. W razie potrzeby użyj mikroskalpela, aby przyciąć eksplant do dokładnej wielkości wyciętego obszaru.

Po ustawieniu się we właściwej pozycji usuń PBS i inny płyn, aby pomóc tkankom dawcy i gospodarza przylegać i ustanowić przeszczep. Pomyślną integrację przeszczepionej cewy nerwowej GFP z gospodarzem kurczaka typu dzikiego można ocenić pod mikroskopem fluorescencyjnym. Uszczelnij całe okno przezroczystą taśmą o szerokości 24 milimetrów, aby zapobiec odwodnieniu i zanieczyszczeniu.

Oznacz zarodek chimeryczny. I zwróć jajo do inkubatora w celu dalszego rozwoju.

W żądanym punkcie czasowym doświadczenia wyjmij jajo z inkubatora. I usuń przezroczystą taśmę, aby uzyskać dostęp do zarodka. Po wyświetleniu zlokalizuj dostępną żyłę na żółtku, upewniając się, że przepływ krwi jest skierowany w stronę zarodka.

Wybrać punkt rozgałęzienia na jednej z żył witelowych jako miejsce wstrzyknięcia. Za pomocą pęsety usuń błonę witelinową powyżej wybranego punktu wstrzyknięcia, rozrywając w przeciwnych kierunkach. Następnie dostosuj średnicę wyciągniętej szklanej igły do wielkości żyły.

Załaduj igłę 5 do 10 mikrolitrów roztworu DiI. Szybko wbij igłę do żyły. I równomiernie rurką ustną, aby DiI powoli łączyło się z przepływem krwi bez tworzenia skrzepu. Powodzenie wstrzyknięcia DiI można ocenić, oglądając zarodek pod mikroskopem fluorescencyjnym.