Name: Fotoliza błyskawiczna związków w klatkach w rzęskach węchowych neuronów czuciowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: Poznaj metodę fotolizy związków w klatkach w neuronach czuciowych myszy przy użyciu techniki patch-clamp. Ta technika umożliwia precyzyjne badanie mechanizmów transdukcji węchowej i aktywacji kanałów zależnych od cyklicznych nukleotydów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Ellis-Davies, G. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caged+compounds%3A+photorelease+technology+for+control+of+cellular+chemistry+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology.</a> Nat. Methods. 4, 619-628 (2007).</li>
<li>Pifferi, S., Boccaccio, A., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+nucleotide-gated+ion+channels+in+sensory+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Cyclic nucleotide-gated ion channels in sensory transduction.</a> FEBS Lett. 580, 2853-2859 (2006).</li>
<li>Bozza, T. C., Kauer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+response+properties+of+convergent+olfactory+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odorant response properties of convergent olfactory receptor neurons.</a> J. Neurosci. 18, 4560-4569 (1998).</li>
<li>Hagen, V., Bendig, J., Frings, S., Eckardt, T., Helm, S., Reuter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient+and+Ultrafast+Phototriggers+for+cAMP+and+cGMP+by+Using+Long-Wavelength+UV%2FVis-Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient and Ultrafast Phototriggers for cAMP and cGMP by Using Long-Wavelength UV/Vis-Activation.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 1045-1048 (2001).</li>
<li>Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolabile+chelators+for+the+rapid+photorelease+of+divalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 6571-6575 (1988).</li>
<li>Rapp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flash+lamp-based+irradiation+of+caged+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Flash lamp-based irradiation of caged compounds.</a> Methods. Enzymol. 291, 202-222 (1998).</li>
<li>Gurney, A. M. Flash photolysis of caged compounds. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGurney%2C+AM+%22Microelectrodes%3A+Theory+and+Applications%22">Microelectrodes: Theory and Applications</a>. Montenegro, I., Queiros, M. A., Daschbach, J. L. , Proc. NATO Adv. Study Inst. Portugal. (1991).</li>
<li>Lagostena, L., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+recordings+and+photolysis+of+caged+compounds+in+olfactory+sensory+neurons+isolated+from+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Senses%22%5BJournal%5D)">Whole-cell recordings and photolysis of caged compounds in olfactory sensory neurons isolated from the mouse.</a> Chem. Senses. 28, 705-716 (2003).</li>
<li>Boccaccio, A., Lagostena, L., Hagen, V., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+adaptation+in+mouse+olfactory+sensory+neurons+does+not+require+the+activity+of+phosphodiesterase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fast adaptation in mouse olfactory sensory neurons does not require the activity of phosphodiesterase.</a> J. Gen. Physiol. 128, 171-184 (2006).</li>
<li>Boccaccio, A., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+development+of+cyclic+nucleotide-gated+and+Ca2%2B+-activated+Cl-+currents+in+isolated+mouse+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Temporal development of cyclic nucleotide-gated and Ca2+ -activated Cl- currents in isolated mouse olfactory sensory neurons.</a> J. Neurophysiol. 98, 153-160 (2007).</li>
<li>Sagheddu, C., Boccaccio, A., Dibattista, M., Montani, G., Tirindelli, R., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+concentration+jumps+reveal+dynamic+ion+selectivity+of+calcium-activated+chloride+currents+in+mouse+olfactory+sensory+neurons+and+TMEM16B-transfected+HEK+293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium concentration jumps reveal dynamic ion selectivity of calcium-activated chloride currents in mouse olfactory sensory neurons and TMEM16B-transfected HEK 293T cells.</a> J. Physiol. 588, 4189-4204 (2010).</li>
<li>Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+and+Functional+Analysis+of+Ion+Channels+Heterologously+Expressed+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells.</a> J. Vis. Exp. (44), e2189-e2189 (2010).</li>
<li>Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+Responses+of+Mouse+Olfactory+Sensory+Neurons+Using+the+Air-phase+Electroolfactogram+Recording%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording.</a> J. Vis. Exp. (37), e1850-e1850 (2010).</li>
<li>Bernardinelli, Y., Haeberli, C., Chatton, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flash+photolysis+using+a+light+emitting+diode%3A+an+efficient%2C+compact%2C+and+affordable+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Calcium%22%5BJournal%5D)">Flash photolysis using a light emitting diode: an efficient, compact, and affordable solution.</a> Cell. Calcium. 37, 565-572 (2005).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Fotoliza błyskowa związków w klatkach (caged compounds) połączona z rejestracją metodą patch-clamp jest użyteczną techniką pozwalającą na uzyskanie szybkich i lokalnych skoków stężenia fizjologicznie czynnych cząsteczek zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz komórek. Zsyntetyzowano kilka rodzajów związków w klatkach1, a technikę tę można stosować w odniesieniu do różnych typów komórek, w tym do komórek hodowlanych wykazujących ekspresję kanałów jonowych, które mogą być aktywowane lub modulowane poprzez fotolizę niektórych z...

<table><tbody><tr><td>Moduł adaptera lampy błyskowej do mikroskopu</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>FlashCube 70</td><td></td></tr><tr><td>Stół pneumatyczny</td><td>TMC</td><td>MICRO-g 63-534</td><td></td></tr><tr><td>Digitalizator</td><td>Axon Instruments</td><td>Digidata 1322A</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji danych</td><td>Axon Instruments</td><td>pClamp 8</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy danych</td><td>WaveMetrics</td><td>Igor</td><td></td></tr><tr><td>Lustro do modułu adaptera</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>M70/100</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt elektrody</td><td>Axon Instruments</td><td>1-HL-U</td><td></td></tr><tr><td>Faraday&amp;rsquo;klatka S</td><td>Wykonany na zamówienie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kostka filtracyjna</td><td>Olympus Corporation</td><td>U-MWU</td><td>Usunięto filtr wzbudzenia</td></tr><tr><td>Lampa błyskowa</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>JML-C2</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta Dumont #55 </td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>14099</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary szklane </td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>PG10165-4</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko z dnem szklanym</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Oświetlacz</td><td>Olympus Corporation</td><td>Highlight 3100</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Olympus Corporation</td><td>IX70</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulatory </td><td>Luigs &amp;amp; Neumann</td><td>SM I</td><td></td></tr><tr><td>Wytwarzarka mikropipet </td><td>Narishige International</td><td>PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Monitorowanie</td><td>HesaVision</td><td>MTB-01</td><td></td></tr><tr><td>Filtry neutralnej gęstości</td><td>Omega Optical</td><td>zróżnicowany</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw 100X</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Fluar 440285</td><td>Zeiss lub Olympus </td></tr><tr><td>Obiektyw 100X</td><td>Olympus Corporation</td><td>UPLFLN 100XOI2</td><td>Zeiss lub Olympus</td></tr><tr><td>Optyczny filtr UV krótkoprzepustowy </td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>SP400</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz patch-clamp</td><td>Axon Instruments</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>Zespół fotodiody </td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>PDA</td><td></td></tr><tr><td>Kwarcowy światłowód</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>zmienia się</td><td>Używamy 600 &amp;#x03BC;średnica m</td></tr><tr><td>Drut srebrny</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>AGT1025</td><td></td></tr><tr><td>Srebrny pellet mielony</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1309</td><td></td></tr><tr><td>Lampa ksenonowa łukowa</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>XBL-JML</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td></td></tr><tr><td>cAMP w klatce BCMCM</td><td>BioLog</td><td>B016</td><td></td></tr><tr><td>Seryjowa albumina bydlęca (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806</td><td></td></tr><tr><td>roztwór wzorcowy CaCl2 0,1 M</td><td>Fluka</td><td>21059</td><td></td></tr><tr><td>Klatkowany Ca: DMNP-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>D6814</td><td></td></tr><tr><td>Cysteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9768</td><td></td></tr><tr><td>Konkanawalina A typu V (ConA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7275</td><td></td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4036</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DNaza I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1767</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptyna </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0649</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fluka</td><td>63020</td><td></td></tr><tr><td>Papaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3125</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lizyna </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1274</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>pirogronian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr></tbody></table>

fotoliza błyskowa związków klatkowych w rzęskach neuronów sensorycznych węchu

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Fotoliza związków klatkowych umożliwia gwałtowny i miejscowy wzrost stężenia różnych związków aktywnych fizjologicznie1. Związki klatkowe to cząsteczki, które zostały uczynione nieaktywnymi fizjologicznie poprzez chemiczną klatkę, którą można rozbić za pomocą błysku światła ultrafioletowego. W niniejszej pracy pokazujemy, jak przeprowadzić rejestrację metodą patch-clamp w połączeniu z fotolizą związków klatkowych w celu badania transdukcji węchowej w dysocjowanych neuronach sensorycznych węchu myszy. Proces transdukcji węchowej (Rysunek 1) zachodzi w rzęskach neuronów sensorycznych węchu, gdzie wiązanie odorantów z receptorami prowadzi do wzrostu poziomu cAMP, co otwiera kanały cyklicznych nukleotydów (CNG)2. Wpływ Ca przez kanały CNG aktywuje kanały Cl aktywowane przez Ca. Pokazujemy, jak dysocjować neurony z nabłonka węchowego myszy3 oraz jak aktywować kanały CNG lub kanały Cl aktywowane przez Ca poprzez fotolizę klatkowego cAMP4 lub klatkowego Ca5. Używamy lampy błyskowej6,7 do aplikowania błysków ultrafioletowych do obszaru rzęsek w celu uwolnienia cAMP lub Ca, podczas gdy rejestracja patch-clamp służy do pomiaru prądu w konfiguracji whole-cell voltage-clamp8-11.

Fotoliza związków klatkowanych pozwala na gwałtowny i zlokalizowany wzrost stężenia różnych związków aktywnych fizjologicznie. W niniejszej pracy przedstawiamy sposób uzyskiwania rejestracji metodą patch-clamp w połączeniu z fotolizą klatkowanego cAMP lub klatkowanego Ca w celu badania transdukcji węchowej w dysocjowanych neuronach sensorycznych węchu myszy.

Fotoliza błyskowa związków klatkowych w rzęskach neuronów sensorycznych węchu

Fotoliza związków w klatkach pozwala na szybkie i miejscowe zwiększenie stężenia różnych związków aktywnych fizjologicznie1. ...

Zmysł węchu pozwala nam wykrywać i rozpoznawać lotne związki chemiczne w środowisku zewnętrznym. Wiążą się one z receptorami w wypustkach neuronów sensorycznych węchu i aktywują kaskadę transdukcji, która prowadzi do otwarcia kanałów bramkowanych cyklicznymi nukleotydami, a następnie kanałów chlorkowych aktywowanych wapniem. Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie sposobu bezpośredniej aktywacji tych kanałów za pomocą fotolizy związków klatkowych; związki klatkowe to cząsteczki uczynione fizjologicznie nieaktywnymi poprzez chemiczną klatkę.Błysk światła ultrafioletowego rozbija klatkę i uwalnia fizjologicznie aktywne związki uwięzione w klatkach. Cycl, mp lub uwięziony wapń są zawarte w roztworze wewnątrzkomórkowym, wypełniającym pipetę do patch-clampu, i dyfundują do cytoplazmy neuronów sensorycznych węchu. Ultra-błysk jest aplikowany do obszaru klatki, aby uwolnić cycling, MP lub wapń, podczas gdy rejestracje techniką patch-clamp w konfiguracji whole-cell voltage clamp są prowadzone w celu pomiaru prądu.Witajcie. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę rejestracji metodą patch-clamp połączoną z analizą polityki FE związków klatkowych. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania kanałów sterowanych przez CMP oraz kanałów cholinergicznych aktywowanych wapniem w neuronach sensorycznych węchu. Zatem zacznijmy.Zastosowany tutaj system rejestracji metodą patch clamp obejmuje mikroskop odwrócony, system perfuzji, mikromanipulator, elektrodę rejestrującą oraz elektrodę odniesienia podłączoną do głowicy wzmacniacza patch clamp; całość zamontowano na stole antywibracyjnym wewnątrz klatki Faradaya. Wzmacniacz patch clamp jest połączony z digityzerem w komputerze wyposażonym w oprogramowanie do akwizycji danych. Do generowania błysków światła ultrafioletowego o wysokiej intensywności używamy lampy błyskowej Excelon.Błysk światła można wyzwolić ręcznie lub komputerowo, korzystając z tego samego oprogramowania, które steruje akwizycją elektrofizjologiczną. Najlepsze długości fal do eksperymentów fotostymulacyjnych wybiera się poprzez wstawienie filtra UV do gniazda wyjściowego lub lampy błyskowej. Intensywność błysku światła można modyfikować, zmieniając napięcie lub pojemność lampy błyskowej.Bardziej precyzyjną kontrolę natężenia światła uzyskuje się poprzez umieszczenie filtrów neutralnych w drugim slocie wyjściowym lampy błyskowej. Błysk światła jest kierowany do neuronów wysianych na szalkach z dnem szklanym za pomocą kwarcowego światłowodu. Światłowód jest podłączony do przystawki do fluorescencji epi w mikroskopie odwróconym.Za pomocą adaptera zmodyfikowany kostnik filtracyjny bez filtra wzbudzenia kieruje wiązkę UV na neuron poprzez lustro dichroiczne. Światło jest ogniskowane przez obiektyw imersyjny 100 x. Obszar pokryty tkanką jest wizualizowany poprzez wprowadzenie światłowodu do iluminatora.Obraz jest wyświetlany na monitorze za pomocą kamery CCD podłączonej do mikroskopu. Na monitorze wyznacza się obszar kontrolny, aby zlokalizować obszar UV ciała przed przeprowadzeniem sekcji; przygotowuje się trzy szalki z szklanym dnem pokryte conna a i poly. W celu przygotowania do sekcji, dwie szalki Petriego o średnicy 50 mm pokryte cukrem napełnia się roztworem Ringera.Umieścić je w lodzie. Należy również schłodzić. Następnie zmieszać 0,5 ml roztworu stop mix z strzykawką zawierającą około 10 ml roztworu Ringera.Zacznij od uśpionej myszy. Usuń skórę z linii czaszki, nacinając wzdłuż linii żuchwy, a następnie umieść głowę w posrebrzanej szalce Petriego. Umieść szalkę pod stereomikroskopem i za pomocą skalpela wykonaj cięcie strzałkowe.Przetnij głowę wzdłuż linii środkowej. Obróć połowę głowy stroną przyśrodkową do góry. Ostrożnie usuń przegrodę, aby odsłonić terminacje.Poniżej przedstawiamy powiększony obraz procesu usuwania przegrody za pomocą pęsety nr 3 oraz skalpela. Ostrożnie usuń zakończenia wyścielone nabłonkiem tłuszczowym. Przenieś je do innej posrebrzanej szalki Petriego, używając superprecyzyjnej pęsety nr 55 i skalpela.Oddziel fragmenty nabłonka węchowego od leżących pod nimi struktur. Przenieś fragmenty nabłonka węchowego do probówki zawierającej 1 ml roztworu Ringera pozbawionego jonów dwuwartościowych. Następnie dodaj papainę.Przy użyciu mikronozyciór rozdrabnia się nabłonek; inkubuje się go w temperaturze pokojowej przez trzy minuty, a następnie delikatnie rozdrabnia ponownie mikronozyciórami. Po odczekaniu dodatkowych pięciu minut, za pomocą wypalonem płomieniem pipety Pasteura z szerokim otworem, przenosi się zawartość do probówki zawierającej roztwór zatrzymujący i wiruje przez pięć minut, a następnie odrzuca nadsącz. Dodaje się około 1 mL roztworu Ringera z filtrem i delikatnie miesza wypaloną płomieniem pipetą Pasteura o średnicy otworu około 1 mm.Przenieś roztwór zawierający komórki do trzech szklanych naczyń z płaskim dnem i pozostaw komórki do osadzenia na około jedną godzinę w temperaturze 4 °C. Następnie dodaj roztwór Ringera.Pracuj przy przyciemnionym świetle, aby uniknąć degradacji związków klatkowych pod wpływem światła otoczenia. Nanieś kroplę olejku imersyjnego na obiektyw 100 x. Umieść naczynie z dna szklanego zawierające dysocjowane neurony sensoryczne narządu jamistego na stoliku odwróconego mikroskopu perfu.Z roztworem Ringera. Strzykawkę zawierającą roztwór wewnątrzkomórkowy z związkami klatkowymi należy zabezpieczyć przed światłem folią aluminiową i przechowywać w lodówce. Należy odnaleźć odizolowany neuron sensoryczny węchowy z nienaruszonymi rzęskami.Przesuń stolik mikroskopu tak, aby obszar Cary znalazł się wewnątrz obszaru zaznaczonego na monitorze. W celu zlokalizowania obszaru błysku UV, napełnij pipetę do patch-clampu roztworem wewnątrzkomórkowym zawierającym związek klatkowy. Wprowadź pipetę do uchwytu głowicy wzmacniacza Apache clamp.Stosując standardowe techniki patch-clamp, zbliżamy pipetę do somy neuronu i uzyskujemy giga-uszczelnienie (giga seal). Następnie, za pomocą komputera, przechodzimy w tryb whole-cell.Uruchom protokół stymulacji i zarejestruj odpowiedź. Typowy protokół stymulacji polega na utrzymaniu napięcia na stałej wartości i wyzwoleniu błysku UV w celu lizy związku w klatce. Teraz przedstawimy kilka reprezentatywnych zapisów; tutaj widoczna jest odpowiedź izolowanego neuronu sensorycznego z zwoju korzenia grzbietowego myszy na lizę klatki cAMP.Strzałka u góry wskazuje moment wyzwolenia błysku UV. Prąd aktywowany przez Cycl MP rejestrowano przy potencjale -60 mV w pozakomórkowym roztworze Ringera o niskiej zawartości wapnia. Faza wzrostu prądu była szybka i została dopasowana do pojedynczej funkcji wykładniczej.Tutaj widzimy zapis z tego samego neuronu w normalnym roztworze Ringera, który zawiera 1 mM wapnia. Faza wzrostowa prądu przy -60 mV stała się znacznie niższa i wielofazowa. Jest to spowodowane działaniem wapnia wnikającego przez kanały sterowane przez cAMP, co aktywuje wtórny prąd chlorkowy.W tym przykładzie zastosowaliśmy clamp napięcia na poziomie +60 mV. Jest to kolejna metoda ograniczania napływu wapnia. Faza wzrostowa odpowiedzi wywołanej odklatkowaniem cyclone PN przy +60 mV była dobrze opisana przez pojedynczą funkcję wykładniczą, co wskazuje na obecność tylko jednej składowej prądu.Przykład odpowiedzi uzyskanych poprzez fotowyzwolenie wapnia wewnątrz Celia przedstawiono na rysunku; prąd ten jest przenoszony przez jony chlorkowe. Napięcie wynosiło -50 mV. Odpowiedzi o zwiększających się amplitudach zostały wywołane fotowyzwoleniem klatkowanego wapnia za pomocą błysków UV o rosnącym natężeniu.Właśnie pokazaliśmy, jak rejestrować sygnały z odizolowanych neuronów sensorycznych zworkowych podczas wykonywania tej procedury. Ważne jest, aby pamiętać o zachowaniu dużej cierpliwości. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymencie.

flash-photolysis-caged-compounds-cilia-olfactory-sensory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Fotoliza błyskawiczna związków w klatkach w rzęskach węchowych neuronów czuciowych

Mikroskopia wielofotonowa umożliwia sterowanie fotonami o niskiej energii przy głębokiej penetracji optycznej i zredukowanej fototoksyczności. Opisujemy zastosowanie tej technologii do znakowania żywych komórek w embrionach danio pręgowanego. Protokół ten można łatwo dostosować do fotoindukcji różnych cząsteczek reagujących na światło.

Fotoaktywacja oparta na dwufotonach w żywych zarodkach danio pręgowanego

Opisano metodę przygotowania pojedynczych żywych fotoreceptorów z różnych gatunków kręgowców do obrazowania fluorescencyjnego. Metoda ta może być wykorzystana do obrazowania fluorescencji endogennych fluoroforów, takich jak NADH lub witamina A, bądź egzogennych barwników fluorescencyjnych wrażliwych na Ca2+ lub inne czynniki.

Przygotowanie żywych, wyizolowanych fotoreceptorów kręgowców do obrazowania fluorescencyjnego

Opisujemy uznaną technikę pomiaru i analizy odpowiedzi wapniowych wywołanych zapachami w płacie antennym żywych Drosophila melanogaster.

Obrazowanie wapniowe odpowiedzi wywołanych zapachami w płacie antennym Drosophila

Niniejszy artykuł przedstawia protokoły obrazowania wrodzonych sygnałów optycznych oraz sygnałów autofluorescencji flawoprotein w celu mapowania aktywności wywołanej zapachami na powierzchni opolpacha u myszy.

Obrazowanie aktywności wywołanej zapachami w opoliach myszy z wykorzystaniem sygnałów odbicia optycznego i autofluorescencji

Neurony powstałe w wieku dorosłym wykazujące ekspresję ChR2 mogą być manipulowane w preparatach elektrofizjologicznych w plastrach tkankowych w celu zbadania ich wkładu w funkcjonowanie węchowych obwodów neuronalnych.

Wykorzystanie przystępnych cenowo mat LED do fotostymulacji neuronów

Ten film demonstruje metodę obrazowania wapnia in vivo za pomocą synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia u muszek. Przedstawia etapy przygotowania muszek do mikroskopii, przeprowadzania kondycjonowania węchowego i wizualizacji napływu wapnia wywołanego zapachem.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia za pomocą synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia u Drosophila melanogaster

Dzięki małemu, przezroczystemu ciału, dobrze udokumentowanej neuroanatomii i mnóstwu podatnych technik genetycznych i odczynników, C. elegans stanowi idealny organizm modelowy do obrazowania neuronów in vivo przy użyciu stosunkowo prostych, tanich technik. Tutaj opisujemy obrazowanie pojedynczego neuronu u nienaruszonych dorosłych zwierząt przy użyciu genetycznie kodowanych fluorescencyjnych wskaźników wapnia.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów u C. elegans

Opisujemy połączenie ogniskowej fotoaktywacji związków neuroaktywnych wywołanej promieniowaniem UV z całokomórkowym patch-clampem i wielofotonowym obrazowaniem wewnątrzkomórkowych tranustów sodu w dendrytach i kolcach neuronów hipokampa w ostrych wycinkach tkanki mózgu myszy.

Wielofotonowe wewnątrzkomórkowe obrazowanie sodu w połączeniu z ogniskowym rozpakowywaniem glutaminianu za pośrednictwem promieniowania UV w neuronach piramidowych CA1

Opracowaliśmy nowatorską technikę w mikroskopii elektronowej, "flash-and-freeze", która umożliwia wizualizację dynamiki membrany z rozdzielczością czasową ms. Technika ta łączy optogenetyczną stymulację neuronów z zamrażaniem pod wysokim ciśnieniem. W tym miejscu demonstrujemy procedury i szczegółowo opisujemy protokoły.

Flash-and-Freeze: nowatorska technika uchwycenia dynamiki membrany za pomocą mikroskopii elektronowej

Cykl pęcherzyków synaptycznych (SV) jest podstawowym mechanizmem komunikacji międzykomórkowej w synapsach neuronalnych. Wychwyt i uwalnianie barwnika FM są podstawowymi sposobami ilościowego oznaczania endo- i egzocytozy SV. Tutaj porównujemy wszystkie metody stymulacji w celu napędzania cyklu FM1-43 w synapsie modelu połączenia nerwowo-mięśniowego Drosophila (NMJ).

Cykl barwnika FM w synapsie: porównanie wysokiej depolaryzacji potasu, stymulacji elektrycznej i rodopsyny kanałowej

Tutaj prezentujemy protokół, za pomocą którego można wizualizować wapń pre- i/lub postsynaptyczny w kontekście uczenia się i zapamiętywania Drosophila. Obrazowanie wapnia in vivo przy użyciu synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia jest połączone z klasycznym paradygmatem warunkowania węchowego, dzięki czemu można określić plastyczność synaptyczną leżącą u podstaw tego typu uczenia się asocjacyjnego.

Optyczne obrazowanie wapnia in vivo plastyczności synaptycznej indukowanej uczeniem się u Drosophila melanogaster

Poznaj metodę fotolizy związków w klatkach w neuronach czuciowych myszy przy użyciu techniki patch-clamp. Ta technika umożliwia precyzyjne badanie mechanizmów transdukcji węchowej i aktywacji kanałów zależnych od cyklicznych nukleotydów.

Fotoliza błyskowa związków klatkowych w rzęskach neuronów sensorycznych węchu

Przeglądaj więcej filmów