Name: Ekspansja ludzkich limfocytów T γδ krwi obwodowej za pomocą zoledronianu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Poznaj metodę ekspansji limfocytów T γδ z krwi obwodowej przy użyciu zoledronianu i IL-2. Technika ta umożliwia uzyskanie komórek do autologicznej immunoterapii przeciwnowotworowej w ciągu 14 dni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Izolacja PBMC
<ol>
	<li>Pobrać krew (7,5-8,0 ml) do probówki BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube z heparyną sodową. Probówka zawiera antykoagulant w postaci heparyny sodowej oraz płyn gęstościowy Ficoll-Hypaque, a także poliestrową barierę żelową, która rozdziela oba płyny. Wirować próbkę krwi w temperaturze pokojowej (18°C do 25°C) w rotorze poziomym (z koszyczkami odchylanymi) przez 20 min przy 1800 x g. Wyłączyć hamulec wirówki.</li>
	<li>Po wirowaniu powstają następujące warstwy (patrząc od góry do dołu): a) plazma – b) mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMC) i płytki krwi – c) roztwór gęstościowy – d) żel poliestrowy – e) granulocyty – f) erytrocyty (Rys. 1).</li>
	<li> zebrać część warstwy plazmy, pozostawiając 5 do 10 mm plazmy nad interfazą, tak aby nie zaburzyć warstwy komórek. Plazma może zostać wykorzystana do hodowli (sekcja 2.5).</li>
	<li>Pobrać pipetą wzbogaconą frakcję (PBMC) z interfazy i przenieść ją do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Przepłukać PBMC za pomocą 10 ml soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS), odwracając probówkę 5 razy, a następnie wirować przez 5 min przy 400 x g.</li>
	<li>Powtórzyć etapy płukania dwukrotnie, a następnie resuspender osad komórkowy w 5 ml PBS. Określić liczbę komórek. Zazwyczaj z 1 ml krwi pełnej odzyskuje się 1,3 x106 komórek.</li>
	<li>Określić częstość występowania i fenotyp limfocytów γδ T w PBMC za pomocą cytometrii przepływowej (sekcja 3) (Rys. 2).</li>
</ol>
2. Ekspansja limfocytów T γδ
<ol>
	<li>Wiruj zawiesiny komórkowe w 15 ml probówkach stożkowych przez 5 min przy 400 x g. g w temperaturze pokojowej, a następnie odrzucić nadsączniki.</li>
	<li>Przygotować pożywkę hodowlaną (CM), dodając ludzką interleukinę 2 (IL-2) oraz zoledronian (Zometa) do stężeń końcowych 1000 IU/ml i 5 μModpowiednio. ALyS203 (Cell Science &amp; pożywki z Technology Institute lub OpTmizer (Invitrogen) wspierają dobrą ekspansję limfocytów T γδ (więcej informacji w referencjach 6 i 9). Zometa jest dostarczany w formie płynnej (fiolka 4 mg/5 ml). Aby przygotować 5 μM roztwór, dodać 50 μl Zomety do 30 ml pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Resuspenduj osad komórkowy w pożywce hodowlanej i dostosuj stężenie do 1x106 komórek/ml</li>
	<li>Odpipetować 1 ml CM zawierającego 1x106 komórki do każdego dołka płytki 24-dołkowej. W przypadku hodowli na dużą skalę komórki można wysiać w zagęszczeniu 0,5 x 106 komórek/cm2 zależnie od powierzchni dołka płytki, szalki lub kolby.</li>
	<li>Dodać osocze autologiczne (rozdział 1.3), pulę surowic ludzkich grupy AB lub FCS, tak aby stanowiły one około 10% objętości hodowli (100 μl dla każdej studni płytki 24-dołkowej). Płytki należy umieścić w nawilżonej 37°C, 5% CO22 inkubator przez 24–48 h.</li>
	<li>Utrzymuj kulturę przy gęstości komórek wynoszącej 0,5–2 x 106 komórek/ml. Co 2-3 dni dodawać świeżą pożywkę zawierającą wyłącznie ludzką IL-2 (1000 IU/ml) (bez Zomety) i w razie potrzeby przenosić hodowane komórki do nowych dołków lub kolb, zależnie od stopnia proliferacji komórek (Ryc. 3). Do pożywki należy dodać osocze lub surowicę w taki sposób, aby stężenie surowicy utrzymało się na poziomie co najmniej 1%.</li>
	<li>Zebrać komórki w 12. lub 14. dniu i określić częstość występowania, fenotyp oraz funkcje limfocytów γδ T za pomocą cytometrii przepływowej (patrz poniżej).</li>
</ol>
3. Analiza fenotypowa metodą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Przenieś 200 μl próbek zawierających 2 x 105 komórek do probówek do sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS).</li>
	<li>Dodaj 2 ml zimnego PBS i wiruj przez 5 min przy 400 x g. Następnie resuspenduj osady w 50 μl buforu FACS (PBS + 1% FCS + 0,1% azotku sodu). Do próbek dodaj po 5 μl każdego z przeciwciał (przeciwciała monoklonalne wymieniono w Tabeli 1).</li>
	<li>Inkubuj w ciemności na lodzie przez 20 min.</li>
	<li>Do każdej próbki dodaj 2 ml buforu FACS, a następnie wymieszaj w wortexie. Wirować próbki przez 5 min przy 400 x g w temperaturze 4°C. Ostrożnie odlej nadsącz.</li>
	<li>Resuspenduj komórki w 300 μl buforu FACS i wymieszaj w wortexie. Próbki przeanalizuj za pomocą cytometru przepływowego (Rys. 2).</li>
</ol>
4. Test produkcji IFN-γ10
<ol>
	<li>Dzień przed analizą przygotować komórki stymulujące, hodując przez noc 3-5 x105 komórek Daudi/ml w pożywce RPMI 1640 z dodatkiem 10% FCS (RPMI-10) oraz Zomety (5 μM) (dalej określanych jako Z-Daudi).</li>
	<li>Zebrać komórki Z-Daudi i resuspender w RPMI-10 do stężenia 2x106 komórek/ml. Do każdego dołka płytki 96-dołkowej o okrągłym dnie dodać 100 μl komórek Z-Daudi (2x105).</li>
	<li>Przygotować limfocyty γδ T w stężeniu 2x106 komórek/ml w RPMI-10 zawierającym Brefeldynę A w stężeniu 20 μg/ml. Przenieść 100 μl zawiesiny limfocytów γδ T (2x105) do każdego dołka zawierającego komórki Z-Daudi lub do dołków kontrolnych (100 μl samego RPMI-10 lub RPMI-10 z 20 ng/ml mirystynianu 12 i octanu 13 forbolu [PMA] oraz 2 μg/ml jonomycyny).</li>
	<li>Wymieszać, pipetując zawiesinę kilkakrotnie w górę i w dół. Inkubować przez 4 hr w inkubatorze w temperaturze 37°C i 5% CO2.</li>
	<li>Wirować płytkę przez 5 min przy 400 x g w temperaturze 4°C, a następnie resuspender osady w 200 μl zimnego PBS.</li>
	<li>Przenieść próbki do probówek do FACS. Dodać 4 ml zimnego PBS i wirować probówki przez 5 min przy 400 x g w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Resuspender osady w 50 μl buforu FACS z przeciwciałem anty-TCRVγ9 sprzężonym z FITC (5 μl) oraz przeciwciałem mAb anty-CD3 sprzężonym z PE/Cy5 (2,5 μl). Inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Dodać 100 μl odczynnika 1 IntraPrep i inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej. Do każdej probówki dodać 4 ml PBS i wirować przez 5 min przy 400 x g w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć nadsącz poprzez aspirację i dodać 100 μl odczynnika 2 IntraPrep. Inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej bez wytrząsania.</li>
	<li>Do probówki z badaniem dodać 5 μl przeciwciała mAb anty-IFN-γ sprzężonego z PE. Inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Do każdej probówki dodać 4 ml PBS i wirować przez 5 min przy 400 x g w temperaturze pokojowej. Usunąć nadsącz poprzez aspirację i resuspender osad komórkowy w 0,5 ml buforu FACS.</li>
	<li>Przeanalizować komórki za pomocą cytometru przepływowego. Wyznaczyć bramkę dla komórek CD3+ TCRVγ9+ i zbadać ekspresję IFN-γ (Rys. 4).</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
Ważne jest określenie procentowego udziału limfocytów γδ T w PBMC w momencie rozpoczynania hodowli. Jak pokazano na Ryc. 2 A, odsetek limfocytów γδ T CD3+TCRVγ9+ w PBMC wynosił 1,6% w dniu 0. Dominującymi populacjami były fenotypy naiwne CD27+CD45RA+ lub fenotypy pamięci centralnej CD27+CD45RA-. Po efektywnej stymulacji limfocyty γδ T tworzyły klastry w dniach 3–5 (Ryc. 3 A i B). W przypadku opóźnienia tworzenia klastrów, wzrost innych typów komórek, takich jak limfocyty αβ T CD4+ lub CD8+ albo komórki NK, mógł zdominować wzrost limfocytów γδ T (Ryc. 3 C i D). Po 14 dniach hodowli, w udanych hodowlach limfocytów γδ T, ich częstość wzrosła do ponad 93,8% hodowanych komórek (Ryc. 2 E). Hodowane limfocyty γδ T wykazały zwiększoną ekspresję NKG2D i CD69 (Ryc. 2 G i H). Prezentowały one fenotyp pamięci efektorowej CD27-CD45RA- (Ryc. 2 F). Funkcje limfocytów γδ T oceniano pod kątem produkcji cytokin i cytotoksyczności. Barwienie wewnątrzkomórkowe IFN-γ wykazało, że limfocyty γδ T produkowały IFN-γ w odpowiedzi na traktowanie PMA/ionomycyną lub w kontakcie z komórkami Z-Daudi, w których po traktowaniu zoledronianem nagromadził się IPP (Ryc. 4). Wyniki te wskazują, że zoledronian może efektywnie stymulować i powiększać pulę funkcjonalnych limfocytów γδ T.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>probówka</td>
			<td>FITC</td>
			<td>PE</td>
			<td>ECD</td>
			<td>PE/Cy5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>CD3</td>
			<td>CD19</td>
			<td>CD45</td>
			<td>CD14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>CD3</td>
			<td>TCRαβ</td>
			<td>CD4</td>
			<td>CD8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>CD3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CD56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>TCR Vγ9</td>
			<td>TCRαβ</td>
			<td>CD45</td>
			<td>CD3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>TCR Vγ9</td>
			<td>NKG2D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>TCR Vγ9</td>
			<td>CD69</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>TCR Vγ9</td>
			<td>mysie IgG1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>TCR Vγ9</td>
			<td></td>
			<td>CD45RA</td>
			<td>CD27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>TCR Vγ9</td>
			<td></td>
			<td>mysi IgG1</td>
			<td>mysi IgG1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Przeciwciała monoklonalne użyte do wielobarwnego barwienia limfocytów γδ T. Przykład analizy fenotypowej limfocytów γδ T przeprowadzonej w naszym laboratorium przedstawiono na Rys. 2.
<img alt="Schemat separacji osocza z gradientem gęstości w probówce do wirowania; pokazuje warstwy PBMC i komórki krwi." src="/files/ftp_upload/3182/3182fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Separacja PBMC. Krew (7,5-8,0 ml) pobiera się do probówki BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube z heparyną sodową i bezpośrednio wiruje przez 20 min przy 1800 × g. Po wirowaniu powstają następujące warstwy (licząc od góry): a) osocze – b) PBMC i płytki krwi – c) roztwór gęstościowy – d) żel poliestrowy – e) granulocyty – f) erytrocyty.
<img alt="Analiza cytometrii przepływowej; ekspresja TCR Vγ9, CD3; ocena CD45RA, CD27; histogramy NKG2D, CD69." src="/files/ftp_upload/3182/3182fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Typowy fenotyp powierzchniowy limfocytów γδ T. PBMC stymulowano zoledronianem i IL-2 przez 14 dni. Komórki barwiono przeciwciałami anty-TCR Vγ9 znakowanymi FITC oraz anty-CD3 znakowanymi PE/Cy5 w celu monitorowania ekspansji limfocytów γδ T (A i E). Limfocyty γδ T zidentyfikowano na podstawie ekspresji TCRVγ9, a następnie badano ich ekspresję CD27 i CD45RA (B i F), NKG2D (C i G) lub CD69 (D i H).
<img alt="Etapy hodowli komórkowej pod mikroskopem; progresja wzrostu w serii obrazów time-lapse." src="/files/ftp_upload/3182/3182fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Reprezentatywne hodowle limfocytów γδ T. PBMC stymulowano IL-2 (1000 IU/ml) i zoledronianem (5 μM). Przedstawiono reprezentatywne pola widzenia (odwrócony mikroskop IX71 [Olympus] x 200). W 3. dniu (A) oraz 5. dniu (B) można zaobserwować klastry i agregaty limfocytów γδ T, co świadczy o ich pomyślnej ekspansji. W przeciwieństwie do tego, nie zaobserwowano klastrów ani agregatów w przypadkach, gdy wzrost limfocytów γδ T był niewystarczający (C i D).
<img alt="Schemat cytometrii przepływowej; ekspresja TCR Vγ9 vs IFN-γ; aktywacja komórek PMA/ionomycin, Z-Daudi." src="/files/ftp_upload/3182/3182fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Produkcja IFN-γ. Komórki T γδ inkubowano przez 4 hr tylko z RPMI-10 (A), z PMA/ionomycin (B) lub z Z-Daudi (C). Najpierw zabarwiono ekspresję powierzchniową TCRVγ9, a następnie zbadano produkcję IFN-γ za pomocą wewnątrzkomórkowego barwienia IFN-γ.
<img alt="Wykres wzrostu hodowli komórkowej; procent i liczba komórek γδT w zależności od dni hodowli; wykres analizy danych." src="/files/ftp_upload/3182/3182fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Kinetyka hodowli komórek γδ T. (A) Bezwzględna liczba hodowanych komórek, (B) procent komórek γδ T oraz (C) bezwzględna liczba komórek γδ T w wskazanych punktach czasowych.

<ol><li>Bonneville, M., O'Brien, R. L., Born, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3+T+cell+effector+functions%3A+a+blend+of+innate+programming+and+acquired+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">γ T cell effector functions: a blend of innate programming and acquired plasticity.</a> Nat Rev Immunol. 10, 467-478 (2010).</li>
<li>Hintz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+%28E%29-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl+pyrophosphate+as+a+major+activator+for+human+%CE%B3%CE%B4+T+cells+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate as a major activator for human γδ T cells in Escherichia coli.</a> FEBS Lett. 509, 317-322 (2001).</li>
<li>Gober, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+T+cell+receptor+%CE%B3%CE%B4+cells+recognize+endogenous+mevalonate+metabolites+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Human T cell receptor γδ cells recognize endogenous mevalonate metabolites in tumor cells.</a> J Exp Med. 197, 163-168 (2003).</li>
<li>Kabelitz, D., Wesch, D., He, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+of+gammadelta+T+cells+in+tumor+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Perspectives of gammadelta T cells in tumor immunology.</a> Cancer Res. 67, 5-8 (2007).</li>
<li>Roelofs, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood+monocytes+are+responsible+for+gammadelta+T+cell+activation+induced+by+zoledronic+acid+through+accumulation+of+IPP%2FDMAPP%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood monocytes are responsible for gammadelta T cell activation induced by zoledronic acid through accumulation of IPP/DMAPP.</a> Br J Haematol. 144, 245-250 (2009).</li>
<li>Dieli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+%CE%B3%CE%B4+T-lymphocyte+effector+functions+by+bisphosphonate+zoledronic+acid+in+cancer+patients+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Induction of γδ T-lymphocyte effector functions by bisphosphonate zoledronic acid in cancer patients in vivo.</a> Blood. 102, 2310-2311 (2003).</li>
<li>Kondo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zoledronate+facilitates+large-scale+ex+vivo+expansion+of+functional+%CE%B3%CE%B4+T+cells+from+cancer+patients+for+use+in+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Zoledronate facilitates large-scale ex vivo expansion of functional γδ T cells from cancer patients for use in adoptive immunotherapy.</a> Cytotherapy. 10, 842-856 (2008).</li>
<li>Espinosa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+and+biological+activity+of+bromohydrin+pyrophosphate%2C+a+potent+stimulator+of+human+%CE%B3%CE%B4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis and biological activity of bromohydrin pyrophosphate, a potent stimulator of human γδ T cells.</a> J Biol Chem. 276, 18337-18344 (2001).</li>
<li>Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+profile+and+anti-tumor+effects+of+adoptive+immunotherapy+using+%CE%B3%CE%B4+T+cells+against+advanced+renal+cell+carcinoma%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Safety profile and anti-tumor effects of adoptive immunotherapy using γδ T cells against advanced renal cell carcinoma: a pilot study.</a> Cancer Immunol Immunother. 56, 469-476 (2007).</li>
<li>Murali-Krishna, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+antigen-specific+CD8+T+cells%3A+a+reevaluation+of+bystander+activation+during+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection.</a> Immunity. 8, 177-187 (1998).</li>
<li>Sato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+culture+medium+on+the+expansion+of+T+cells+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Impact of culture medium on the expansion of T cells for immunotherapy.</a> Cytotherapy. 11, 936-946 (2009).</li>
<li>Abe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+immunological+evaluation+of+zoledronate-activated+V%CE%B39+%CE%B3%CE%B4T-cell-based+immunotherapy+for+patients+with+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Clinical and immunological evaluation of zoledronate-activated Vγ9 γδT-cell-based immunotherapy for patients with multiple myeloma.</a> Exp Hematol. 37, 956-968 (2009).</li>
<li>Nakajima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+study+of+adoptive+immunotherapy+for+recurrent+non-small-cell+lung+cancer+patients+with+autologous+%CE%B3%CE%B4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cardiothorac+Surg%22%5BJournal%5D)">A phase I study of adoptive immunotherapy for recurrent non-small-cell lung cancer patients with autologous γδ T cells.</a> Eur J Cardiothorac Surg. 37, 1191-1197 (2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiona tutaj metoda umożliwia efektywną ekspansję limfocytów T γδ z PBMC. Limfocyty T γδ aktywowane i namnażane za pomocą zoledronianu oraz IL-2 wykształcają pełne funkcje efektorowe, co odzwierciedla produkcja cytokin oraz cytotoksyczność. Doniesiono, że syntetyczne fosfoantygeny: bromohydryny pirofosforan (BrHPP) oraz 2-metylo-3-butenylo-1-pirofosforan (2M3B1PP) również indukują ekspansję limfocytów T γδ; nie są one jednak dostępne komercyjnie. Z kolei zoledronian posiada już licencję do zastosowań klinicznych p...

<table><tbody><tr><td>ZOMETA</td><td>Novartis AG</td><td></td><td>zoledronian</td></tr><tr><td>PROLEUKIN</td><td>Novartis AG</td><td></td><td>rekombinowana ludzka IL-2</td></tr><tr><td>Probówka do przygotowania komórek BD Vacutainer CPT z heparyną sodową</td><td>BD Biosciences</td><td>362753</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Invitrogen</td><td>21870-076</td><td></td></tr><tr><td>pożywka ALyS203</td><td>Cell Science &amp;amp; Technology Institute</td><td>0301-7</td><td></td></tr><tr><td>OpTmizer</td><td>Invitrogen</td><td>0080022SA</td><td></td></tr><tr><td>brefeldyna A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5936-200UL</td><td></td></tr><tr><td>fosforan 12-mirystynianu 13-octanu (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585-1MG</td><td></td></tr><tr><td>ionomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13909-1ML</td><td></td></tr><tr><td>IntraPrep</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>A07803</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-ludzkie CD3-FITC lub PE/Cy5</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>A07746 FITC A07749 PE/Cy5</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-ludzkie CD4-ECD</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>6604727</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-ludzkie CD8-PE/Cy5</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>6607011</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-ludzkie CD14-PE/Cy5</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>A07765</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-ludzkie CD19-PE</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>A07769</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-ludzkie CD45-ECD</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>A07784</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-ludzkie CD56-PE/Cy5</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>A07789</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-ludzkie TCR&amp;alpha;&amp;#946;-PE</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>A39499</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-ludzkie TCR V&amp;#947;9-FITC</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>IM1463</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-ludzkie CD27-PE/Cy5</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>6607107</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-ludzkie CD45RA-ECD</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>IM2711</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-ludzkie CD69-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555531</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-ludzkie NKG2D-PE</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>A08934</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-ludzkie IFN&amp;#947;-PE</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>IM2717U</td><td></td></tr><tr><td>kontrolny przeciwciało izotypowe mysie IgG1-PE</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>A07796</td><td></td></tr><tr><td>kontrolny przeciwciało izotypowe mysie IgG1-ECD lub PE/Cy5</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>A07797A07798</td><td></td></tr></tbody></table>

ekspansja limfocytów t $\gamma\delta$ z ludzkiej krwi obwodowej przy użyciu zoledronianu

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Ludzkie limfocyty γδ T potrafią rozpoznawać i reagować na szeroką gamę antygenów indukowanych stresem, wykazując tym samym wrodzoną, szeroką aktywność przeciwnowotworową i przeciwdrobnoustrojową.1 Większość limfocytów γδ T we krwi obwodowej posiada receptor TCR Vγ9Vδ2. Komórki te rozpoznają antygen w sposób niezależny od głównego układu zgodności tkankowej (MHC) i rozwijają silne funkcje efektorowe o charakterze cytolitycznym oraz typu Th1.1 W związku z tym limfocyty γδ T są atrakcyjnymi kandydatami na komórki efektorowe w immunoterapii nowotworów. Limfocyty Vγ9Vδ2 T reagują na fosfoantygeny, takie jak (E)-4-hydroksy-3-metylo-but-2-enyl pirofosforan (HMBPP), który jest syntetyzowany w bakteriach poprzez biosyntezę izoprenoidów;2 oraz izopentenyl pirofosforan (IPP), produkowany w komórkach eukariotycznych w szlaku mewalonianowym.3 W warunkach fizjologicznych generowanie IPP w komórkach nietransformowanych jest niewystarczające do aktywacji limfocytów γδ T. Rozregulowanie szlaku mewalonianowego w komórkach nowotworowych prowadzi do akumulacji IPP i aktywacji limfocytów γδ T.3 Ponieważ aminobisfosfoniany (takie jak pamidronian lub zoledronian) hamują syntazę farnezylu pirofosforanu (FPPS), enzym działający poniżej IPP w szlaku mewalonianowym, wewnątrzkomórkowe poziomy IPP oraz wrażliwość na rozpoznanie przez limfocyty γδ T mogą być terapeutycznie zwiększane za pomocą aminobisfosfonianów. Akumulacja IPP jest mniej wydajna w komórkach nietransformowanych niż w komórkach nowotworowych przy farmakologicznie istotnym stężeniu aminobisfosfonianów, co umożliwia immunoterapię nowotworów poprzez aktywację limfocytów γδ T aminobisfosfonianami.4 Co ciekawe, IPP gromadzi się w monocytach podczas traktowania PBMC aminobisfosfonianami, ze względu na wydajne pobieranie leku przez te komórki.5 Monocyty, w których gromadzi się IPP, stają się komórkami prezentującymi antygen i stymulują limfocyty Vγ9Vδ2 T we krwi obwodowej.6 W oparciu o te mechanizmy opracowaliśmy technikę wielkoskalowej ekspansji kultur limfocytów γδ T z wykorzystaniem zoledronianu i interleukiny-2 (IL-2).7 Inne metody ekspansji limfocytów γδ T wykorzystują syntetyczne fosfoantygeny: bromohydryny pirofosforan (BrHPP)8 lub 2-metylo-3-butenyl-1-pirofosforan (2M3B1PP).9 Wszystkie te metody umożliwiają ekspansję ex vivo, co pozwala na uzyskanie dużej liczby limfocytów γδ T do zastosowania w immunoterapii adoptywnej. Jednak tylko zoledronian jest odczynnikiem dostępnym komercyjnie i zatwierdzonym przez FDA. Limfocyty γδ T rozszerzone zoledronianem wykazują fenotyp pamięci efektorowej CD27-CD45RA-, a ich funkcję można ocenić za pomocą testu produkcji IFN-γ.7

Opisano metodę ekspansji limfocytów γδ T z mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC). Limfocyty γδ T pochodzące z PBMC są stymulowane i namnażane przy użyciu zoledronianu oraz interleukiny-2 (IL-2). Wielkoskalowa ekspansja limfocytów γδ T może zostać zastosowana w autologicznej immunoterapii komórkowej nowotworów.

Ekspansja limfocytów T $\gamma\delta$ z ludzkiej krwi obwodowej przy użyciu zoledronianu

Ludzkie limfocyty T $\gamma\delta$ potrafią rozpoznawać i reagować na szeroką gamę antygenów indukowanych stresem, rozwijając w ten sposób wrodzoną, szeroką odpowiedź przeciwnowotworową i...

W niniejszym filmie przedstawiono metodę wielkoskalowej ekspansji ludzkich limfocytów T gamma delta z krwi obwodowej z wykorzystaniem zoledronianu. W pierwszej kolejności krew pełna poddawana jest wirowaniu w gradiencie gęstości w celu wyizolowania mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC). Komórki PBMC stymulowane są zoledronianem, aby monocyty stały się komórkami prezentującymi antygen, oraz IL-2 w celu stymulacji limfocytów T gamma delta.Komórki inkubuje się do 14 dni w celu proliferacji limfocytów T gamma delta. Analiza hodowli metodą cytometrii przepływowej wykazuje, że większość zebranych komórek wykazuje fenotyp CD3 dodatni V gamma 9 dodatni. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącą metodą jest to, że została ona już licencjonowana do zastosowań klinicznych w Zometa.W związku z tym, w celu przygotowania komórek T gamma delta klasy klinicznej, łatwo dostępny jest niezawodny odczynnik, co dowodzi, że procedura zostanie przeprowadzona zgodnie z kulturą komórkową makoto condo i amichi izumi. Technicy z mojego laboratorium rozpoczynają tę procedurę od izolacji mononuklearnych komórek krwi obwodowej z krwi pełnej pobranej do probówki BD vacutainer CPT do przygotowania komórek, zawierającej heparynę sodową jako antykoagulant oraz ciecz o wysokiej gęstości, a także barierę z żelu poliestrowego, która rozdziela oba płyny. Próbkę wirujemy w temperaturze pokojowej w rotorze z koszykami odchylanymi poziomo przez 20 minut przy 1800 ×g. Po zakończeniu wirowania i wyłączeniu hamulca zawartość probówki zostanie rozdzielona na pięć warstw.Górna żółta warstwa składa się z plazmy. Poniżej znajduje się biaława warstwa zawierająca mononuklearne komórki krwi obwodowej oraz płytki krwi, które spoczywają na jaśniejszej żółtej warstwie roztworu gęstościowego. Warstwa żelu poliestrowego w kolorze białym oddziela ją od granulocytów, które tworzą szarawą warstwę znajdującą się nad erytrocytami na dnie probówki.Używając pipety 2 ml, ostrożnie pobierz frakcję warstwy plazmy, pozostawiając od 5 do 10 mm plazmy nad granicą faz, i przenieś ją do stożkowej probówki 15 ml. Umieść probówkę w temperaturze 4 °C w celu późniejszego wykorzystania do hodowli. Następnie, za pomocą pipety 2 ml, pobierz wzbogaconą frakcję PBMC z granicy faz i przenieś ją do stożkowej probówki 15 ml.Aby wyprać PBMC, należy dodać 10 ml PBS i odwrócić probówkę pięć razy. Następnie probówkę wirujemy przez pięć minut przy 400 ×g. Kroki płukania powtarzamy dwukrotnie. Po ponownym zawieszeniu osadu komórkowego w 5 ml PBS, liczbę komórek należy określić za pomocą komory licznikowej (hemocytometru).Zazwyczaj z jednego mililitra krwi pełnej odzyskuje się 1,3 × 10⁶ komórek. Frakcję PBMC zawierającą 1 × 10⁶ komórek oddziela się i przechowuje w lodzie do analizy metodą cytometrii przepływowej.Aby przeprowadzić ekspansję limfocytów T gamma delta w próbce PBMC, należy odwirować zawiesiny komórkowe w 15 mililitrowych probówkach stożkowych przez pięć minut przy 400 ×g w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu należy odlać nadsącz i ponownie zawiesić komórki w pożywce hodowlanej, uzupełnionej o 1000 IU/mL IL-2 oraz 5 µM zoledronatu, przy gęstości 1 × 10⁶ komórek/mL. Zoledronat hamuje syntazę farnylopirofosforanu w monocytach, co prowadzi do akumulacji izopentenylopirofosforanu i przekształcenia monocytów w komórki prezentujące antygen.Następnie za pomocą pipety przenieś 1 mL pożywki zawierającej 1 × 10⁶ komórek do każdej studni płytki 24-dołkowej. Zagęszczenie komórek powinno wynosić 0,5 × 10⁶ cm⁻². W przypadku większych kultur należy odpowiednio przeskalować objętość dla każdej studni płytki 24-dołkowej.Dodać 100 µL wcześniej pobranego osocza autologicznego, połączonego surowicy ludzkiej grupy AB lub FBS. Płytki inkubować w wilgotnej atmosferze w temperaturze 37 °C i 5% CO2, wymieniając pożywkę co dwa do trzech dni. Pożywkę zastąpić świeżą pożywką z dodatkiem surowicy i ludzką IL-2 w stężeniu 1000 IU/mL.Gdy komórki osiągną gęstość od 0,5 do 2 × 10⁶ komórek na ml, należy je przesiać w stosunku od 1:2 do nowych dołków lub kolb. Obserwuj komórki przez kilka kolejnych dni. Przedstawione tutaj są komórki w dniu zerowym.Mniejsze komórki to limfocyty. Większe komórki to monocyty. Po około 24 godzinach monocyty przylegają do dna dołka.Po dwóch dniach niektóre limfocyty przyłączają się do monocytów; do trzeciego dnia komórki T gamma delta zaczynają tworzyć skupiska. W piątym dniu widoczne są duże klastry komórek. W przeciwieństwie do tego, brak skupisk lub agregatów będzie obserwowany w przypadku niewystarczającego wzrostu komórek T gamma delta. Gdy formowanie skupisk jest opóźnione.Jak pokazano tutaj, wzrost innych typów komórek, takich jak limfocyty T $\alpha\beta$ CD4+ lub CD8+ bądź komórki NK, dominuje nad wzrostem limfocytów T $\gamma\delta$. W 12. lub 14. dniu należy dokładnie upłynnić komórki za pomocą pipety 10 ml i zebrać je do stożkowych probówek 50 ml. Komórki można teraz poddać analizie metodą cytometrii przepływowej w celu określenia częstości występowania, fenotypu i funkcji limfocytów T $\gamma\delta$.Aby przeprowadzić analizę fenotypową PBMC lub namnożonych limfocytów T gamma delta, należy rozpocząć od przeniesienia 200 µL próbek zawierających 2 × 10⁵ komórek do każdej z dziewięciu probówek do sortowania komórek metodą FACS. Dodać 2 mL zimnego PBS i odwirować przez 5 minut przy 400 ×g, a następnie zawiesić osady w 50 µL buforu FACS. Do próbek dodać po 5 µL każdego z wymaganych przeciwciał.Inkubować próbki na lodzie w ciemności przez 20 minut. Po inkubacji dodać 2 mL buforu FACS do każdej próbki, a następnie wirować próbki w wirówce typu vortex przez 5 minut przy 400 ×g w temperaturze 4°C. Po wirowaniu ostrożnie odlać nadsącz, zawiesić komórki ponownie w 300 µL buforu FACS i wymieszać w wirówce typu vortex.Następnie przeanalizuj próbki za pomocą cytometru przepływowego w celu oceny funkcji limfocytów T gamma delta. Ich zdolność do produkcji interferonu gamma analizuje się poprzez wewnątrzkomórkowe barwienie interferonu gamma. Resuspenduj limfocyty T gamma delta w stężeniu 2×10⁶ komórek/mL w pożywce RPMI 10 zawierającej felden A w stężeniu 20 µg/mL.Felden A hamuje wydzielanie interferonu gamma, co prowadzi do gromadzenia się interferonu gamma w komórce. Następnie przenieś 100 µL zawiesiny limfocytów T gamma delta do każdego dołka płytki 96-dołkowej zawierającej 100 µL samego RPMI 10 lub RPMI 10 z 20 ng/mL four. Ball 12 ate 13 acetate oraz 2 µg/mL jonomycyny lub Z duddy cells.Wymieszaj, pipetując ciecz kilka razy w górę i w dół. Inkubuj przez cztery godziny w inkubatorze w temperaturze 37°C i 5% carbon dioxide. Następnie odwiruj płytkę przez pięć minut przy 400×g w temperaturze 4°C, a po resuspensji zawieś osady w 200 µL zimnego PBS.Przenieś próbki do probówek FACS. Następnie dodaj 4 mL zimnego PBS i wiruj probówki przez 5 minut przy 400 ×g w temperaturze 4°C. Po wirowaniu resuspenduj osady w 50 µL buforu FACS z dodatkiem 5 µL.Przeciwciało monoklonalne anty-TCRV gamma 9 koniugowane z FE oraz 2,5 µL przeciwciała monoklonalnego anty-CD3 koniugowanego z PE SCI 5 inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Po inkubacji dodać 100 µL odczynnika intra prep 1 i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Do każdej probówki dodać 4 mL PBS i wirować przez 5 minut przy 400 ×g w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu resuspender osad w 100 µL odczynnika intra prep 2 i inkubować przez 5 minut.W temperaturze pokojowej dodaj do probówki 5 µL przeciwciała monoklonalnego przeciwko interferonowi gamma sprzężonego z PE. Inkubuj przez 15 minut w ciemności. W temperaturze pokojowej dodaj do każdej probówki 4 mL PBS i wiruj przez 5 minut przy 400 ×g. W temperaturze pokojowej usuń nadsącz poprzez aspirację i resuspenduj pellet komórkowy.W 0,5 ml buforu FACS. Próbki komórek należy przeanalizować za pomocą cytometru przepływowego, ustawiając bramkę na komórki CD3+ TCR Vγ9+ i badając ekspresję interferonu gamma. Typowy fenotyp powierzchniowy limfocytów T gamma delta został przedstawiony w tym miejscu.Limfocyty T gamma delta zidentyfikowano na podstawie ekspresji CD3 oraz TCRV gamma nine w dniu zerowym. Odsetek limfocytów T gamma delta CD3-dodatnich i TCRV gamma nine-dodatnich w PBMC wynosił 1,6%. Dominującymi populacjami limfocytów T gamma delta były fenotypy naiwne CD27-dodatnie i CD45RA-dodatnie lub fenotypy pamięci centralnej CD27-dodatnie i CD45RA-ujemne. Ekspresja CD27 i CD45RA służy do określenia ich fenotypu naiwnego lub pamięciowego.Dodatni dla CD 27. CD 45. Dodatni dla RA to naiwne.CD 27 dodatnie. CD 45 RA ujemne to centralna pamięć; CD 27 ujemne. CD 45.RA negatywne to pamięć efektorowa. CD 27 negatywne. CD 45.Fenotyp dodatni pod względem RA jest fenotypem terminalnie zróżnicowanym. Status aktywacji komórek analizowano za pomocą NK G 2D lub CD 69, jak pokazano tutaj. Komórki T gamma delta wykazują ekspresję NK G 2D, ale nie wykazują ekspresji CD 69.Po 14 dniach hodowli częstotliwość występowania limfocytów T gamma delta wzrosła do ponad 93,8% hodowanych komórek. W udanych hodowlach limfocytów T gamma delta wykazywały one fenotyp pamięci efektorowej CD 27 negatywny i CD 45 RA negatywny. Hodowane limfocyty T gamma delta wykazywały zwiększoną ekspresję nkg 2D oraz CD 69.Barwienie wewnątrzkomórkowe interferonu gamma wykazało, że komórki T gamma delta produkowały interferon gamma w odpowiedzi na traktowanie PMA/CIN lub komórki Z dwy, w których gromadził się IPP. Po zastosowaniu zoledronianu odpowiednio 97% i 19,6% komórek T gamma delta produkowało interferon gamma w odpowiedzi na stymulację PMA/CIN oraz komórkami Z ddy. Wyniki te wskazują, że zoledronian może efektywnie stymulować i powiększać populację funkcjonalnych komórek T gamma delta.Kinetyka hodowli limfocytów T gamma delta ekspandowanych za pomocą zoledronianu i IL-2 wykazała wykładniczy wzrost bezwzględnej liczby hodowanych komórek do 12–14 dnia. Wzbogacenie populacji limfocytów T gamma delta osiągnięto stosunkowo wcześnie. Do siódmego dnia niemal 80% hodowanych komórek stanowiły limfocyty T gamma delta. Bezwzględna liczba limfocytów T gamma delta w wskazanych punktach czasowych wykazuje, że z 1×10⁶ PBMC zawierających 1,6×10⁴ limfocytów T gamma delta można uzyskać około 2,2×10⁸ limfocytów T gamma delta po ich namnożeniu.Technika ta otwiera drogę badaczom w dziedzinie immunoterapii nowotworów do zbadania zastosowań klinicznych w wielu różnych typach raka. Metoda hodowli ta została wykorzystana w pierwszej fazie badań klinicznych w celu oceny bezpieczeństwa i wykonalności terapii transferem donorskich, ekspandowanych limfocytów T gamma delta u pacjentów z nowotworami.

expansion-of-human-peripheral-blood-t-cells-using-zoledronate

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ekspansja ludzkich obwodowych krwianych komórek γδ T za pomocą zoledronianu

Opisano wydajny protokół ekspansji ex vivo limfocytów T reaktywnych przeciwko nowotworowi, izolowanych z węzłów chłonnych drenujących guz lub innych wtórnych tkanek limfatycznych organizmów z nowotworem. Protokół ten pozwala na selektywną ekspansję swoistych dla nowotworu limfocytów T do zastosowania w adoptywnej immunoterapii raka piersi.

Ex vivo ekspansja limfocytów T reaktywnych przeciwko nowotworowi za pomocą bryostatyny 1/ionomycyny oraz formulacji cytokin wspólnego łańcucha gamma

W niniejszej pracy opisujemy metodę wydajnej ekspansji i oczyszczania dużych ilości ludzkich komórek NK oraz oceny ich funkcji.

Ekspansja, oczyszczanie i ocena funkcjonalna ludzkich komórek NK z krwi obwodowej

Różnicowanie komórek prekursorowych w osteoklasty jest regulowane przez cytokiny i czynniki wzrostu. W tym artykule opisano nową technikę transferu genów do różnicowania osteoklastów in vivo oraz protokoły hodowli komórkowych do różnicowania komórek prekursorowych w osteoklasty in vitro jako metodę badania wpływu cytokin na osteoklastogenezę.

Nowatorska technika transferu genów in vivo i testy komórkowe in vitro do badania utraty masy kostnej w zaburzeniach układu mięśniowo-szkieletowego

Ten protokół opisuje rozwój przedklinicznego modelu osteoklastogenezy in vitro z monocytów krwi obwodowej hodowanych z liniami komórkowymi raka piersi w celu naśladowania interakcji komórka rakowa - osteoklast. Model ten może zostać wykorzystany do pogłębienia naszej wiedzy na temat powstawania przerzutów do kości i poprawy opcji terapeutycznych.

Opracowanie ludzkiego przedklinicznego modelu osteoklastogenezy z monocytów krwi obwodowej hodowanych wspólnie z liniami komórkowymi raka piersi

Tutaj prezentujemy protokół do wywoływania i oceniania choroby w modelu xenoGVHD (xenoGVHD) ksenogenicznej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi. xenoGVHD dostarcza model in vivo do badania immunosupresji ludzkich limfocytów T. Dodatkowo opisujemy, jak wykrywać ludzkie limfocyty T w tkankach za pomocą cyfrowego PCR jako narzędzia do ilościowego określania immunosupresji.

Indukcja i ocena choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi w ksenogenicznym mysim modelu i kwantyfikacja ludzkich limfocytów T w tkankach myszy przy użyciu cyfrowego PCR

Opisujemy ludzką komórkę jednojądrzastą krwi obwodowej (PBMC) — humanizowany model myszy ksenoprzeszczepu do translacyjnych badań immunoonkologicznych. Protokół ten może służyć jako ogólna wskazówka do ustanawiania i charakteryzowania podobnych modeli oceny terapii I-O.

Humanizowany model ksenoprzeszczepu z ludzkimi komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej (PBMC) do badań immunoonkologicznych translacyjnych (I-O)

Choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi jest poważnym powikłaniem po allogenicznym przeszczepie szpiku kostnego. Komórki dendrytyczne odgrywają kluczową rolę w patogenezie choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi. W niniejszym artykule opisano nowatorską platformę przeszczepu szpiku kostnego w celu zbadania roli komórek dendrytycznych w rozwoju choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi i efektowi przeszczep przeciwko białaczce.

Platforma do przeszczepiania szpiku kostnego w celu zbadania roli komórek dendrytycznych w chorobie przeszczep przeciwko gospodarzowi

Prezentowany jest protokół ekspansji produktu leczniczego limfocytów T Gamma-Delta (γδ). Limfocyty są izolowane przez elutriację i wzbogacane γδ kwasem zoledronowym i interleukiną-2. Limfocyty T alfa-beta są wyczerpywane za pomocą klinicznego urządzenia do separacji magnetycznej. Komórki γδ są hodowane wspólnie z pochodzącymi z K562, sztucznymi komórkami prezentującymi antygen i ekspandowane.

Ekspansja i wzbogacanie limfocytów T gamma-Delta (γδ) z aferezowanego produktu ludzkiego

Osteoklasty są kluczowymi komórkami resorpcyjnymi kości w organizmie. Protokół ten opisuje wiarygodną metodę różnicowania in vitro osteoklastów z ludzkich monocytów krwi obwodowej. Metoda ta może być wykorzystana jako ważne narzędzie do lepszego zrozumienia biologii osteoklastów w homeostazie i chorobach.

Różnicowanie funkcjonalnych osteoklastów z monocytów CD14+ ludzkiej krwi obwodowej

Tutaj ustanowiliśmy in vivo osteo-organoidy uruchamiane przez morfogenetyczne rusztowania żelatynowe z białkiem 2 w celu pobrania terapeutycznych hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych w celu odbudowy uszkodzonego układu krwiotwórczego i odpornościowego. Ogólnie rzecz biorąc, takie podejście może stanowić obiecujące źródło komórek w terapiach komórkowych.

Podejście osteoorganoidowe in vivo do pozyskiwania terapeutycznych hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych

Poznaj metodę ekspansji limfocytów T γδ z krwi obwodowej przy użyciu zoledronianu i IL-2. Technika ta umożliwia uzyskanie komórek do autologicznej immunoterapii przeciwnowotworowej w ciągu 14 dni.

Ekspansja limfocytów T $\gamma\delta$ z ludzkiej krwi obwodowej przy użyciu zoledronianu

Przeglądaj więcej filmów