Name: Oczyszczanie Hsp104, białkowej deaggregazy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Poznaj protokół oczyszczania aktywnego białka Hsp104 z drożdży przy użyciu chromatografii jonowymiennej i filtracji żelowej. Ta metoda umożliwia uzyskanie dużych ilości białka do badań strukturalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez grant z NIH (5T32GM008275-22) oraz stypendium przeddoktoranckie American Heart Association (dla E.A.S.); stypendium Chemistry-Biology Interface Fellowship z NIH (2T32GM071339-06A1) (dla M.E.D.); oraz granty z NIH (1DP2OD002177-01 i NS067354-0110), The Ellison Medical Foundation oraz The Bill and Melinda Gates Foundation (dla J.S.).

1. Ekspresja Hsp104
<ol>
<li>Plazmid wykorzystywany do oczyszczania w E. coli, pPROEX-HTb-Hsp104, zawiera otwartą ramkę odczytu Hsp104 pod indukowalną kontrolą promotora trc26. Plazmid ten produkuje Hsp104 z N-terminalnym znacznikiem His6, który może zostać usunięty poprzez cięcie proteazą TEV. Przetransformuj pPROEX-HTb-Hsp104 do zoptymalizowanych kodonowo komórek E. coli BL21-CodonPlus-RIL (Stratagene, Agilent Technologies), stosując typową procedurę transformacji bakteryjnej (np. zgodnie z instrukcją producenta). Ważne jest użycie zoptymalizowanego kodonowo szczepu E. coli, ponieważ Hsp104 wykazuje nietypową preferencję kodonów.</li>
<li>Zaszczep świeże transformanty do 100mL kultury 2XYT (USB. Przepis: 16g/L peptonu kazeinowego, 10g/L ekstraktu drożdżowego, 5g/L NaCl, pH 7.0) uzupełnionej o 100μg/mL ampicyliny i 34μg/mL chloramfenikolu i inkubuj przez noc w 37°C przy wytrząsaniu z prędkością 200rpm.</li>
<li>Przenieś 10mL kultury nocnej do 6 x 1L pożywki 2XYT z 100μg/mL ampicyliny i 34μg/mL chloramfenikolu w kolbach o pojemności 2L. Inkubuj przy wytrząsaniu z prędkością 250rpm w 37°C do uzyskania OD600 = 0.4-0.6. Przerwij wytrząsanie i obniż temperaturę do 15°C. Pozostaw komórki bez wytrząsania w inkubatorze przez 30min, aż temperatura osiągnie 15°C. Po osiągnięciu 15°C indukuj ekspresję białka, dodając IPTG do stężenia końcowego 1mM. Wznów wytrząsanie z prędkością 250rpm przez noc (12-16 godzin).</li>
</ol>
2. Zbiór i lizy komórek
<ol>
<li>Zebrać komórki poprzez wirowanie (w schłodzonym wirniku) z prędkością 4,000rpm przez 20min w temperaturze 4°C (używamy wirówki Sorvall RC 3BP+). Kolejne etapy należy przeprowadzić niezwłocznie, ponieważ aktywność Hsp104 ulega zmniejszeniu po zamrożeniu komórek E. coli. Ponadto wszystkie następne czynności powinny być wykonywane na lodzie lub w temperaturze 4°C.</li>
<li>Resuspendować osad komórkowy w 10mL schłodzonego (na lodzie) buforu do lizy (40mM HEPES-KOH pH 7.4, 500mM KCl, 20mM MgCl2, 2.5% (w/v) glicerolu, 20mM imidazolu, 5μM pepstatyny A, kompletnego koktajlu inhibitorów proteaz (1 tabletka bez EDTA/50mL) oraz 2mM β-merkaptoetanolu).</li>
<li>Przeprowadzić lizę komórek za pomocą homogenizatora French press (Emulsiflex) z wymiennikiem ciepła zanurzonym w wodzie z lodem. Przed rozpoczęciem należy upewnić się, że wszystkie aglomeraty komórkowe zostały rozpuszczone. Po wyrównaniu buforu do lizy w homogenizatorze, dwa przejścia przez cylinder pod ciśnieniem 15,000-18,000psi są wystarczające do pełnej lizy. W przypadku braku dostępu do urządzenia French press można zastosować inkubację z lizozymem, a następnie sonikację (patrz sekcja dyskusja). Odstawić niewielką próbkę zlizowanych komórek (1μL) do analizy SDS-PAGE (Lysate na Rys. 2).</li>
<li>Usunąć szczątki komórkowe poprzez wirowanie z prędkością 16,000rpm przez 20min w temperaturze 4°C (używamy wirówki Sorvall RC5C+). Zebrać nadsącz do następnego etapu i odstawić niewielką próbkę (1μL) nadsączu do analizy SDS-PAGE (Ni Load na Rys. 2).</li>
</ol>
3. Oczyszczanie białka Hsp104
<ol>
<li>Wymieszać nadpływ z kroku 2.4 z 12 mL (2 mL kulek Ni-Sepharose na 1 L komórek) 50% zawiesiny kulek Ni-Sepharose (GE) równoważonych buforem do lizy.</li>
<li>Próbkę obracać powoli przez 3 godziny w temperaturze 4°C w taki sposób, aby Ni-Sepharose pozostały równomiernie zawieszone i zminimalizować pienienie. Możliwe są krótsze czasy inkubacji, jednak zmniejszy to wydajność. W 4°C w obecności inhibitorów proteaz degradacja zachodzi w niewielkim stopniu, a 3-godzinny czas inkubacji z Ni-Sepharose nie obniża aktywności produktu końcowego. Odwirować Ni-Sepharose przez 2 min w 4°C przy 2 000 rpm (wirówka Eppendorf 5810R). Odstawić małą próbkę nadpływu do analizy SDS-PAGE (1 μL), a resztę odrzucić (Ni Flow Through (FT) na rys. 2).</li>
<li>Przemyć odzyskane Ni-Sepharose 25 objętościami kolumny buforem do przemywania (40 mM HEPES-KOH pH 7.4, 150 mM KCl, 20 mM MgCl2, 2.5% (w/v) glicerolu, 20 mM imidazolu, 2 mM β-merkaptoetanolu), 5 objętościami kolumny buforem do przemywania z 1 M KCl w celu usunięcia zanieczyszczeń związanych elektrostatycznie z Hsp104 oraz 25 objętościami kolumny buforem do przemywania. Ni-Sepharose zbierać po każdym przemywaniu przez wirowanie przez 2 min w 4°C przy 2 000 rpm (wirówka Eppendorf 5810R). Po każdym cyklu przemywania i wirowania usunąć bufor za pomocą aspiratora.</li>
<li>Aby eluować Hsp104, wymieszać Ni-Sepharose z 1 mL buforu do elucji (40 mM HEPES-KOH pH 7.4, 150 mM KCl, 20 mM MgCl2, 2.5% (w/v) glicerolu, 350 mM imidazolu, 2 mM β-merkaptoetanolu) na każdy 1 mL Ni-Sepharose i obracać w 4°C przez 20 minut. Wysokie stężenie imidazolu rozrywa oddziaływanie między kuleczkami Ni a His6. Usunąć Ni-Sepharose za pomocą pustych kolumienek wirowych 1.2 mL (Bio-Rad) przez wirowanie przez 2 min w 4°C przy 2 000 rpm (wirówka Eppendorf 5810R). Odstawić 1 μL eluatu do analizy SDS-PAGE (eluat Ni na rys. 2). Na każdy litr komórek na tym etapie uzyskuje się ˜15 mg Hsp104.</li>
<li>Przeprowadzić wymianę buforu eluatu na bufor Q (20 mM Tris-HCl pH 8, 0.5 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 50 mM NaCl) przy użyciu koncentratorów wirowych Amicon Ultra (Millipore) o MWCO 30 000 i pojemności 15 mL. Najpierw skoncentrować białko do ˜1.5 mL, a następnie dodać 14.5 mL buforu Q, aby rozcieńczyć białko 10-krotnie. Powtórzyć 3 razy w celu wymiany buforu. Podwyższone pH i niskie stężenie soli zapewniają wysoką ujemną ładunek Hsp104.</li>
<li>Oczyścić Hsp104 za pomocą chromatografii wymiany anionowej, używając kolumny Resource Q 6 mL (GE) równoważonej buforem Q. Przed wstrzyknięciem białko przefiltrować przez filtr strzykawkowy Millex GP PES Membrane 0.22 μm (Millipore) o niskim wiązaniu białek. Stosujemy przepływ 1 mL/min. Wypłukać słabo wiążące białka 1 objętością kolumny 20% buforu Q+ (20 mM Tris-HCl pH 8, 0.5 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 1 M NaCl). Eluować Hsp104 gradientem liniowym (20%–50% buforu Q+) przez 5 objętości kolumny (rys. 3). Zbierać frakcje 1 mL. Hsp104 i większość wariantów eluuje zazwyczaj przy ˜400 mM NaCl (31 mS/cm). Odstawić próbki z frakcji szczytowych (1 μL) do analizy SDS-PAGE (rys. 3, wstawka).</li>
<li>Aby usunąć znacznik His6, wymienić bufor białka za pomocą koncentratora wirowego Amicon, jak opisano powyżej (patrz krok 3.5), na bufor do cięcia (20 mM HEPES-KOH pH 7.4, 140 mM KCl i 10 mM MgCl2). Użyć proteazy proTEV (Promega) lub proteazy AcTEV (Invitrogen) zgodnie z instrukcją producenta. W przypadku Hsp104 stwierdziliśmy, że do pełnego cięcia wymagane są wyższe stosunki proteazy TEV do Hsp104. Stosujemy stosunek 1 jednostki proteazy na 12 μg Hsp104. Cięcie należy przeprowadzać w 30°C przez 2–4 godziny, a następnie inkubować przez 16 godzin w 4°C. Końcowe stężenie Hsp104 powinno wynosić od 20 do 75 μM monomeru. Usunąć wszelkie pozostałe Hsp104 ze znacznikiem His6 oraz proteazę TEV za pomocą Ni-Sepharose (GE), dodając Ni-Sepharose w nadmiarze w stosunku do ilości Hsp104 w reakcji cięcia (zakładając, że kulki mogą wiązać 15 mg białka na mL upakowanej żywicy). Usunąć kulki za pomocą pustych kolumienek wirowych (Bio-Rad), wirując przez 2 min przy 2 000 rpm w 4°C. Zebrać próbki przed i po cięciu (1 μL) do analizy SDS-PAGE, aby potwierdzić zajście cięcia oraz usunięcie niepociętego białka (rys. 4).</li>
<li>Wymienić bufor na bufor do wykluczania wielkości (20 mM HEPES-KOH pH 7.4, 140 mM KCl, 10 mM MgCl2, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT) przy użyciu Amicon Ultra (Millipore) MWCO 30 000, jak opisano w kroku 3.5.</li>
<li>Dalej oczyszczać Hsp104 za pomocą chromatografii wykluczania wielkości. Użyć kolumny Superose 6 lub Superdex 200 (obie od GE) równoważonej buforem do wykluczania wielkości (rys. 5). Przed wstrzyknięciem białko przefiltrować przez filtr strzykawkowy Millex GP PES Membrane 0.22 μm (Millipore) o niskim wiązaniu białek. Dla ilości białka mniejszych niż 10 mg można użyć kolumn o rozmiarze 10/300 (24 mL) i zbierać frakcje 0.5 mL. Dla próbek powyżej 10 mg należy użyć kolumny o rozmiarze 12/60 (120 mL) i zbierać frakcje 1 mL. Prędkości przepływu i objętości próbek do nałożenia znajdują się w instrukcjach producenta. Po oczyszczeniu frakcje Hsp104 są łączone, jak pokazano na rys. 5, i zagęszczane w jednostkach koncentratora wirowego Amicon (Millipore) [Uwaga redakcyjna: Lektor w filmie błędnie podaje filtr strzykawkowy 0.22 μM (mikromolarny), podczas gdy w czasie 04:38 powinien podać filtr strzykawkowy 0.22 μm (mikrometr)]. Hsp104 przechowuje się zgodnie z poniższym opisem. Ze względu na straty materiału podczas oddzielania produktów degradacji Hsp104 i zanieczyszczeń, końcowa wydajność oczyszczonego Hsp104 o pełnej długości wynosi ˜1–3 mg na litr kultury początkowej.</li>
</ol>
4. Aktywność dysagregazy Hsp104
<ol>
<li>Po oczyszczaniu dobrą praktyką jest ocena aktywności Hsp104 w teście dysagregacji. Zazwyczaj stosujemy test reaktywacji lucyferazy2 (Rys. 6). W tym teście Hsp104 we współpracy z systemem chaperonów Hsp70 (Hsp70 i Hsp40) dysagreguje agregaty lucyferazy świetlika zdenaturowane mocznikiem2. Rozpuszczalna lucyferaza katalizuje utlenianie lucyferyny do oksylucyferyny, co jest reakcją emitującą światło. Poprzez monitorowanie luminescencji można określić względną reaktywację, a tym samym stopień dysagregacji lucyferazy. Hsp104 musi być zdolne do synergistycznej współpracy z systemem kokaperonów Hsp70. Ilość odzyskanej luminescencji zależy od zastosowanej pary Hsp70:Hsp40. Rutynowo stosujemy Hsp72 i Hsp40 (Assay Designs). Co najmniej aktywna Hsp104 powinna spowodować 5-krotny wzrost reaktywacji lucyferazy w porównaniu do reaktywacji przez samo Hsp72:Hsp40 (Rys. 6). Preparaty Hsp104, które nie osiągają takiego poziomu aktywności, są odrzucane.</li>
</ol>
5. Przechowywanie Hsp104
<ol>
<li>W przypadku przechowywania krótkoterminowego białko Hsp104 można trzymać w temperaturze 4°C w buforze do chromatografii wykluczania. Należy jednak pamiętać, że aktywność białka spadnie po 2-3 dniach w 4°C, a gwałtownie po 1 tygodniu w 4°C. W testach dysagregacji zaleca się stosowanie Hsp104 jak najszybciej po puryfikacji. W idealnym przypadku Hsp104 powinno zostać wykorzystane natychmiast do testów dysagregacji amyloidów.</li>
<li>Jeśli białko musi być przechowywane długoterminowo, Hsp104 przekłada się do buforu do przechowywania (20mM HEPES-KOH pH 7.4, 140mM KCl, 10mM MgCl2, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 10% glicerolu (w/v)). Alikwoty o objętości 100μl są gwałtownie zamrażane w ciekłym azocie i przechowywane w temperaturze -80°C. Cykle zamrażania i rozmrażania drastycznie obniżają aktywność Hsp104, dlatego należy ich unikać. Zaleca się powolne rozmrażanie Hsp104 na lodzie. Aktywność dysagregazy amyloidowej gwałtownie spadnie po 1 miesiącu w temperaturze -80°C.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki i rysunki: 
<img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig1.jpg" alt="Schemat procesu agregacji białek z udziałem Hsp104, Hsp70 i Hsp40, przedstawiający renaturację." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Hsp104 jest bifunkcyjną dysagregazą. Dysagregacja nieuporządkowanych agregatów (pokazana po lewej stronie) wymaga współpracy systemu chaperonowego Hsp70 (Hsp70 i Hsp40)2. Hsp104 przebudowuje uporządkowane agregaty amyloidowe (pokazane po prawej stronie) bez pomocy Hsp70 i Hsp40 in vitro, jednak Hsp70 i Hsp40 mogą zwiększać aktywność Hsp104 przeciwko amyloidom26,28. W przypadku obu typów struktur agregacyjnych Hsp104 łączy hydrolizę ATP z translokacją substratu przez kanał centralny, aby promować dysagregację. Pętle porów zawierające tyrozynę wiążą substrat i transportują go przez kanał centralny49-52.
<img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig2.jpg" alt="Wyniki elektroforezy żelowej SDS-PAGE przedstawiające proces oczyszczania białka z markerami masy cząsteczkowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Analiza SDS-PAGE etapu oczyszczania powinowactwem na Ni-sepharose. Próbki lizatu, Ni Load, Ni FT oraz eluatu Ni zostały poddane frakcjonowaniu metodą SDS-PAGE przy użyciu żelu Criterion 4-20% Tris-HCl 1,0 mm (Bio-Rad) i zabarwione błękitem Coomassie. Należy zauważyć, że nie całe białko Hsp104 jest w stanie związać się z Ni-sepharose. Przedstawiono markery masy cząsteczkowej Broad Range (Bio-Rad) (lewa ścieżka).
<img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig3.jpg" alt="Wykres chromatografii absorbancyjnej z układem do oczyszczania białek i wynikami elektroforezy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3. Oczyszczanie eluatu z Ni-sepharose na kolumnie Resource Q. Niebieska linia przedstawia absorbancję przy 280nm, a zielona linia przedstawia % buforu Q+ (maksimum 50%). Pierwszy pik, eluujący przy 20% Q+, zawiera zanieczyszczenia, produkty degradacji oraz nieprawidłowo sfałdowane białko Hsp104. Drugi i główny pik zawiera prawidłowo sfałdowane i aktywne białko Hsp104. Szybkość przepływu wynosiła 1ml/min. Gradient od 20-50% Q+ trwa 30 minut lub 5 objętości kolumny. Wstawka: frakcje pików zostały rozdzielone za pomocą analizy SDS-PAGE z użyciem żelu Criterion 4-20% Tris-HCl 1,0mm (Bio-Rad) i zabarwione Coomassie. Po lewej stronie pokazano markery masy cząsteczkowej Broad Range (Bio-Rad).
<img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig4.jpg" alt="Wynik elektroforezy białek SDS-PAGE, marker MW, analiza przed i po cięciu, kDa." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> Rycina 4. Analiza SDS-PAGE etapu cięcia proteazą proTEV. His6-Hsp104 z oczyszczania Zasobu Q poddano działaniu proteazy proTEV przez 4 godziny w 30°C, a następnie przez 16 godzin w 4°C. Próbki rozdzielono metodą SDS-PAGE przy użyciu żelu Criterion 4-20% Tris-HCl 1,0 mm (Bio-Rad) i zabarwiono Coomassie. Należy zauważyć, że cięte przez proTEV białko Hsp104 migruje szybciej. Proteaza TEV oraz niecięte białko Hsp104 zostały usunięte za pomocą Ni-Sepharose, zgodnie z opisem w kroku 3.7. Po lewej stronie przedstawiono markery masy cząsteczkowej Broad Range (Bio-Rad).
<img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig5.jpg" alt="Wykres chromatografii oczyszczania białka; absorbancja względem objętości; wstawka z elektroforezą żelową." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> Rysunek 5. Oczyszczanie Hsp104 metodą wykluczania rozmiarów. Rozcięte białko Hsp104 poddano dalszemu oczyszczaniu na kolumnie do filtracji żelowej Superose 6 (10/300, GE). Szybkość przepływu = 0.4ml/min. Pik między liniami przerywanymi reprezentuje połączone frakcje. Wstawka: frakcje piku rozdzielono za pomocą analizy SDS-PAGE przy użyciu żelu Criterion 4-20% Tris-HCl 1.0mm (Bio-Rad) z barwieniem Coomassie. Po lewej stronie przedstawiono markery masy cząsteczkowej Broad Range (Bio-Rad).
<img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig6.jpg" alt="Wykres słupkowy porównujący luminescencję dla Hsp40/Hsp72, Hsp104 oraz Hsp104 i Hsp40/Hsp72." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 6"> Rysunek 6. Test reaktywacji lucyferazy. Zdenaturowane agregaty lucyferazy świetlika (50nM) inkubowano przez 90min w 25°C z Hsp72 i Hsp40 (1μM) (oba od Assay Designs), Hsp104 (6μM monomeru) lub Hsp104, Hsp72 i Hsp40. Zdenaturowana lucyferaza ulega pełnej reaktywacji jedynie w obecności zarówno Hsp104, jak i Hsp40/Hsp72. Przywróconą luminescencję mierzono za pomocą czytnika płytek Infinite M1000 (Tecan). Wartości przedstawiają średnie±SEM (n=3).

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Harmonogram: Aby uzyskać maksymalną aktywność Hsp104, zaleca się, aby cały schemat oczyszczania został zrealizowany tak szybko, jak to możliwe. Jednak liczba etapów oczyszczania tworzy wymagający harmonogram, który nie zawsze może być praktyczny. Jeśli etapy oczyszczania są przeprowadzane tak szybko, jak to możliwe, czas od zakończenia nocnej ekspresji do 2-4 godzin inkubacji w 30°C z proteazą TEV wynosi około 9-11 godzin. Jednym z potencjalnych miejsc na przerwę jest czas po etapie cięcia przez TEV. W razie absol...

<table><tbody><tr><td>Komórki kompetentne BL21-CodonPlus-RIL</td><td>Stratagene, Agilent Technologies</td><td>230255</td><td></td></tr><tr><td>pożywka 2XYT</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>75864</td><td></td></tr><tr><td>Tabletki z kompletnym, mini, bez-EDTA inhibitorem proteaz</td><td>Roche Group</td><td>1836170</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatyna A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4265</td><td></td></tr><tr><td>Ni-Sepharose 6 Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5318-02</td><td></td></tr><tr><td>Odśrodkowe jednostki filtrujące Amicon Ultra-15 (MWCO 30,000)</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC903008</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna Resource Q - 6ml</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1179-01</td><td></td></tr><tr><td>Proteaza proTEV</td><td>Promega Corp.</td><td>V6052</td><td></td></tr><tr><td>Proteaza AcTEV</td><td>Invitrogen</td><td>12575015</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>Hsp40</td><td>Assay Designs</td><td>SPP-400</td><td></td></tr><tr><td>Hsp72</td><td>Assay Designs</td><td>ADI-NSP-555</td><td></td></tr></tbody></table>

oczyszczanie hsp104, białkowej dysagregazy

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 jest heksamerycznym białkiem AAA+1 pochodzącym z drożdży, które łączy hydrolizę ATP z dysagregacją białek2-10 (Rys. 1). Aktywność ta zapewnia dwie kluczowe przewagi selekcyjne. Po pierwsze, renaturacja nieuporządkowanych agregatów przez Hsp104 umożliwia przetrwanie drożdży po różnych stresach związanych z błędnym fałdowaniem białek, w tym po szoku termicznym3,5,11,12. Po drugie, przebudowa włókien amyloidowych o strukturze cross-beta przez Hsp104 pozwala drożdżom wykorzystywać liczne priony (zakaźne amyloidy) jako rezerwuar korzystnej i dziedzicznej zmienności fenotypowej13-22. Co niezwykłe, Hsp104 bezpośrednio przebudowuje oligomery preamyloidowe i włókna amyloidowe, w tym te składające się z drożdżowych białek prionowych Sup35 i Ure223-30. Ta funkcjonalność przebudowy amyloidów jest wyspecjalizowaną cechą drożdżowego Hsp104. Ortolog z E. coli, ClpB, nie potrafi przebudowywać oligomerów preamyloidowych ani włókien amyloidowych26,31,32.
Ortologi Hsp104 występują we wszystkich królestwach organizmów z wyjątkiem, co jest zagadkowe, zwierząt. W rzeczywistości nie wiadomo, czy komórki zwierzęce posiadają jakikolwiek system enzymatyczny, który łączy dysagregację białek z renaturacją (a nie degradacją)33-35. W związku z tym my i inni zaproponowaliśmy, że Hsp104 może zostać opracowane jako środek terapeutyczny w leczeniu różnych chorób neurodegeneracyjnych związanych z błędnym fałdowaniem specyficznych białek w toksyczne oligomery preamyloidowe i włókna amyloidowe4,7,23,36-38. Nie istnieją leki, które bezpośrednio celują w gatunki zagregowane związane z tymi chorobami. Tymczasem Hsp104 rozpuszcza toksyczne oligomery i włókna amyloidowe składające się z alfa-synukleiny, które są związane z chorobą Parkinsona23, a także amyloidowe formy PrP39. Co istotne, Hsp104 redukuje agregację białek i łagodzi neurodegenerację w modelach gryzoni w chorobie Parkinsona23 oraz chorobie Huntingtona38. Idealnie, aby zoptymalizować terapię i zminimalizować skutki uboczne, Hsp104 zostałoby zmodyfikowane i usprawnione tak, aby selektywnie przebudowywać specyficzne agregaty kluczowe dla danej choroby4,7. Jednak ograniczone zrozumienie strukturalne i mechanistyczne tego, w jaki sposób Hsp104 dysagreguje tak zróżnicowany repertuar struktur zagregowanych i niepowiązanych białek, utrudnia te starania30,40-42.
Aby zrozumieć strukturę i mechanizm działania Hsp104, niezbędne jest zbadanie czystego białka i odtworzenie jego aktywności dysagregazy przy użyciu minimalnej liczby komponentów. Hsp104 jest białkiem o masie 102 kDa i pI ~5,3, które tworzy heksamery w obecności ADP lub ATP, bądź przy wysokich stężeniach białka w przypadku braku nukleotydów43-46. W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany protokół oczyszczania wysokiej aktywności, stabilnego białka Hsp104 z E. coli. Wykorzystanie E. coli umożliwia uproszczoną produkcję na dużą skalę, a nasza metoda może być przeprowadzona szybko i niezawodnie dla licznych wariantów Hsp104. Nasz protokół zwiększa czystość Hsp104 i upraszcza usuwanie znacznika His6 w porównaniu z poprzednią metodą oczyszczania z E. coli47. Ponadto nasz protokół jest prostszy i wygodniejszy niż dwa nowsze protokoły26,48.

W niniejszej pracy opisujemy protokół oczyszczania wysoce aktywnego białka Hsp104, heksamerycznego białka AAA+ z drożdży, które sprzęga hydrolizę ATP z disagregacją białek. Schemat ten wykorzystuje konstrukt z oznakowaniem His6 do oczyszczania powinowactwa z E. coli, a następnie chromatografię wymiany anionowej, usunięcie znacznika His6 za pomocą proteazy TEV oraz chromatografię wykluczania cząsteczkowego.

Oczyszczanie Hsp104, białkowej dysagregazy

Hsp104 jest heksamerycznym białkiem AAA+ z drożdży, które sprzęga hydrolizę ATP z dysagregacją białek2-10 (Rys. 1). Aktywność ta nadaje dwie kluczowe...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest otrzymanie dużych ilości wysoce aktywnego białka HSP 1 0 4 A o właściwościach deaggregacyjnych. Cel ten osiąga się poprzez ekspresję HSP 1 0 4 w zoptymalizowanych komórkach e coli. Następnie białko HS P 1 0 4 jest oczyszczane przy użyciu tagu powinowactwa do histydyny, a następnie za pomocą kolumny wymiany jonowej.Po chromatografii wymiany jonowej znacznik histydynowy jest odcinany za pomocą proteazy TEV. Końcowym etapem oczyszczania jest przeprowadzenie odciętego białka HSP 1 0 4 przez kolumnę do filtracji żelowej.Ponadto, ostatecznie, test reaktywacji Elif służy do określenia, czy oczyszczone białko HSP 1 0 4 jest aktywne. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi protokołami jest zarówno niewielka liczba etapów, jak i wysoka wydajność otrzymania wysoce aktywnego HSP 1 0 4, który nadaje się do badań strukturalnych i mechanistycznych. Osoby początkujące w tej metodzie mogą napotkać trudności, ponieważ większość etapów oczyszczania odbywa się w ciągu jednego dnia, co wiąże się z wymagającym harmonogramem.Przed rozpoczęciem niniejszego protokołu należy przygotować wszystkie niezbędne bufory do oczyszczania HSP 1 0 4 zgodnie z opisem w protokole pisemnym dołączonym do tego filmu. Należy również przeprowadzić nocną ekspresję białka HSP 1 0 4 w e coli zgodnie z procedurą szczegółowo opisaną w tekście; po ekspresji komórki należy zebrać poprzez wirowanie. Osady komórkowe należy zawiesić w 10 mililitrach schłodzonego buforu do lizy. Przed przeprowadzeniem lizy komórek za pomocą homogenizatora French press należy upewnić się, że wszystkie grudki komórkowe zostały rozpuszczone. Po zrównoważeniu homogenizatora buforem do lizy, należy poddać komórki lizie, przepuszczając je dwukrotnie przez cylinder.Przy prędkości wirowania od 15 000 do 18 000 g usuwam szczątki komórkowe poprzez wirowanie i zachowuję nadsącz do dalszego oczyszczania. Oczyszczanie HSP 1 0 4 rozpoczynam poprzez zmieszanie nadsączu z 50% zawiesiną niklowych kulek SRO równoważonych buforem do lizy. Próbkę obracam powoli przez trzy godziny w temperaturze 4 °C, tak aby kuleczki pozostały równomiernie zawieszone, a pienienie było zminimalizowane.Po inkubacji należy zebrać sferoidy niklowe poprzez wirowanie. Odzyskane sferoidy niklowe należy przemyć 25 objętościami kolumny buforu płuczącego. Następnie ponownie zebrać kuleczki przez wirowanie, po czym bufor płuczący można usunąć za pomocą aspiracji.Następnie przemyj kulki pięciokrotną objętością kolumny buforu do płukania z 1 M KCl, a następnie 25-krotną objętością kolumny buforu do płukania. Aby eluować HSP 1 0 4, wymieszaj kulki niklowe z buforem do elucji i inkubuj w rotacji w temperaturze 4 °C przez 20 minut.Oddziel kuleczki od eluatu poprzez wirowanie przez puste kolumny wirówki o pojemności 1,2 ml. Każdy litr komórek pozwala uzyskać około 15 mg HSB 1 0 4.Na tym etapie oczyszczania skoncentruj eluat do objętości około 1,5 ml, używając jednostek koncentratora odśrodkowego z granicą odcięcia masy cząsteczkowej 30 kDa. Następnie dodaj 14,5 ml buforu Q, aby rozcieńczyć białko dziesięciokrotnie.Powtórz ten proces trzy razy, używając buforu. Wymień białko przed oczyszczaniem HSP 1 0 4 za pomocą chromatografii wymiany anionowej. Przefiltruj białko przez strzykawkę z filtrem 0,22 µm o niskim wiązaniu białek.Następnie nanieś białko na kolumnę Resource Q o pojemności 6 ml, uprzednio równoważoną buforem Q. Wypłucz słabo wiążące się białka, używając jednej objętości kolumny 20% buforu B; eluj HSB 1 0 4 za pomocą gradientu liniowego przez pięć objętości kolumny, zbierając frakcje o objętości 1 ml. HSB 1 0 4 oraz większość wariantów zazwyczaj eluują przy stężeniu NaCl wynoszącym około 400 mM. Aby usunąć znacznik heksahistydynowy, przeprowadź wymianę buforu białka za pomocą koncentratora odśrodkowego, a następnie odłącz znacznik za pomocą proteazy TEV zgodnie z instrukcjami producenta.Przeprowadzenie cięcia w temperaturze 30°C przez dwie do czterech godzin, a następnie inkubacja przez 16 godzin w temperaturze 4°C. Usunięcie pozostałego HSB 1 0 4 z etykietą sześciohistydynową oraz proteazy TEV za pomocą SRO niklowych poprzez dodanie nadmiaru kulek w stosunku do ilości HSP 1 0 4 w reakcji cięcia. Następnie usunięcie kulek z próbki poprzez wirowanie w pustych kolumnach do wirowania.Aby przygotować próbkę do końcowego etapu oczyszczania, należy przenieść białko do buforu do chromatografii wykluczania treści za pomocą jednostek filtracyjnych do wirówek o progu odcięcia masy cząsteczkowej 30 000 Da, po uprzednim przefiltrowaniu przez strzykawkowy filtr 0,22 µm o niskim powinowactwie do białek. Następnie należy dalej oczyszczać HSP 1 0 4 za pomocą chromatografii wykluczania treści, stosując bufor do chromatografii wykluczania treści.UKOLUMNOWANA kolumna Superdex 200. Przeprowadzić rozdział FPLC zgodnie z instrukcjami producenta. Po oczyszczaniu pobrać frakcje HSP104 i zagęścić je w jednostkach koncentratora odwirowywanego; ze względu na utratę materiału podczas oddzielania produktów degradacji i zanieczyszczeń HSP104, końcowa wydajność oczyszczonego pełnowymiarowego białka HSP104 wynosi około 1-3 mg na litr kultury wyjściowej.Przedstawiono tutaj analizę żelową SDS-PAGE oczyszczania powinowactwa do niklu. Białko HSP 1 0 4 o masie 105 kilodalton z tagiem histydynowym jest widoczne w próbkach pobranych z lizatu, załadunku na ziarna, frakcji przepływowej oraz elucyjnej. Należy zauważyć, że nie całe białko HSP 1 0 4 jest w stanie związać się z sferami niklowymi; po chromatografii powinowactwa do niklu następuje wymiana jonowa na kolumnie Resource Q.Niebieska linia reprezentuje absorbancję przy 280 nanometrach, a zielona linia reprezentuje procent buforu B. Pierwszy pik, który eluuje przy 20% B, zawiera zanieczyszczenia, produkty degradacji oraz nieprawidłowo sfałdowane białko HSP 1 0 4. Główny pik zawiera prawidłowo sfałdowane i aktywne białko HSP 1 0 4, co potwierdzono analizą SDS-PAGE po wymianie jonowej. Białko HEXA histamine HSP 1 0 4 jest poddawane odszczepieniu znacznika histydynowego za pomocą proteazy pro TV.Należy zauważyć, że odcięte HSP 1 0 4 migruje szybciej niż białko z etykietą heksahistydynową. Odcięte HSP 1 0 4 poddano następnie dalszemu oczyszczaniu przy użyciu kolumny do filtracji żelowej AUP O six. Piku między przerywanymi liniami odpowiadają połączone frakcje.Przedstawiono tutaj wyniki testu reaktywacji lucyferazy, który służy do oceny aktywności disagregacyjnej HSP 1 0 4; zdenaturowane agregaty lucyferazy świetlikowej inkubowano z HSP 40 i HSP 72, HSB 1 0 4 lub z HSP 1 0 4, HSP 40 i HSB 72. Zdenaturowana lucyferaza ulega pełnej reaktywacji jedynie w obecności zarówno HSP 1 0 4, jak i HSP 40 oraz HSP 72, co potwierdza znaczny wzrost luminescencji. Po opanowaniu techniki, protokół ten można zrealizować w ciągu dwóch dni, pod warunkiem prawidłowego wykonania.

purification-of-hsp104-a-protein-disaggregase

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Oczyszczanie Hsp104, białka dysagregazy

Opracowano i szczegółowo opisano nowatorski i wysoce wydajny dwuetapowy protokół chromatografii powinowactwa. Metoda ta opiera się na niewielkim znaczniku oczyszczającym o dwóch wrodzonych powinowactwach i jest możliwa do zastosowania w odniesieniu do szerokiego zakresu białek docelowych o różnych właściwościach.<br...

Ortogonalne oczyszczanie białek wspomagane przez mały bispecyficzny znacznik powinowactwa

Źródło: Murata, T., et al. Oczyszczanie białka o wysokiej masie cząsteczkowej w Streptococcus mutans. J. Vis. Exp. (2019)Ten film pokazuje krok po kroku procedurę oczyszczania białka znakowanego polihistydyną wydzielanego przez Streptococcus mutans.

Procedura oczyszczania białka znakowanego polihistydyną ze Streptococcus mutans

W obecnym protokole demonstrujemy wysoce efektywną i opłacalną metodę oczyszczania białek na małą skalę, która pozwala na oczyszczanie rekombinowanych białek poprzez unikalne połączenie rozszczepialnego znacznika GST i małego znacznika His.

Oczyszczanie GST-His : Dwuetapowy protokół oczyszczania powinowactwa dający oczyszczone białka o pełnej długości

Ten artykuł opisuje użycie białka fuzyjnego lucyferazy świetlika i GFP do badania in vivo fałdowania białek u Saccharomyces cerevisiae.  Za pomocą tego odczynnika można jednocześnie monitorować fałdowanie modelowego białka zdenaturowanego termicznie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i testu enzymatycznego w celu zbadania roli składników sieci proteostazy w kontroli jakości białka.

Sprzężone testy do monitorowania ponownego fałdowania białek u Saccharomyces cerevisiae

Modele proteinopatii drożdży są cennymi narzędziami do oceny toksyczności i agregacji białek związanych z chorobą. W tym miejscu przedstawiamy metody badań przesiewowych bibliotek wariantów Hsp104 pod kątem supresorów toksyczności. Protokół ten można dostosować do badań przesiewowych dowolnej biblioteki białek pod kątem supresorów toksyczności dowolnego białka, które jest toksyczne w drożdżach.

Izolowanie wzmocnionych wariantów Hsp104 przy użyciu modeli proteinopatii drożdżowej

Przedstawiono procedurę ponownego fałdowania domeny wiążącej ligand peryplazmatyczny dCACHE chemoreceptora Campylobacter jejuni Tlp3 z ciał inkluzyjnych i oczyszczania w celu uzyskania miligramowych ilości białka.

Metoda skutecznego ponownego fałdowania i oczyszczania domeny wiążącej ligand chemoreceptora

Tutaj prezentujemy solidny i zoptymalizowany protokół produkcji miligramowych ilości natywnych, bezznacznikowych monomerów i włókienek eksonu1 białka huntingtyny (Httex1) w oparciu o przejściową fuzję małego modyfikatora związanego z ubikwityną (SUMO).

Generowanie natywnego, nieznakowanego monomeru i włókien eksonu huntingtyny1 przy użyciu strategii fuzji SUMO

Jednym z najtrudniejszych warunków stresowych, z jakimi organizmy spotykają się w ciągu swojego życia, jest akumulacja utleniaczy. Podczas stresu oksydacyjnego komórki w dużym stopniu polegają na molekularnych białkach opiekuńczych. W tym miejscu przedstawiono metody wykorzystywane do badania regulowanej przez redoks aktywności antyagregacyjnej, a także do monitorowania zmian strukturalnych regulujących funkcję opiekuńczą za pomocą HDX-MS.

Definiowanie regulowanej przez redoks aktywności chaperonu Hsp33 i mapowanie zmian konformacyjnych na Hsp33 przy użyciu spektrometrii mas wymiany wodorowo-deuterowej

Tutaj opisujemy metodę oczyszczania enzymów pirofosfokinazy znakowanych histydyną i wykorzystanie chromatografii cienkowarstwowej radioznakowanych substratów i produktów do badania aktywności enzymatycznej in vitro. Test aktywności enzymatycznej ma szerokie zastosowanie do dowolnej kinazy, cyklazy nukleotydowej lub reakcji przenoszenia fosforu, której mechanizm obejmuje hydrolizę trifosforanu nukleotydów.

Test oczyszczania i aktywności in vitro dla syntetazy (p)ppGpp z Clostridium difficile

Ten protokół opisuje metodę oczyszczania dla rekombinowanego, bezznacznikowego białka wiążącego wapń S100A12 i jego indukowanych jonami oligomerów do testów stymulacji ludzkich monocytów.

Oczyszczanie S100A12 człowieka i jego indukowanych jonami oligomerów do stymulacji komórek odpornościowych

W artykule opisano metodologię nadekspresji rekombinowanej Nsp15, toksycznej nukleazy, w systemie ekspresji C41(DE3), a następnie oczyszczania znakowanego białka za pomocą chromatografii wykluczania powinowactwa i wielkości. Protokoły te można dostosować do innych trudnych toksycznych białek.

Nadekspresja i oczyszczanie toksycznej nukleazy z Escherichia coli

Poznaj protokół oczyszczania aktywnego białka Hsp104 z drożdży przy użyciu chromatografii jonowymiennej i filtracji żelowej. Ta metoda umożliwia uzyskanie dużych ilości białka do badań strukturalnych.

Oczyszczanie Hsp104, białkowej dysagregazy

Przeglądaj więcej filmów