Fotoliza błyskowa związków klatkowych w rzęskach neuronów sensorycznych węchu

Zmysł węchu pozwala nam wykrywać i rozpoznawać lotne związki chemiczne w środowisku zewnętrznym. Wiążą się one z receptorami w wypustkach neuronów sensorycznych węchu i aktywują kaskadę transdukcji, która prowadzi do otwarcia kanałów bramkowanych cyklicznymi nukleotydami, a następnie kanałów chlorkowych aktywowanych wapniem. Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie sposobu bezpośredniej aktywacji tych kanałów za pomocą fotolizy związków klatkowych; związki klatkowe to cząsteczki uczynione fizjologicznie nieaktywnymi poprzez chemiczną klatkę.

Błysk światła ultrafioletowego rozbija klatkę i uwalnia fizjologicznie aktywne związki uwięzione w klatkach. Cycl, mp lub uwięziony wapń są zawarte w roztworze wewnątrzkomórkowym, wypełniającym pipetę do patch-clampu, i dyfundują do cytoplazmy neuronów sensorycznych węchu. Ultra-błysk jest aplikowany do obszaru klatki, aby uwolnić cycling, MP lub wapń, podczas gdy rejestracje techniką patch-clamp w konfiguracji whole-cell voltage clamp są prowadzone w celu pomiaru prądu.

Witajcie. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę rejestracji metodą patch-clamp połączoną z analizą polityki FE związków klatkowych. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania kanałów sterowanych przez CMP oraz kanałów cholinergicznych aktywowanych wapniem w neuronach sensorycznych węchu. Zatem zacznijmy.

Zastosowany tutaj system rejestracji metodą patch clamp obejmuje mikroskop odwrócony, system perfuzji, mikromanipulator, elektrodę rejestrującą oraz elektrodę odniesienia podłączoną do głowicy wzmacniacza patch clamp; całość zamontowano na stole antywibracyjnym wewnątrz klatki Faradaya. Wzmacniacz patch clamp jest połączony z digityzerem w komputerze wyposażonym w oprogramowanie do akwizycji danych. Do generowania błysków światła ultrafioletowego o wysokiej intensywności używamy lampy błyskowej Excelon.

Błysk światła można wyzwolić ręcznie lub komputerowo, korzystając z tego samego oprogramowania, które steruje akwizycją elektrofizjologiczną. Najlepsze długości fal do eksperymentów fotostymulacyjnych wybiera się poprzez wstawienie filtra UV do gniazda wyjściowego lub lampy błyskowej. Intensywność błysku światła można modyfikować, zmieniając napięcie lub pojemność lampy błyskowej.

Bardziej precyzyjną kontrolę natężenia światła uzyskuje się poprzez umieszczenie filtrów neutralnych w drugim slocie wyjściowym lampy błyskowej. Błysk światła jest kierowany do neuronów wysianych na szalkach z dnem szklanym za pomocą kwarcowego światłowodu. Światłowód jest podłączony do przystawki do fluorescencji epi w mikroskopie odwróconym.

Za pomocą adaptera zmodyfikowany kostnik filtracyjny bez filtra wzbudzenia kieruje wiązkę UV na neuron poprzez lustro dichroiczne. Światło jest ogniskowane przez obiektyw imersyjny 100 x. Obszar pokryty tkanką jest wizualizowany poprzez wprowadzenie światłowodu do iluminatora.

Obraz jest wyświetlany na monitorze za pomocą kamery CCD podłączonej do mikroskopu. Na monitorze wyznacza się obszar kontrolny, aby zlokalizować obszar UV ciała przed przeprowadzeniem sekcji; przygotowuje się trzy szalki z szklanym dnem pokryte conna a i poly. W celu przygotowania do sekcji, dwie szalki Petriego o średnicy 50 mm pokryte cukrem napełnia się roztworem Ringera.

Umieścić je w lodzie. Należy również schłodzić. Następnie zmieszać 0,5 ml roztworu stop mix z strzykawką zawierającą około 10 ml roztworu Ringera.

Zacznij od uśpionej myszy. Usuń skórę z linii czaszki, nacinając wzdłuż linii żuchwy, a następnie umieść głowę w posrebrzanej szalce Petriego. Umieść szalkę pod stereomikroskopem i za pomocą skalpela wykonaj cięcie strzałkowe.

Przetnij głowę wzdłuż linii środkowej. Obróć połowę głowy stroną przyśrodkową do góry. Ostrożnie usuń przegrodę, aby odsłonić terminacje.

Poniżej przedstawiamy powiększony obraz procesu usuwania przegrody za pomocą pęsety nr 3 oraz skalpela. Ostrożnie usuń zakończenia wyścielone nabłonkiem tłuszczowym. Przenieś je do innej posrebrzanej szalki Petriego, używając superprecyzyjnej pęsety nr 55 i skalpela.

Oddziel fragmenty nabłonka węchowego od leżących pod nimi struktur. Przenieś fragmenty nabłonka węchowego do probówki zawierającej 1 ml roztworu Ringera pozbawionego jonów dwuwartościowych. Następnie dodaj papainę.

Przy użyciu mikronozyciór rozdrabnia się nabłonek; inkubuje się go w temperaturze pokojowej przez trzy minuty, a następnie delikatnie rozdrabnia ponownie mikronozyciórami. Po odczekaniu dodatkowych pięciu minut, za pomocą wypalonem płomieniem pipety Pasteura z szerokim otworem, przenosi się zawartość do probówki zawierającej roztwór zatrzymujący i wiruje przez pięć minut, a następnie odrzuca nadsącz. Dodaje się około 1 mL roztworu Ringera z filtrem i delikatnie miesza wypaloną płomieniem pipetą Pasteura o średnicy otworu około 1 mm.

Przenieś roztwór zawierający komórki do trzech szklanych naczyń z płaskim dnem i pozostaw komórki do osadzenia na około jedną godzinę w temperaturze 4 °C. Następnie dodaj roztwór Ringera.

Pracuj przy przyciemnionym świetle, aby uniknąć degradacji związków klatkowych pod wpływem światła otoczenia. Nanieś kroplę olejku imersyjnego na obiektyw 100 x. Umieść naczynie z dna szklanego zawierające dysocjowane neurony sensoryczne narządu jamistego na stoliku odwróconego mikroskopu perfu.

Z roztworem Ringera. Strzykawkę zawierającą roztwór wewnątrzkomórkowy z związkami klatkowymi należy zabezpieczyć przed światłem folią aluminiową i przechowywać w lodówce. Należy odnaleźć odizolowany neuron sensoryczny węchowy z nienaruszonymi rzęskami.

Przesuń stolik mikroskopu tak, aby obszar Cary znalazł się wewnątrz obszaru zaznaczonego na monitorze. W celu zlokalizowania obszaru błysku UV, napełnij pipetę do patch-clampu roztworem wewnątrzkomórkowym zawierającym związek klatkowy. Wprowadź pipetę do uchwytu głowicy wzmacniacza Apache clamp.

Stosując standardowe techniki patch-clamp, zbliżamy pipetę do somy neuronu i uzyskujemy giga-uszczelnienie (giga seal). Następnie, za pomocą komputera, przechodzimy w tryb whole-cell.

Uruchom protokół stymulacji i zarejestruj odpowiedź. Typowy protokół stymulacji polega na utrzymaniu napięcia na stałej wartości i wyzwoleniu błysku UV w celu lizy związku w klatce. Teraz przedstawimy kilka reprezentatywnych zapisów; tutaj widoczna jest odpowiedź izolowanego neuronu sensorycznego z zwoju korzenia grzbietowego myszy na lizę klatki cAMP.

Strzałka u góry wskazuje moment wyzwolenia błysku UV. Prąd aktywowany przez Cycl MP rejestrowano przy potencjale -60 mV w pozakomórkowym roztworze Ringera o niskiej zawartości wapnia. Faza wzrostu prądu była szybka i została dopasowana do pojedynczej funkcji wykładniczej.

Tutaj widzimy zapis z tego samego neuronu w normalnym roztworze Ringera, który zawiera 1 mM wapnia. Faza wzrostowa prądu przy -60 mV stała się znacznie niższa i wielofazowa. Jest to spowodowane działaniem wapnia wnikającego przez kanały sterowane przez cAMP, co aktywuje wtórny prąd chlorkowy.

W tym przykładzie zastosowaliśmy clamp napięcia na poziomie +60 mV. Jest to kolejna metoda ograniczania napływu wapnia. Faza wzrostowa odpowiedzi wywołanej odklatkowaniem cyclone PN przy +60 mV była dobrze opisana przez pojedynczą funkcję wykładniczą, co wskazuje na obecność tylko jednej składowej prądu.

Przykład odpowiedzi uzyskanych poprzez fotowyzwolenie wapnia wewnątrz Celia przedstawiono na rysunku; prąd ten jest przenoszony przez jony chlorkowe. Napięcie wynosiło -50 mV. Odpowiedzi o zwiększających się amplitudach zostały wywołane fotowyzwoleniem klatkowanego wapnia za pomocą błysków UV o rosnącym natężeniu.

Właśnie pokazaliśmy, jak rejestrować sygnały z odizolowanych neuronów sensorycznych zworkowych podczas wykonywania tej procedury. Ważne jest, aby pamiętać o zachowaniu dużej cierpliwości. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymencie.