Obrazowanie szybkich stanów przejściowych wapnia w zakończeniach nerwowych myszy za pomocą mikroskopii konfokalnej

Zacznij od komory eksperymentalnej pokrytej elastomerem silikonowym, zawierającej zabezpieczony mięsień myszy umieszczony pod mikroskopem konfokalnym.

Mięsień jest zanurzony w roztworze fizjologicznym zawierającym inhibitory, które blokują skurcze mięśni.

Kikut nerwowy oznaczony fluorescencyjnym barwnikiem wapniowym umieszcza się wewnątrz elektrody ssącej, która jest podłączona do stymulatora elektrycznego.

W połączeniu nerwowo-mięśniowym nerw obwodowy jest połączony z mięśniem.

Zastosuj bodziec elektryczny do nerwu za pomocą elektrody. Powoduje to szybki napływ jonów wapnia, które wiążą się z wewnątrzkomórkowym barwnikiem wapnia.

Oświetl połączenie nerwowo-mięśniowe, aby wzbudzić barwnik wapniowy, powodując jego fluoryzację.

Następnie uchwyć obrazy o wysokiej rozdzielczości, aby zarejestrować szybkie stany przejściowe wapnia w zakończeniach nerwów obwodowych.

Wybierz obszar zainteresowania i zmierz intensywność fluorescencji.

Szybki wzrost intensywności fluorescencji wskazuje na napływ wapnia do zakończeń nerwów obwodowych, podczas gdy spadek odzwierciedla klirens wapnia.

Napełnij system perfuzyjny roztworem Ringera zawierającym 10 mikromolową D-tubokurarynę i włącz perfuzyjną pompę ssącą, aby rozpocząć perfuzję. W oprogramowaniu Laser Scanning Confocal Microscope (LSCM) wybierz tryb elektrofizjologii i akwizycji, aby ustawić parametry obrazowania. W ustawieniach menu Zadanie wybierz ustawienia wyzwalacza, aby wyzwolić stymulator za pomocą impulsu synchronizacji mikroskopu i ustaw pole Trigger Out on Frame Field na kanał OUT 1.

Przełącz tryb skanowania na xyt z częstotliwością skanowania 1,400 Hz. Współczynnik powiększenia powinien wynosić 6,1 przy całkowicie otwartym otworze. Upewnij się, że włączony jest dwukierunkowy tryb x z sekwencyjnym transpassingiem. Następnie ustaw minimalny czas tworzenia klatki na 52 milisekundy i zbieraj klatki w surowym filmie na 20 klatkach. Ustaw długość fali wzbudzenia lasera argonowego na 488 nanometrów, z 8% mocy wyjściowej.

Po ustawieniu parametrów naciśnij przycisk Live Mode, aby uzyskać podgląd na żywo zakończeń nerwowych załadowanych barwnikiem. W trybie na żywo wyszukaj region zainteresowania lub ROI, aby uzyskać najlepszą ostrość, a następnie przesuń opóźnienie stymulatora o 2 milisekundy mniej w stosunku do poprzedniej wartości. Uruchom oprogramowanie do akwizycji danych, aby uzyskać 26 sekwencji, przesuwając każdą sekwencję o dwie milisekundy od poprzedniej.