Name: Modelowanie embrionalnych komórek macierzystych za pomocą Bio Flip Chip (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T13:21:11.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: Poznaj metodę pozycjonowania komórek za pomocą bio flip chip, umożliwiającą precyzyjne umieszczanie komórek na podłożu. Technika ta wspiera badania nad sygnalizacją komórkową w biologii komórki i inżynierii biomedycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez grant NIH EB007278.

Przygotowanie BFC
BFC są wytwarzane poprzez formowanie polidimetylosiloksanu (PDMS) na 4" matrycy krzemowej (Si).
Przygotowanie płytki matki
<ol>
<li>Rozpocznij od odwodnienia wafli krzemowych (Si) przez 30 min w temperaturze 130°C. </li>
<li>Umieść wafel na powlekarce rotacyjnej, nanieś SU8-2050 (Microchem) na wafel, zwiększ prędkość obrotową od 300 rpm/s do 3000-4000 rpm i wiruj przez 30 s, aby uzyskać wysokość struktur odpowiednio 40-30 mm. </li>
<li>Po wirowaniu umieść wafel na płycie grzejnej o temperaturze 65°C, natychmiast zwiększ temperaturę do 95°C na 5-6 min, a następnie obniż ją do 65°C. </li>
<li>Naświetl wafle dawką UV o wartości 200 mJ/cm2 w alignerze kontaktowym, używając maski ciemnego pola. </li>
<li>Umieść wafle na płycie grzejnej o temperaturze 65°C, natychmiast zwiększ temperaturę do 95°C na 4-5 min, a następnie obniż ją do 65°C. </li>
<li>Wywołaj wafle w octanie PM i izopropanolu. </li>
<li>Przeprowadź silanizację wafli przez 30 min, używając heksametylodisiloksanu (Shin-Etsu MicroSi) lub (tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktylo)-1-trichlorosilanu (t2492-KG, UCT Specialities, Bristol, PA), aby zapobiec przyleganiu PDMS do krzemowego wafla wzorcowego.</li>
</ol>
Formowanie chipów
<ol>
<li>Wymieszać PDMS (Dow Corning, Sylgard 184) w stosunku 10:1, wylać go na matrycę z wafla krzemowego (~15 g na wafel) i pozostawić do utwardzenia przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Oddzielić utwardzony PDMS od wafla krzemowego i wyciąć poszczególne chipy za pomocą żyletki.</li>
<li>Przykleić każdy chip do wyciętego fragmentu szkiełka przedmiotowego o wymiarach 1x1 cm, aby ułatwić manipulację.</li>
</ol>
Przygotowanie BFC do użycia
<ol>
<li>Namocz BFC przez noc w PBS, aby zapobiec absorpcji pożywki przez PDMS podczas eksperymentu.</li>
<li>Osusz chipy za pomocą chusteczki Kimwipe (Kimtech Science).</li>
<li>Nanieś kroplę 7,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (~200 mL) na wzorowaną powierzchnię BFC, a następnie rozprowadź BSA i usuń pęcherzyki powietrza z dołków za pomocą końcówki do pipety.</li>
<li>Pozostaw BSA na powierzchni BFC na co najmniej 0,5 godziny. W celu zapobiegania wysychaniu i tworzeniu się skorupy zaleca się mieszanie BSA co 15 min.</li>
<li>Aby dopasować BFC do naczynia TCPS o wymiarach 35x10 mm (Falcon, 35-3001), przetnij krawędzie naczynia TCPS do połowy wysokości, tak aby żabki biurowe ¾" (Office Depot) mogły zostać założone na krawędź naczynia w celu zaciśnięcia chipu i naczynia razem.</li>
<li>Wytnij uszczelkę dystansową (w kształcie ramki o zewnętrznej krawędzi 20´20 mm, wewnętrznej krawędzi 15´15 mm i grubości 250-500 mm) z arkusza PDMS (Silicone Specialty Products) lub innego silikonu, a następnie przymocuj ją do naczynia za pomocą pęsety.</li>
</ol>
Wzorowanie komórek za pomocą BFC
<ol>
<li>Zesterylizować pod UV przez 1 minutę szalkę, uszczelkę, chip powlekany BSA oraz 2 żabki biurowe. </li>
<li>Odssać BSA i przepłukać BFC dwukrotnie 200 µL PBS. </li>
<li>Jeśli jest to wymagane dla danej linii komórkowej, dodać żelatynę do wyciętej szalki TCPS. W przeciwnym razie zwilżyć powierzchnię TCPS niewielką ilością medium przed nałożeniem jej na chip (patrz poniżej). Zapobiega to powstawaniu pęcherzyków powietrza w komorze. </li>
<li>Po odessaniu PBS, nanieść pipetą 200 µL zawiesiny komórek (~1×106 komórek/mL) na powierzchnię BFC. Pozostawić komórki do osiadania na 5-10 min. </li>
<li>Przechylić BFC w jeden róg pod kątem ~15° i powoli odessać zawiesinę komórek pipetą 200 µL. Następnie ułożyć BFC płasko i dodać 100 µL PBS lub medium bez dodatków w przeciwległy róg BFC. W ten sposób przepłukać BFC dodatkowo 2-4 razy, w zależności od potrzeb, aby usunąć wszystkie komórki z obszarów między studzienkami. </li>
<li>Nanieść pipetą 200 µL medium na powierzchnię chipa. Odessać żelatynę/medium z TCPS. Następnie odwrócić wcześniej zwilżoną szalkę i powoli wsunąć BFC do góry, do wnętrza szalki. </li>
<li>Zastosować po jednej żabce biurowej z dwóch stron komory, aby ją uszczelnić. Usunąć metalowe uchwyty z żabek, aby szalka pozostała w poziomie po obróceniu. </li>
<li>Na koniec szybko obrócić cały układ, unikając zbędnych ruchów, i umieścić go w inkubatorze.</li>
</ol>

<ol><li>Rosenthal, A., Macdonald, A., Voldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Patterning+Chip+for+Controlling+the+Stem+Cell+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Cell Patterning Chip for Controlling the Stem Cell Microenvironment.</a> Biomaterials. 28, 3208-3216 (2007).</li>
</ol>

Chociaż przedstawiony tutaj protokół i film opisują wykorzystanie BFC 1 do wzorowania embrionalnych komórek macierzystych myszy (mESCs), BFC mogą być stosowane do wzorowania praktycznie każdego interesującego nas typu komórek. Jedyną zmianą, jaką może być konieczne wprowadzenie, jest zmiana rozmiaru mikrootworów. W naszym doświadczeniu, aby użyć BFC do wzorowania pojedynczych komórek innego typu, najlepiej sprawdza się średnica i wysokość mikrootworu większe o 10 mikronów od średnicy nieprzylegającej komórki.<...

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Krzemowa forma matrycowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szalki do hodowli tkankowej</td><td>Falcon BD</td><td>35-3001</td><td>35 mm</td></tr><tr><td>Klamry do papieru 3/4&quot;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>heksametylodisiloksan</td><td>Shin-Etsu MicroSi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nowy element</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU8-2050</td><td></td></tr><tr><td>Octan PM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td>7.5% albumina surowicy bydlęcej</td></tr></tbody></table>

wzorowanie embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem bio flip chip

Patterning of Embryonic Stem Cells Using the Bio Flip Chip

Interakcje międzykomórkowe, obejmujące sygnalizację dyfuzyjną oraz kontakt międzykomórkowy (sygnalizację jukstakrynną), odgrywają istotną rolę w licznych procesach biologicznych, takich jak wzrost guza, różnicowanie komórek macierzystych oraz ich samoodnawianie. Obecnie istnieje szereg metod modulowania sygnalizacji komórkowej in vitro. Jedną z metod regulacji całkowitej ilości sygnałów dyfuzyjnych jest zmiana gęstości wysiewu komórek podczas hodowli. Ze względu na losowy charakter wysiewu prowadzi to do znacznych różnic w rzeczywistym rozmieszczeniu komórek i ilości kontaktów międzykomórkowych, a także nie pozwala na precyzyjne określenie środowiska lokalnego. Bardziej specyficznym podejściem do modulowania sygnalizacji komórkowej jest stosowanie inhibitorów molekularnych lub metod genetycznych w celu wyciszenia konkretnych białek sygnałowych, jednak obie te metody najlepiej sprawdzają się w manipulowaniu niewielkimi liczbami cząsteczek. W niniejszej pracy prezentujemy nowe podejście do modulowania sygnalizacji międzykomórkowej, które modyfikuje lokalne środowisko skupiska komórek poprzez rozmieszczanie różnej liczby komórek w wybranych miejscach na podłożu. Metoda ta stanowi uzupełniający sposób kontrolowania lokalnej sygnalizacji dyfuzyjnej i jukstakrynnej między komórkami. Nasza metoda wykorzystuje Bio Flip Chip (BFC), mikrofabrykowany chip silikonowy zawierający od setek do tysięcy mikrootworów, z których każdy jest dostosowany do pomieszczenia pojedynczej komórki lub niewielkiej liczby komórek. Wypełniamy chip komórkami, po prostu pipetując je na matrycę otworów, a następnie wypłukując komórki, które nie osiadły w otworach. Następnie chip zostaje odwrócony na podłożu, w wyniku czego komórki wypadają z otworów na podłoże, zachowując swój wzór rozmieszczenia. Po przytwierdzeniu się komórek chip można usunąć (lub pozostawić). To podejście do wzorowania komórek jest wyjątkowe, ponieważ: 1) nie zmienia chemii podłoża, co pozwala komórkom na proliferację i migrację; 2) umożliwia wzorowanie na dowolnym podłożu, w tym na polistyrenie do hodowli tkanek, szkle, Matrigelu, a nawet na warstwach komórek karmiących; oraz 3) jest kompatybilne z tradycyjnym drukiem mikrokontaktowym, co pozwala na tworzenie wysepek macierzy zewnątrzkomórkowej z komórkami umieszczonymi wewnątrz tych wysepek. W tym filmie demonstrujemy wzorowanie mysich embrionalnych komórek macierzystych na polistyrenie do hodowli tkanek przy użyciu BFC.

Przedstawiamy prostą metodę rozmieszczania komórek w wybranych miejscach na podłożu. Metoda ta polega na tworzeniu wzorów komórkowych poprzez odwrócenie krzemowego chipa zawierającego wypełnione komórkami mikrownęki i dociśnięcie go do podłoża. Metoda ta stanowi nowy sposób modulowania sygnalizacji dyfuzyjnej oraz jukstakrynnej między komórkami.

Wzorowanie embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem Bio Flip Chip

Oddziaływania międzykomórkowe, obejmujące sygnały dyfuzyjne oraz kontakt międzykomórkowy (sygnalizacja jukstakrynna), odgrywają istotną rolę w licznych procesach biologicznych, takich jak...

Nazywam się Nickel Mital. Jestem doktorantem w laboratorium Bowmana. Dzisiaj opowiem o urządzeniu opracowanym przez dwóch byłych studentów naszego laboratorium, które nazywa się bio flip chip.Urządzenie to umożliwia dostarczenie komórek na podłożu i w konfiguracji wybranej przez eksperymentatora. Samo urządzenie, którego egzemplarz mamy tutaj, jest bardzo proste. Składa się ono zasadniczo z niewielkich studzienek w kawałku silikonu.Każda studnia jest zazwyczaj zaprojektowana tak, aby pomieścić tylko jedną komórkę, ale w razie potrzeby możemy oczywiście zwiększyć ich rozmiar. Urządzenie jest wykonane w taki sposób, aby studnie znajdowały się w takiej samej konfiguracji, w jakiej komórki ostatecznie znajdą się na podłożu. Samo urządzenie jest zatem wytwarzane przy użyciu miękkiej litografii.W szczególności wykorzystujemy PDMS, czyli polidimetylosiloksan, który formujemy na bazie wafla krzemowego. Mamy tutaj jeden z nich. Sam wafel formierski jest wytwarzany przy użyciu standardowej fotolitografii w celu naniesienia wzoru z fotorezystu SU-8, który jest nanoszony odśrodkowo na wafel krzemowy.Podsumowując, komórki przenosi się na wybrany podłoże poprzez wypełnienie nimi otworów w bio fl

patterning-of-embryonic-stem-cells-using-the-bio-flip-chip

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wzorcowanie komórek macierzystych zarodkowych za pomocą układu Bio Flip Chip

Inżynieria w skali mikro w biologii komórki

Adhezyjne mikrowzory normalizujące architekturę komórkową mogą być wykorzystane do zwiększenia czułości w wykrywaniu efektów działania leków, poprawy powtarzalności oraz uproszczenia zautomatyzowanego pozyskiwania i analizy obrazów. Taka technologia przyniesie korzyści w testach przesiewowych leków/siRNA, które są przeprowadzane na konwencjonalnych podłożach do hodowli komórkowej i w konsekwencji obarczone są nadmierną zmiennością międzykomórkową.

Udoskonalona wizualizacja i analiza ilościowa efektów działania leków z wykorzystaniem komórek rozmieszczonych w mikrowzorach

Opisujemy metody fotowybielania, w tym Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) oraz Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP), służące do monitorowania dynamiki białek chromatyny w embrionalnych komórkach macierzystych (ES). Dynamika białek chromatyny, uznawana za jeden ze sposobów badania plastyczności chromatyny, jest zwiększona w komórkach pluripotencjalnych.

Analizy fotoblaknięcia (FRAP i FLIP) do pomiaru dynamiki białek chromatyny w żywych embrionalnych komórkach macierzystych

Ten film pokazuje tworzenie chipa bariery krew-mózg przy użyciu komórek prekursorowych pochodzących z iPSC. Polega na wysiewaniu nerwowych komórek progenitorowych i komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu w oddzielnych kanałach z porowatą błoną. Poprzez przepływ pożywki różnicującej komórki śródbłonka tworzą ścisłe połączenia przypominające naczynia krwionośne, a komórki nerwowe dojrzewają do różnych typów komórek mózgowych, tworząc funkcjonalną barierę krew-mózg na chipie.

Generowanie chipa bariery krew-mózg przy użyciu komórek prekursorowych pochodzących z iPSC

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) mają wrodzoną zdolność do różnicowania się i samoorganizacji w odrębne wzorce tkankowe; chociaż wymaga to prezentacji przestrzennych gradientów środowiskowych. Przedstawiamy mikrowzorce szablonowe jako prostą i solidną metodę generowania gradientów biochemicznych i mechanicznych w celu kontrolowania wzorców różnicowania hPSC.

Szablonowe mikrowzorce ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do badania przestrzennej organizacji losów różnicowania

Przedstawiona tutaj metoda wykorzystuje mikrowzorce wraz z obrazowaniem ilościowym, aby ujawnić organizację przestrzenną w kulturach ssaków. Technika ta jest łatwa do wdrożenia w standardowym laboratorium biologii komórki i oferuje elastyczny system do badania wzorców in vitro.

Mapowanie wyłaniającej się organizacji przestrzennej komórek ssaków za pomocą mikrowzorców i obrazowania ilościowego

Ligandy macierzy zewnątrzkomórkowej mogą być wzorowane na hydrożelach poliakrylamidowych, aby umożliwić hodowlę ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w zamkniętych koloniach na podatnych podłożach. Metodę tę można połączyć z mikroskopią sił trakcyjnych i testami biochemicznymi w celu zbadania wzajemnych zależności między geometrią tkanki, siłami generowanymi przez komórkę i specyfikacją losu.

Modelowanie geometrii kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych na podatnych podłożach w celu kontrolowania mechaniki na poziomie tkankowym

Bariera krew-mózg (BBB) to wielokomórkowa jednostka nerwowo-naczyniowa ściśle regulująca homeostazę mózgu. Łącząc ludzkie iPSC i technologie narządów na chipie, stworzyliśmy spersonalizowany chip BBB, odpowiedni do modelowania chorób i przewidywania penetracji leków do OUN. Opisano szczegółowy protokół generowania i działania chipa BBB.

Generacja ludzkiego chipa bariery krew-mózg opartego na iPSC

Ten artykuł przedstawia metody hodowli miocytów serca o różnych kształtach, które reprezentują różne patologie, oraz sortowania tych przylegających miocytów serca na podstawie ich morfologii na poziomie pojedynczej komórki. Proponowana platforma zapewnia nowatorskie podejście do wysokoprzepustowych badań przesiewowych i badań przesiewowych leków w kierunku różnych rodzajów niewydolności serca.

Podejście do badania transkryptomiki zależnej od kształtu na poziomie pojedynczej komórki

Tutaj prezentujemy protokół do mikrowzorcowania komórek w rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą adhezji programowanej przez DNA. Protokół ten wykorzystuje laboratoryjną platformę fotolitograficzną do tworzenia wzorów oligonukleotydów DNA na szkiełku szkiełkowym, a następnie znakuje błony komórkowe dostępnymi na rynku komplementarnymi oligonukleotydami. Hybrydyzacja oligonukleotydów powoduje zaprogramowaną adhezję komórek.

Proste, niedrogie i modułowe modelowanie komórek za pomocą DNA

Protokół hodowli i manipulacji tkanką embrionalną myszy na chipie mikroprzepływowym jest dostarczony. Stosując impulsy modulatorów szlaku, system ten może być wykorzystany do zewnętrznego sterowania oscylacjami sygnałowymi w celu funkcjonalnego badania somitogenezy myszy.

Podejście mikrofluidyczne do funkcjonalnego badania oscylacji sygnalizacyjnych rządzących somitogenezą

Poznaj metodę pozycjonowania komórek za pomocą bio flip chip, umożliwiającą precyzyjne umieszczanie komórek na podłożu. Technika ta wspiera badania nad sygnalizacją komórkową w biologii komórki i inżynierii biomedycznej.

Wzorowanie embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem Bio Flip Chip

Przeglądaj więcej filmów