$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Weźmy naczynie do obrazowania ze szklanym dnem zawierające embrionalne neurony korowe myszy.
Umieść naczynie w komorze środowiskowej mikroskopu z kontrastem różnicowym interferencyjnym lub DIC, aby utrzymać żywotność komórek podczas obrazowania.
Mikroskopia DIC rozdziela spolaryzowane światło na dwie wiązki, które przechodzą przez próbkę.
Zmiany współczynnika załamania światła w próbce wprowadzają przesunięcia fazowe między tymi wiązkami.
Kiedy wiązki łączą się ponownie, ich interferencja generuje obraz o wysokim kontraście, dzięki czemu widoczne są drobniejsze struktury komórkowe.
Zidentyfikuj neurony z nierozgałęzionymi aksonami i użyj obrazowania poklatkowego, aby uwidocznić rozgałęzienia aksonów.
Leczenie netryną-1, zewnątrzkomórkową wskazówką prowadzącą, która wiąże się z receptorami aksonalnymi i wyzwala zlokalizowaną egzocytozę.
Pęcherzyki egzocytarne dostarczają składniki błony do miejsc, podczas gdy cytoszkielet jest reorganizowany w celu wsparcia ekspansji błony.
Pod mikroskopem zmiany te pojawiają się jako małe wypukłości, oznaczające początek rozgałęzień aksonów.
Z biegiem czasu wypukłości te rozwijają się w dojrzałe gałęzie aksonów, ilustrujące dynamiczny proces rozwoju neuronów.
Po dwóch dniach in vitro umieść naczynie do obrazowania ze szklanym dnem zawierające nietransfekowane neurony we wstępnie ogrzanej, wilgotnej komorze środowiskowej. Wykorzystaj mikroskop wyposażony w apochromat planarny 60x, soczewkę obiektywową DIC 1,4 NA, oraz kondensor o dużej aperturze numerycznej, aby uzyskać najlepszą jakość i rozdzielczość obrazu. Następnie, przy oświetleniu światłem przechodzącym, dostosuj płaszczyznę ogniskowej, aby znaleźć neurony przez okulary.
W przypadku obrazowania DIC rozgałęzień aksonów właściwa konfiguracja chłodniejszego oświetlenia będzie integralną częścią optymalizacji obrazu i ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wyników możliwych do analizy. Następnie, gdy interesujące Cię neurony znajdują się w polu widzenia, użyj funkcji akwizycji wielu obszarów w oprogramowaniu do obrazowania, aby znaleźć i zapisać lokalizacje XYZ co najmniej sześciu komórek. Teraz dodaj do końcowego stężenia 250 nanogramów na mililitr netryny-1 lub innego czynnika zainteresowania, aby stymulować komórki, i naciśnij Rozpocznij akwizycję wieloobszarową.
Sekwencyjnie rejestruj obrazy w każdej pozycji co 20 sekund przez 24 godziny, zatrzymując akwizycję i ponownie ustawiając ostrość w razie potrzeby. W oprogramowaniu do obrazowania przejrzyj obrazy, wybierając opcję Aplikacja, Przejrzyj dane wielowymiarowe i otwórz żądany plik. Zidentyfikuj stabilne gałęzie aksonów, które tworzą się podczas sesji obrazowania. Użyj narzędzia do śledzenia regionu, aby zmierzyć stabilną gałąź aksonu od podstawy aksonu do końcówki.