Wzorowanie embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem Bio Flip Chip
1 października 2007
Przedstawiamy prostą metodę rozmieszczania komórek w wybranych miejscach na podłożu. Metoda ta polega na tworzeniu wzorów komórkowych poprzez odwrócenie krzemowego chipa zawierającego wypełnione komórkami mikrownęki i dociśnięcie go do podłoża. Metoda ta stanowi nowy sposób modulowania sygnalizacji dyfuzyjnej oraz jukstakrynnej między komórkami.
Nazywam się nickel Mital. Jestem doktorantem w laboratorium Bowmana. Dzisiaj opowiem o urządzeniu opracowanym przez dwóch byłych studentów w naszym laboratorium, które nazywa się bio flip chip.
Urządzenie to umożliwia dostarczenie komórek na podłożu oraz w konfiguracji wybranej przez eksperymentatora. Samo urządzenie, którego egzemplarz mamy tutaj, jest bardzo proste. Składa się ono w zasadzie z niewielkich otworów w kawałku silikonu.
Każda studzienka jest zazwyczaj zaprojektowana tak, aby pomieścić tylko jedną komórkę, jednak w razie potrzeby możemy oczywiście zwiększyć ich rozmiar. Urządzenie jest wykonane w taki sposób, aby studzienki znajdowały się w takim samym układzie, w jakim komórki ostatecznie zostaną rozmieszczone na podłożu. Samo urządzenie jest zatem wytwarzane przy użyciu miękkiej litografii fotograficznej.
W szczególności wykorzystujemy PDMS, czyli polidimetylosiloksan, który formujemy na bazie wafla krzemowego. Mamy tutaj jeden z takich egzemplarzy. Sam wafelek służący jako forma jest wykonany przy użyciu standardowej fotolitografii w celu nadania wzoru fotorezyście SU-8, która zostaje naniesiona na wafel krzemowy metodą wirowania.
Podsumowując, komórki są przenoszone na wybrany substrat poprzez wypełnienie otworów w bio flip chipie tymi komórkami. Następnie przykładamy chip do wybranego substratu, którym często jest polistyren do hodowli tkanek. Na koniec obracamy całość, co pozwala komórkom wypaść z otworów bezpośrednio na substrat.
Nazywam się Stephanie Flavin. Jestem studentką prowadzącą badania w laboratorium Goldmana i dzisiaj zaprezentuję sposób wykorzystania bio flip chipa do przygotowania wzorów komórkowych dzień przed właściwym eksperymentem. Chcemy przeprowadzić badanie nad wzorcowaniem.
Przeprowadzimy wiązanie plazmowe PDMS z szkiełkiem przedmiotowym o wymiarach jednej na jedną uncję. Następnie chip zostanie namoczony przez noc, stroną z rowkami skierowaną w dół, w roztworze PBS. Wytniemy również uszczelki do wykorzystania w eksperymencie z wzorowaniem oraz przygotujemy zaciski sprężynowe, które również zostaną użyte.
Nanieś 200 µL BSA na powierzchnię każdego chipa. Poruszaj powierzchnią chipa końcówką pipety, aby usunąć pęcherzyki powietrza i pozwolić roztworowi BSA wypełnić dołki. Pozostaw chipy pod wyciągiem przez jedną godzinę, naświetlając komórki światłem UV w sposób standardowy.
Po jednej godzinie odessać roztwór BSA z chipów i przemyć każdy chip 200 µL PBS, a następnie nanieść 200 µL zawiesiny komórek w zagęszczeniu 10⁶ komórek/mL. Po odczekaniu od 5 do 10 minut, aby komórki opadły do studzienek, przepłukać powierzchnię chipu PBS. Przechylić chip w jeden róg pod kątem około 15 stopni i powoli odpipetować roztwór komórek z dolnego rogu chipu.
Ustawić chip w pozycji poziomej i powoli dodać 50 µL PBS do górnego narożnika. Powtórzyć etap płukania tyle razy, ile będzie to konieczne. Po wypłukaniu xls z powierzchni chipa, dodać około 50 µL pożywki do wewnętrznej uszczelki naczynia.
Nanieś pożywkę na górną część każdego chipa. Następnie odwróć szalkę, przechyl ją i opuść na powierzchnię chipa, zaczynając od jednego z rogów. Następnie dociśnij szalkę do chipa, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza między szalką a chipem.
Do każdej strony chipa przymocuj żabki biurowe, aby go unieruchomić. Usuń uchwyty z każdej żabki, aby po obróceniu chipa spoczywał on płasko na szalce. Przenieś chip do inkubatora i szybko go odwróć, unikając wszelkich zbędnych ruchów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia nową metodę pozycjonowania komórek na podłożu z wykorzystaniem urządzenia zwanego bio flip chip. Poprzez odwrócenie silikonowego chipa z wypełnionymi komórkami mikrowyciekami na podłoże, badacze mogą skutecznie kontrolować rozmieszczenie komórek, co usprawnia modulację sygnalizacji międzykomórkowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Neuronauka
- Bioinżynieria
Wstęp
- Pozycjonowanie komórek ma kluczowe znaczenie dla badania oddziaływań międzykomórkowych.
- Obecne metody mogą cechować się niewystarczającą precyzją w rozmieszczeniu komórek.
- Bio flip chip stanowi prostym i skutecznym rozwiązaniem.
- Technika ta może wpływać zarówno na sygnalizację dyfuzyjną, jak i jukstakryną.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody rozmieszczania komórek na podłożach.
- Pogłębienie zrozumienia mechanizmów sygnalizacji komórkowej.
- Dostarczenie narzędzia dla badaczy z różnych dziedzin biologii.
Zastosowane metody
- Projektowanie i wykonanie bio flip chipa.
- Wypełnianie mikrowycisków komórkami.
- Odwrócenie chipa na wybrany podłoże.
- Obserwacja i analiza rozmieszczenia oraz sygnalizacji komórkowej.
Główne wyniki
- Skuteczne rozmieszczenie komórek w docelowych lokalizacjach.
- Ulepszona modulacja sygnalizacji komórkowej.
- Wykazanie łatwości obsługi urządzenia.
- Potencjalne zastosowania w różnych układach eksperymentalnych.
Wnioski
- Bio flip chip to innowacyjne narzędzie do rozmieszczania komórek.
- Metoda ta może mieć znaczący wpływ na badania nad sygnalizacją komórkową.
- Przyszłe badania mogą rozszerzyć zastosowanie tej techniki na szerszy zakres aplikacji.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Precyzyjna kontrola przestrzenna populacji komórek umożliwia mechanistyczną analizę dyfuzyjnych i jukstakrynnych szlaków sygnalizacyjnych, które są kluczowe dla walidacji celów w modelach chorób opartych na komórkach macierzystych. Bio Flip Chip zapewnia niezależną od podłoża i zachowującą charakterystykę chemiczną metodę wzorcowania określonych mikrośrodowisk komórkowych, wspierając powtarzalny rozwój testów do screeningu fenotypowego. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkryć poprzez redukcję zmienności w kontaktach międzykomórkowych oraz ekspozycji na czynniki parakrynne, co tym samym poprawia ciągłość translacyjną z modeli in vitro do walidacji przedklinicznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne Etapy Odkrywania i Walidacja Celu
- Wartość naukowa: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących wpływu lokalnej gęstości komórek i ich rozmieszczenia przestrzennego na szlaki różnicowania i samoodnawiania komórek macierzystych.
- Wartość operacyjna: Eliminuje zmienność stochastyczną wynikającą z losowego wysiewu, zapewniając spójne sygnały jukstakrynne i parakrynne w powtórzeniach doświadczalnych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez izolację wkładu sygnałów zależnych od kontaktu w porównaniu z sygnałami rozpuszczalnymi w badaniach nad zaangażowaniem celu.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na generowanie mierzalnych, przestrzennie zdefiniowanych macierzy komórkowych kompatybilnych z obrazowaniem wysokotreściowym (high-content imaging) i odczytami multipleksowymi.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzację testów interakcji międzykomórkowych na polistyrenie do hodowli tkankowych, szkle, Matrigelu i warstwach komórek wspierających (feeder layers) bez zmiany chemii podłoża.
- Skalowalność: Kompatybilność z drukiem mikrokontaktowym w celu tworzenia wzorów macierzy zewnątrzkomórkowej, co pozwala na kombinatoryczną kontrolę sygnałów adhezyjnych i sygnalizacyjnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Wzorowanie embrionalnych komórek macierzystych w zdefiniowanych niszach w celu modelowania szlaków sygnalizacji rozwojowej istotnych dla wad wrodzonych i medycyny regeneracyjnej.
- Modelowanie przedkliniczne: Ułatwia analizę zależności dawka-odpowiedź morfogenów lub środków terapeutycznych w przestrzennie kontrolowanych mikrośrodowiskach, zwiększając istotność fizjologiczną.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Redukuje liczbę wyników fałszywie dodatnich podczas identyfikacji wiodących kandydatów poprzez minimalizację szumu wynikającego z niekontrolowanej agregacji komórek lub zmiennej częstotliwości kontaktów.
Integracja potoków i przepływów pracy
Bio Flip Chip integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, umożliwiając powtarzalne wzorowanie komórek macierzystych przed ekspozycją na związki chemiczne, co wspiera przesiewy oparte na hipotezach oraz badania mechanistyczne w fazie optymalizacji wiodących związków.
- Biologia odkrywcza: Badanie, w jaki sposób określona organizacja przestrzenna embrionalnych komórek macierzystych moduluje specyfikację linii komórkowych oraz aktywność szlaków sygnałowych.
- Screening: Dostarczenie standaryzowanych, powtarzalnych substratów komórkowych do oceny wpływu związków na sygnalizację kontaktową i dyfuzyjną.
- Analityka: Umożliwienie ilościowego mapowania przestrzennego ekspresji markerów, proliferacji i apoptozy jako zmiennych zależnych w ukierunkowanych współkulturach.
- Badania translacyjne: Modelowanie ludzkich kaskad sygnalizacji rozwojowej w systemach o kontrolowanej przestrzeni w celu wsparcia przedklinicznego wyboru celów terapeutycznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Funkcjonowanie jako modułowa platforma wzorcowania, możliwa do adaptacji do wielu typów komórek, substratów i konfiguracji macierzy zewnątrzkomórkowej w różnych projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez redukcję szumu biologicznego wynikającego z niekontrolowanych interakcji międzykomórkowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność analizy dzięki precyzyjnemu, zdefiniowanemu przez użytkownika rozmieszczeniu komórek, niezależnemu od zmienności techniki wysiewu.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność podejmowania decyzji go/no-go poprzez zwiększenie stosunku sygnału do szumu w przesiewach fenotypowych ukierunkowanych na komunikację międzykomórkową.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację modulatorów szlaków jukstakrynnych (np. Notch, Wnt) z uwzględnieniem ryzyka w obszarach chorób związanych z komórkami macierzystymi.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu litografii miękkiej oraz pracy z PDMS w celu wykonania lub pozyskania chipów.
- Procedura zależy od dostępu do sprzętu do wiązania plazmowego oraz urządzenia do obróbki UV/ozonem w celu przygotowania podłoża.
- Konieczne jest zastosowanie ustandaryzowanych protokołów przygotowania i płukania komórek, aby zapewnić efektywne ładowanie i uwalnianie z dołków.
- Adaptacja do macierzy 3D lub systemów mikroprzepływowych może wymagać optymalizacji czasu odwracania oraz energii powierzchniowej.
- Ograniczenie praktyczne: stopień wypełnienia dołków musi zostać określony empirycznie dla każdego typu i rozmiaru komórek, aby uniknąć ładowania wielu komórek do dołków zaprojektowanych dla pojedynczej komórki.
