Obrazowanie in vivo odpowiedzi neuronów zwojowych układu nerwowego za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej

Zacznij od znieczulonej myszy z chirurgicznie odsłoniętym ganglionem kolankowatym, skupiskiem neuronów obwodowych przetwarzających smak.

Neurony te wyrażają GCaMP, wskaźnik wapnia, który fluoryzuje po związaniu wapnia.

Usuń płyn pokrywający ganglion, aby uzyskać wyraźną wizualizację.

Umieść mysz na podkładce chłonnej pod mikroskopem i zlokalizuj ganglion kolankowaty, korzystając z anatomicznych punktów orientacyjnych.

Używając odpowiedniego filtra na zakresie epifluorescencji, wykryj zieloną fluorescencję z neuronów eksprymujących GCaMP.

Następnie włóż igłę dozującą podłączoną do rurki do podawania degustacji do ust myszy i podaj degustator.

Degustator stymuluje komórki receptorów smaku, uwalniając ATP, który wiąże się z receptorami neuronów zwojowych, wywołując napływ wapnia.

Te jony wapnia wiążą się z GCaMPs, indukując emisję fluorescencji.

Dopasuj kamerę do pola widzenia mikroskopu i zsynchronizuj nagrywanie wideo z dostarczaniem degustacji, aby uchwycić aktywność neuronalną w czasie rzeczywistym poprzez zmiany fluorescencji.

Aby uruchomić panel degustacyjny, użyj ssania, aby usunąć płyn znad kolankowatego i umieść mysz na podkładce chłonnej pod mikroskopem preparacyjnym. Użyj otworu pozostawionego w pęcherzu, otworu w kości skroniowej i siódmego nerwu, aby zlokalizować zwój kolankowaty. I użyj filtra FITC/GFP na zakresie epifluorescencji, aby sprawdzić, czy nie ma poszczególnych neuronów kolankowatych z ekspresją GCaMP. Umieść igłę dozującą dla jednej linii degustacyjnej mocno w pysku zwierzęcia. Zsynchronizuj rozpoczęcie nagrywania wideo z rozpoczęciem prezentacji degustacji, obserwując transmisję na żywo w poszukiwaniu odpowiedzi.