Name: Modelowanie embrionalnych komórek macierzystych za pomocą Bio Flip Chip (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T13:21:11.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: Poznaj metodę pozycjonowania komórek za pomocą bio flip chip, umożliwiającą precyzyjne umieszczanie komórek na podłożu. Technika ta wspiera badania nad sygnalizacją komórkową w biologii komórki i inżynierii biomedycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez grant NIH EB007278.

Przygotowanie BFC
BFC są wytwarzane poprzez formowanie polidimetylosiloksanu (PDMS) na 4" matrycy krzemowej (Si).
Przygotowanie płytki matki
<ol>
<li>Rozpocznij od odwodnienia wafli krzemowych (Si) przez 30 min w temperaturze 130°C. </li>
<li>Umieść wafel na powlekarce rotacyjnej, nanieś SU8-2050 (Microchem) na wafel, zwiększ prędkość obrotową od 300 rpm/s do 3000-4000 rpm i wiruj przez 30 s, aby uzyskać wysokość struktur odpowiednio 40-30 mm. </li>
<li>Po wirowaniu umieść wafel na płycie grzejnej o temperaturze 65°C, natychmiast zwiększ temperaturę do 95°C na 5-6 min, a następnie obniż ją do 65°C. </li>
<li>Naświetl wafle dawką UV o wartości 200 mJ/cm2 w alignerze kontaktowym, używając maski ciemnego pola. </li>
<li>Umieść wafle na płycie grzejnej o temperaturze 65°C, natychmiast zwiększ temperaturę do 95°C na 4-5 min, a następnie obniż ją do 65°C. </li>
<li>Wywołaj wafle w octanie PM i izopropanolu. </li>
<li>Przeprowadź silanizację wafli przez 30 min, używając heksametylodisiloksanu (Shin-Etsu MicroSi) lub (tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktylo)-1-trichlorosilanu (t2492-KG, UCT Specialities, Bristol, PA), aby zapobiec przyleganiu PDMS do krzemowego wafla wzorcowego.</li>
</ol>
Formowanie chipów
<ol>
<li>Wymieszać PDMS (Dow Corning, Sylgard 184) w stosunku 10:1, wylać go na matrycę z wafla krzemowego (~15 g na wafel) i pozostawić do utwardzenia przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Oddzielić utwardzony PDMS od wafla krzemowego i wyciąć poszczególne chipy za pomocą żyletki.</li>
<li>Przykleić każdy chip do wyciętego fragmentu szkiełka przedmiotowego o wymiarach 1x1 cm, aby ułatwić manipulację.</li>
</ol>
Przygotowanie BFC do użycia
<ol>
<li>Namocz BFC przez noc w PBS, aby zapobiec absorpcji pożywki przez PDMS podczas eksperymentu.</li>
<li>Osusz chipy za pomocą chusteczki Kimwipe (Kimtech Science).</li>
<li>Nanieś kroplę 7,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (~200 mL) na wzorowaną powierzchnię BFC, a następnie rozprowadź BSA i usuń pęcherzyki powietrza z dołków za pomocą końcówki do pipety.</li>
<li>Pozostaw BSA na powierzchni BFC na co najmniej 0,5 godziny. W celu zapobiegania wysychaniu i tworzeniu się skorupy zaleca się mieszanie BSA co 15 min.</li>
<li>Aby dopasować BFC do naczynia TCPS o wymiarach 35x10 mm (Falcon, 35-3001), przetnij krawędzie naczynia TCPS do połowy wysokości, tak aby żabki biurowe ¾" (Office Depot) mogły zostać założone na krawędź naczynia w celu zaciśnięcia chipu i naczynia razem.</li>
<li>Wytnij uszczelkę dystansową (w kształcie ramki o zewnętrznej krawędzi 20´20 mm, wewnętrznej krawędzi 15´15 mm i grubości 250-500 mm) z arkusza PDMS (Silicone Specialty Products) lub innego silikonu, a następnie przymocuj ją do naczynia za pomocą pęsety.</li>
</ol>
Wzorowanie komórek za pomocą BFC
<ol>
<li>Zesterylizować pod UV przez 1 minutę szalkę, uszczelkę, chip powlekany BSA oraz 2 żabki biurowe. </li>
<li>Odssać BSA i przepłukać BFC dwukrotnie 200 µL PBS. </li>
<li>Jeśli jest to wymagane dla danej linii komórkowej, dodać żelatynę do wyciętej szalki TCPS. W przeciwnym razie zwilżyć powierzchnię TCPS niewielką ilością medium przed nałożeniem jej na chip (patrz poniżej). Zapobiega to powstawaniu pęcherzyków powietrza w komorze. </li>
<li>Po odessaniu PBS, nanieść pipetą 200 µL zawiesiny komórek (~1×106 komórek/mL) na powierzchnię BFC. Pozostawić komórki do osiadania na 5-10 min. </li>
<li>Przechylić BFC w jeden róg pod kątem ~15° i powoli odessać zawiesinę komórek pipetą 200 µL. Następnie ułożyć BFC płasko i dodać 100 µL PBS lub medium bez dodatków w przeciwległy róg BFC. W ten sposób przepłukać BFC dodatkowo 2-4 razy, w zależności od potrzeb, aby usunąć wszystkie komórki z obszarów między studzienkami. </li>
<li>Nanieść pipetą 200 µL medium na powierzchnię chipa. Odessać żelatynę/medium z TCPS. Następnie odwrócić wcześniej zwilżoną szalkę i powoli wsunąć BFC do góry, do wnętrza szalki. </li>
<li>Zastosować po jednej żabce biurowej z dwóch stron komory, aby ją uszczelnić. Usunąć metalowe uchwyty z żabek, aby szalka pozostała w poziomie po obróceniu. </li>
<li>Na koniec szybko obrócić cały układ, unikając zbędnych ruchów, i umieścić go w inkubatorze.</li>
</ol>

<ol><li>Rosenthal, A., Macdonald, A., Voldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Patterning+Chip+for+Controlling+the+Stem+Cell+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Cell Patterning Chip for Controlling the Stem Cell Microenvironment.</a> Biomaterials. 28, 3208-3216 (2007).</li>
</ol>

Chociaż przedstawiony tutaj protokół i film opisują wykorzystanie BFC 1 do wzorowania embrionalnych komórek macierzystych myszy (mESCs), BFC mogą być stosowane do wzorowania praktycznie każdego interesującego nas typu komórek. Jedyną zmianą, jaką może być konieczne wprowadzenie, jest zmiana rozmiaru mikrootworów. W naszym doświadczeniu, aby użyć BFC do wzorowania pojedynczych komórek innego typu, najlepiej sprawdza się średnica i wysokość mikrootworu większe o 10 mikronów od średnicy nieprzylegającej komórki.<...

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Krzemowa forma matrycowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szalki do hodowli tkankowej</td><td>Falcon BD</td><td>35-3001</td><td>35 mm</td></tr><tr><td>Klamry do papieru 3/4&quot;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>heksametylodisiloksan</td><td>Shin-Etsu MicroSi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nowy element</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU8-2050</td><td></td></tr><tr><td>Octan PM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td>7.5% albumina surowicy bydlęcej</td></tr></tbody></table>

wzorowanie embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem bio flip chip

Patterning of Embryonic Stem Cells Using the Bio Flip Chip

Interakcje międzykomórkowe, obejmujące sygnalizację dyfuzyjną oraz kontakt międzykomórkowy (sygnalizację jukstakrynną), odgrywają istotną rolę w licznych procesach biologicznych, takich jak wzrost guza, różnicowanie komórek macierzystych oraz ich samoodnawianie. Obecnie istnieje szereg metod modulowania sygnalizacji komórkowej in vitro. Jedną z metod regulacji całkowitej ilości sygnałów dyfuzyjnych jest zmiana gęstości wysiewu komórek podczas hodowli. Ze względu na losowy charakter wysiewu prowadzi to do znacznych różnic w rzeczywistym rozmieszczeniu komórek i ilości kontaktów międzykomórkowych, a także nie pozwala na precyzyjne określenie środowiska lokalnego. Bardziej specyficznym podejściem do modulowania sygnalizacji komórkowej jest stosowanie inhibitorów molekularnych lub metod genetycznych w celu wyciszenia konkretnych białek sygnałowych, jednak obie te metody najlepiej sprawdzają się w manipulowaniu niewielkimi liczbami cząsteczek. W niniejszej pracy prezentujemy nowe podejście do modulowania sygnalizacji międzykomórkowej, które modyfikuje lokalne środowisko skupiska komórek poprzez rozmieszczanie różnej liczby komórek w wybranych miejscach na podłożu. Metoda ta stanowi uzupełniający sposób kontrolowania lokalnej sygnalizacji dyfuzyjnej i jukstakrynnej między komórkami. Nasza metoda wykorzystuje Bio Flip Chip (BFC), mikrofabrykowany chip silikonowy zawierający od setek do tysięcy mikrootworów, z których każdy jest dostosowany do pomieszczenia pojedynczej komórki lub niewielkiej liczby komórek. Wypełniamy chip komórkami, po prostu pipetując je na matrycę otworów, a następnie wypłukując komórki, które nie osiadły w otworach. Następnie chip zostaje odwrócony na podłożu, w wyniku czego komórki wypadają z otworów na podłoże, zachowując swój wzór rozmieszczenia. Po przytwierdzeniu się komórek chip można usunąć (lub pozostawić). To podejście do wzorowania komórek jest wyjątkowe, ponieważ: 1) nie zmienia chemii podłoża, co pozwala komórkom na proliferację i migrację; 2) umożliwia wzorowanie na dowolnym podłożu, w tym na polistyrenie do hodowli tkanek, szkle, Matrigelu, a nawet na warstwach komórek karmiących; oraz 3) jest kompatybilne z tradycyjnym drukiem mikrokontaktowym, co pozwala na tworzenie wysepek macierzy zewnątrzkomórkowej z komórkami umieszczonymi wewnątrz tych wysepek. W tym filmie demonstrujemy wzorowanie mysich embrionalnych komórek macierzystych na polistyrenie do hodowli tkanek przy użyciu BFC.

Przedstawiamy prostą metodę rozmieszczania komórek w wybranych miejscach na podłożu. Metoda ta polega na tworzeniu wzorów komórkowych poprzez odwrócenie krzemowego chipa zawierającego wypełnione komórkami mikrownęki i dociśnięcie go do podłoża. Metoda ta stanowi nowy sposób modulowania sygnalizacji dyfuzyjnej oraz jukstakrynnej między komórkami.

Wzorowanie embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem Bio Flip Chip

Oddziaływania międzykomórkowe, obejmujące sygnały dyfuzyjne oraz kontakt międzykomórkowy (sygnalizacja jukstakrynna), odgrywają istotną rolę w licznych procesach biologicznych, takich jak...

Nazywam się Nickel Mital. Jestem doktorantem w laboratorium Bowmana. Dzisiaj opowiem o urządzeniu opracowanym przez dwóch byłych studentów naszego laboratorium, które nazywa się bio flip chip.Urządzenie to umożliwia dostarczenie komórek na podłożu i w konfiguracji wybranej przez eksperymentatora. Samo urządzenie, którego egzemplarz mamy tutaj, jest bardzo proste. Składa się ono zasadniczo z niewielkich studzienek w kawałku silikonu.Każda studnia jest zazwyczaj zaprojektowana tak, aby pomieścić tylko jedną komórkę, ale w razie potrzeby możemy oczywiście zwiększyć ich rozmiar. Urządzenie jest wykonane w taki sposób, aby studnie znajdowały się w takiej samej konfiguracji, w jakiej komórki ostatecznie znajdą się na podłożu. Samo urządzenie jest zatem wytwarzane przy użyciu miękkiej litografii.W szczególności wykorzystujemy PDMS, czyli polidimetylosiloksan, który formujemy na bazie wafla krzemowego. Mamy tutaj jeden z nich. Sam wafel formierski jest wytwarzany przy użyciu standardowej fotolitografii w celu naniesienia wzoru z fotorezystu SU-8, który jest nanoszony odśrodkowo na wafel krzemowy.Podsumowując, komórki przenosi się na wybrany podłoże poprzez wypełnienie nimi otworów w bio flip chipie. Następnie przykładamy chip do wybranego podłoża, którym często jest polistyren do hodowli tkankowej. Na koniec odwracamy cały układ, co pozwala komórkom wypaść z otworów bezpośrednio na podłoże.Jestem Stephanie Flavin. Jestem studentką prowadzącą badania w laboratorium Goldmana, a dzisiaj zaprezentuję, jak użyć bio flip chipa do wzorowania komórek w dniu poprzedzającym eksperyment. Chcemy przeprowadzić badanie nad wzorowaniem.Wykonamy wiązanie plazmowe PDMS do szkiełka przedmiotowego o wymiarach jednej na jedną uncję. Następnie chip zostanie namoczony przez noc, stroną z kanałami skierowaną w dół, w roztworze PBS. Wytniemy również uszczelki do wykorzystania w eksperymencie z wzorcowaniem oraz przygotujemy klipsy biurowe, które również zostaną użyte.Nanieś 200 µL BSA na powierzchnię każdego chipa. Poruszaj końcówką pipety na powierzchni chipa, aby usunąć pęcherzyki powietrza i pozwolić roztworowi BSA wypełnić dołki. Pozostaw chipy pod wyciągiem przez jedną godzinę w świetle UV, traktując je jak zwykłe komory.Po jednej godzinie odessać roztwór BSA z chipów i przemyć każdy chip 200 µl PBS, a następnie nanieść 200 µl zawiesiny komórek w gęstości 10⁶ komórek/ml. Po odczekaniu od 5 do 10 minut, aby komórki opadły do studni, przepłukać powierzchnię chipu PBS. Przechylić chip w jeden róg pod kątem około 15 stopni i powoli odpipetować roztwór komórek z dolnego rogu chipu.Ustawić chip w poziomie i powoli dodać 50 µL PBS do górnego narożnika. Powtarzać etap płukania tyle razy, ile będzie to konieczne. Po wypłukaniu xls z powierzchni chipa, dodać około 50 µL pożywki do wewnętrznej uszczelki naczynia.Nanieś pożywkę na górną część każdego chipa. Następnie odwróć szalkę, przechyl ją i opuść na powierzchnię chipa, zaczynając od jednego z rogów. Następnie dociśnij szalkę do chipa, aby zapobiec powstaniu pęcherzyków powietrza między szalką a chipem.Do każdej krawędzi płytki przymocuj klamry biurowe, aby ją unieruchomić. Zdejmij uchwyty z każdej klamry, aby po odwróceniu płytka spoczywała płasko na naczyniu. Przenieś płytkę do inkubatora i szybko ją odwróć, unikając wszelkich niepotrzebnych ruchów.

patterning-of-embryonic-stem-cells-using-the-bio-flip-chip

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wzorcowanie komórek macierzystych zarodkowych za pomocą układu Bio Flip Chip

Inżynieria w skali mikro w biologii komórki

Opisujemy metody fotowybielania, w tym Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) oraz Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP), służące do monitorowania dynamiki białek chromatyny w embrionalnych komórkach macierzystych (ES). Dynamika białek chromatyny, uznawana za jeden ze sposobów badania plastyczności chromatyny, jest zwiększona w komórkach pluripotencjalnych.

Analizy fotoblaknięcia (FRAP i FLIP) do pomiaru dynamiki białek chromatyny w żywych embrionalnych komórkach macierzystych

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) mają wrodzoną zdolność do różnicowania się i samoorganizacji w odrębne wzorce tkankowe; chociaż wymaga to prezentacji przestrzennych gradientów środowiskowych. Przedstawiamy mikrowzorce szablonowe jako prostą i solidną metodę generowania gradientów biochemicznych i mechanicznych w celu kontrolowania wzorców różnicowania hPSC.

Szablonowe mikrowzorce ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do badania przestrzennej organizacji losów różnicowania

Tutaj opisujemy metody wykonywania ChIP-Seq i CARIP-Seq, w tym przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania nowej generacji, do generowania globalnych epigenomicznych i związanych z chromatyną map RNA w komórkach ES.

CARIP-Seq i ChIP-Seq: Metody identyfikacji RNA związanych z chromatyną i interakcji białko-DNA w embrionalnych komórkach macierzystych

Ten protokół krok po kroku zawiera szczegółowy opis konfiguracji eksperymentu i analizy danych do oceny reakcji zapalnych w hiPSC-EC oraz analizy adhezji leukocytów w przepływie fizjologicznym.

Test mikroprzepływowy do oceny adhezji leukocytów do indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek śródbłonka pochodzących z komórek macierzystych (hiPSC-EC)

Przedstawiona tutaj metoda wykorzystuje mikrowzorce wraz z obrazowaniem ilościowym, aby ujawnić organizację przestrzenną w kulturach ssaków. Technika ta jest łatwa do wdrożenia w standardowym laboratorium biologii komórki i oferuje elastyczny system do badania wzorców in vitro.

Mapowanie wyłaniającej się organizacji przestrzennej komórek ssaków za pomocą mikrowzorców i obrazowania ilościowego

Ligandy macierzy zewnątrzkomórkowej mogą być wzorowane na hydrożelach poliakrylamidowych, aby umożliwić hodowlę ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w zamkniętych koloniach na podatnych podłożach. Metodę tę można połączyć z mikroskopią sił trakcyjnych i testami biochemicznymi w celu zbadania wzajemnych zależności między geometrią tkanki, siłami generowanymi przez komórkę i specyfikacją losu.

Modelowanie geometrii kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych na podatnych podłożach w celu kontrolowania mechaniki na poziomie tkankowym

Tutaj zaprezentowaliśmy metodę sekwencjonowania mRNA z multipleksowaną pojedynczą komórką do profilowania ekspresji genów w tkankach embrionalnych myszy. Metoda sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki oparta na kropelkach (scRNA-Seq) w połączeniu ze strategiami multipleksowania może profilować pojedyncze komórki z wielu próbek jednocześnie, co znacznie obniża koszty odczynników i minimalizuje eksperymentalne efekty wsadowe.

Multipleksowana analiza sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki komórek embrionalnych myszy

Bariera krew-mózg (BBB) to wielokomórkowa jednostka nerwowo-naczyniowa ściśle regulująca homeostazę mózgu. Łącząc ludzkie iPSC i technologie narządów na chipie, stworzyliśmy spersonalizowany chip BBB, odpowiedni do modelowania chorób i przewidywania penetracji leków do OUN. Opisano szczegółowy protokół generowania i działania chipa BBB.

Generacja ludzkiego chipa bariery krew-mózg opartego na iPSC

Ten artykuł przedstawia metody hodowli miocytów serca o różnych kształtach, które reprezentują różne patologie, oraz sortowania tych przylegających miocytów serca na podstawie ich morfologii na poziomie pojedynczej komórki. Proponowana platforma zapewnia nowatorskie podejście do wysokoprzepustowych badań przesiewowych i badań przesiewowych leków w kierunku różnych rodzajów niewydolności serca.

Podejście do badania transkryptomiki zależnej od kształtu na poziomie pojedynczej komórki

Tutaj prezentujemy protokół do mikrowzorcowania komórek w rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą adhezji programowanej przez DNA. Protokół ten wykorzystuje laboratoryjną platformę fotolitograficzną do tworzenia wzorów oligonukleotydów DNA na szkiełku szkiełkowym, a następnie znakuje błony komórkowe dostępnymi na rynku komplementarnymi oligonukleotydami. Hybrydyzacja oligonukleotydów powoduje zaprogramowaną adhezję komórek.

Proste, niedrogie i modułowe modelowanie komórek za pomocą DNA

Poznaj metodę pozycjonowania komórek za pomocą bio flip chip, umożliwiającą precyzyjne umieszczanie komórek na podłożu. Technika ta wspiera badania nad sygnalizacją komórkową w biologii komórki i inżynierii biomedycznej.

Wzorowanie embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem Bio Flip Chip

Przeglądaj więcej filmów