Name: Technologia wysiewu autologicznych komórek progenitorowych śródbłonka i testy biokompatybilności urządzeń sercowo-naczyniowych w dużym modelu zwierzęcym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Poznaj technologię wysiewu autologicznych komórek progenitorowych śródbłonka na implanty tytanowe w celu zwiększenia biokompatybilności i zapobiegania zakrzepicy w dużym modelu zwierzęcym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować firmie Leica Microsystems za cenne wskazówki dotyczące obrazowania przekrojów tytanowych oraz firmie Gemini Bio-Products za dostarczenie surowicy wieprzowej wykorzystanej w niniejszym badaniu. Dziękujemy również NIH za wsparcie w ramach grantu „Autologous EPC lining to improve biocompatibility of circulatory assist devices”, RC1HL099863-01. Ponadto jesteśmy wdzięczni National Science Foundation Graduate Research Fellowship za wsparcie Alexandry Jantzen. Chcielibyśmy również podziękować George'owi Quickowi, Mike'owi Lowe'owi i Ianthii Parker za pomoc w wielu aspektach procedury chirurgicznej oraz w obsłudze zwierząt badawczych. Steven Owen okazał się nieoceniony w obróbce wielu elementów naszego urządzenia do zasiewania komórek oraz w cięciu rurek tytanowych.

<ol><li>Achneck, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+bleeding+and+clotting+in+the+cardiac+surgery+patient%3A+from+vascular+endothelium+to+circulatory+assist+device+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of bleeding and clotting in the cardiac surgery patient: from vascular endothelium to circulatory assist device surface.</a> Circulation. 122, 2068-2077 (2010).</li>
<li>Achneck, H. E., Sileshi, B., Lawson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+the+biology+of+bleeding+and+clotting+in+the+surgical+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular%22%5BJournal%5D)">Review of the biology of bleeding and clotting in the surgical patient.</a> Vascular. 16, 6-13 (2008).</li>
<li>Arvidsson, S., Askendal, A., Tengvall, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+plasma+contact+activation+on+silicon%2C+titanium+and+aluminium%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Blood plasma contact activation on silicon, titanium and aluminium.</a> Biomaterials. 28, 1346-1354 (2007).</li>
<li>Achneck, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biocompatibility+of+titanium+cardiovascular+devices+seeded+with+autologous+blood-derived+endothelial+progenitor+cells%3A+EPC-seeded+antithrombotic+Ti+Implants%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The biocompatibility of titanium cardiovascular devices seeded with autologous blood-derived endothelial progenitor cells: EPC-seeded antithrombotic Ti Implants.</a> Biomaterials. 32, 10-18 (2011).</li>
<li>Kang, C., Bonneau, M., Brouland, J. P., Bal dit Sollier, C., Drouet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+pig+models+of+venous+thrombosis+mimicking+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">In vivo pig models of venous thrombosis mimicking human disease.</a> Thromb Haemost. 89, 256-263 (2003).</li>
<li>Ueberrueck, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+ovine+and+porcine+animal+models+for+biocompatibility+testing+of+vascular+prostheses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of the ovine and porcine animal models for biocompatibility testing of vascular prostheses.</a> J Surg Res. 124, 305-311 (2005).</li>
<li>Velik-Salchner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+values+for+thrombelastography+%28ROTEM%29+and+selected+coagulation+parameters+in+porcine+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Normal values for thrombelastography (ROTEM) and selected coagulation parameters in porcine blood.</a> Thromb Res. 117, 597-602 (2006).</li>
<li>Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cell+principals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109, 1801-1809 (2007).</li>
<li>Achneck, H. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAchneck%2C+HE+%22American+Heart+Association+Scientific+Sessions%2C+Abstract+Oral+Sessions%2C+Medical+Aspects+End+Stage+Heart+Failure%3A+Transplantation+and+Device+Therapies%22">American Heart Association Scientific Sessions, Abstract Oral Sessions, Medical Aspects End Stage Heart Failure: Transplantation and Device Therapies</a>. , (2010).</li>
<li>Achneck, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerating+titanium+ventricular+assist+device+surfaces+after+gold%2Fpalladium+coating+for+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Regenerating titanium ventricular assist device surfaces after gold/palladium coating for scanning electron microscopy.</a> Microsc Res Tech. 73, 71-76 (2010).</li>
<li>Ford, J. W., Welling, T. H., Stanley, J. C., Messina, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKH26+and+125I-PKH95%3A+characterization+and+efficacy+as+labels+for+in+vitro+and+in+vivo+endothelial+cell+localization+and+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">PKH26 and 125I-PKH95: characterization and efficacy as labels for in vitro and in vivo endothelial cell localization and tracking.</a> J Surg Res. 62, 23-28 (1996).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiona tutaj metoda zasiewania komórek w rurkach z Ti umożliwia lekarzom i naukowcom szybką i jednorodną endotelializację powierzchni urządzeń implantowalnych mających kontakt z krwią. Ponieważ izolujemy i namnażamy EPC z próbek krwi obwodowej, pozyskanie tych komórek nie wymaga przeprowadzenia żadnego poważnego zabiegu inwazyjnego. Co więcej, EPC są autologiczne, dzięki czemu eliminuje się ryzyko wystąpienia reakcji immunologicznej na implant z zasianymi komórkami. Zasady zaprezentowane w tym protokole mogą być wykorzystane nie tylko w przypadku rurek z Ti, ale także dla wielu innych biomateriałów stosowanych w medycynie naczyniowej i kardiologii.
Kluczowymi etapami niniejszego protokołu są drobiazgowe czyszczenie rurek Ti, ponieważ stwierdzono, że każda przylegająca warstwa zanieczyszczeń upośledza adhezję komórek. Ponadto podczas procesu wysiewania niezbędna jest niska prędkość obrotu (odwrotnie proporcjonalna do średnicy rurki), aby EPC mogły powoli osiadać i przylegać do powierzchni podczas ruchu rurki Ti.
Nasza metoda wysiewania bezpośrednio przed implantacją pozwala uniknąć niepraktycznego czasu hodowli ex vivo; komórki przylegają indywidualnie, a następnie tworzą zwartą warstwę in vivo, co eliminuje ryzyko embolizacji w postaci płata bezpośrednio po przywróceniu przepływu. Nasze wcześniejsze badania wykazały, że po osiągnięciu przez EPCs stanu konfluencji tworzą one macierz zewnątrzkomórkową, do której trwale przylegają, co dodatkowo minimalizuje możliwość złuszczenia warstwy śródbłonka. Choć nie można całkowicie wykluczyć możliwości odrywania się zatorów, ryzyko to wydaje się być wielokrotnie niższe niż ryzyko zakrzepicy całej powierzchni urządzenia, której zapobieganie jest celem tej terapii.
Nasze podejście polegające na implantacji do środowiska o niskim ścinaniu i prozakrzepowym w obrębie żyły głównej dolnej wykorzystuje jeden z najbardziej sprawdzonych modeli dużych zwierząt do badania kompatybilności krwi oraz zakrzepicy urządzeń5,6. Należy zaznaczyć, że wszelka opieka nad zwierzętami i eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institute of Health dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych i wyłącznie po zatwierdzeniu przez Institutional Animal Care and Use Committee Uniwersytetu Duke.
Aby skutecznie wykorzystać tę metodę implantacji do testowania biomateriałów i urządzeń, ważne jest cierpliwe oczyszczenie z tkanek segmentu IVC oraz podwiązanie wszystkich odgałęzień żylnych w przygotowaniu do wprowadzenia urządzenia, tak aby krwawienie wokół urządzenia nie pochodziło z tzw. „fałszywego światła”. Kolejnym krytycznym krokiem jest dodanie DPBS do światła urządzenia, tak aby komórki na wewnętrznej powierzchni rurki pozostały wilgotne podczas zamykania wenotomii i przed rozpoczęciem reperfuzji. Jeśli urządzenie nie zostanie odnalezione w miejscu implantacji, mogło ono przemieścić się „w górę” IVC. Można temu zapobiec, przeprowadzając szew (4-O Prolene) przez ścianę żyły oraz przez odcinek rurki PVC o długości 2 – 3 mm, tak aby rurka była mocno zakotwiczona w obecnym położeniu. W przypadku gdy badacz ma trudności z odnalezieniem uprzednio znakowanych fluorescencyjnie komórek pokazanych na Rysunku 8 po eksplantacji z w innym stopniu drożnej rurki, prawdopodobne jest, że komórki oddzieliły się w postaci spójnej warstwy. Można temu zapobiec poprzez bardzo delikatną dyssekcję otaczającej żyły i demontaż 3 sekcji rurki z Ti, po uprzednim utrwaleniu żyły wraz z rurką.
Nasza technologia stanowi dowód koncepcji zapobiegania zakrzepicy urządzeń sercowo-naczyniowych poprzez zasiew EPC. Technologia ta może zostać wykorzystana w opracowywaniu implantów „biogennych” wyściełanych własnymi endotelialnymi komórkami progenitorowymi pacjentów. Badanie wykonalności w naszym modelu zwierzęcym na świniach stanowi pierwsze kroki w kierunku przeniesienia tej „medycyny personalizowanej” do praktyki klinicznej.

<table><tbody><tr><td>Acepromazyna</td><td>Boehringer Ingeheim</td><td>BIC670025</td><td>NAC# 10280002</td></tr><tr><td>Precyzyjny środek czyszczący Alconox Powered Precision Cleaner</td><td>Alconox, Inc.</td><td>1104</td><td></td></tr><tr><td>Retraktor chirurgiczny Balfoura</td><td>Adler</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Baytril</td><td>Bayer AG</td><td>APVMA 46028/0705</td><td></td></tr><tr><td>Igła motylkowa (19G)</td><td>Terumo Medical Corp.</td><td>SV19CLK</td><td></td></tr><tr><td>Chlorheksydyna</td><td>3M</td><td>9200</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki (45 stopni)</td><td>Aesculap</td><td>FC339T</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (-/-)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (+/+)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>DuraPrep</td><td>3M</td><td>8635</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka EBM-2</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3156</td><td>Baza dla pożywki bezsurowiczej oraz pełnej pożywki wzrostowej</td></tr><tr><td>EGM-2 SingleQuots</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3162</td><td>Stosowane z EBM-2 dla pożywki bezsurowiczej oraz pełnej pożywki wzrostowej</td></tr><tr><td>Narzędzie do elektrokoagulacji</td><td>Valleylab</td><td>SurgII-20</td><td></td></tr><tr><td>Papier ścierny</td><td>3M</td><td>60-0700-0425-8</td><td>ziarnistość 240</td></tr><tr><td>Roztwór do eutanazji Euthasol</td><td>Virbac Animal Health</td><td></td><td>ANADA #: 200-071</td></tr><tr><td>Plaster z fentanylem</td><td>Actavis</td><td></td><td>NDC # 67767-120-18</td></tr><tr><td>Fluniksyn</td><td>Merck &amp;amp; Co.</td><td></td><td>NAC #: 10470183</td></tr><tr><td>Cewnik Foleya (16F)</td><td>Bard</td><td>730116</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8264-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Opalarka</td><td>Milwaukee</td><td>8988-20</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td></td><td></td><td>NDC #: 25021</td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8889-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Rurka intubacyjna</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>86113</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td></td><td>NDC #13985-030</td></tr><tr><td>Kaniula dożylna (18G)</td><td>BD Biosciences</td><td>381547</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Fort Dodge Animal Health</td><td></td><td>NDC #0856-2013</td></tr><tr><td>Poziomnica</td><td>Swanson</td><td>LLA001</td><td></td></tr><tr><td>Zaślepka do końcówki Luer-Lock</td><td>CML Supply</td><td>909-001</td><td></td></tr><tr><td>Marcaine</td><td>Hospira Inc.</td><td></td><td>NDC #: 0409-1560-10</td></tr><tr><td>Nożyczki Metzenbauma</td><td>Adler</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowprowadza (5F)</td><td>Galt</td><td>KIT 002-01</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki typu mosquito</td><td>Adler</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Silnik</td><td>Herbach and Rademan</td><td>H1-08</td><td></td></tr><tr><td>Oksymorfon</td><td>Endo Labs</td><td></td><td>NDC: 63481-624-10</td></tr><tr><td>Zestaw barwnika PKH26</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PKH26GL-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Surowica wieprzowa</td><td>Gemini Bio Products</td><td>100-115</td><td>stężenie 2% w pełnej pożywce wzrostowej</td></tr><tr><td>Nożyczki Pottsa</td><td>Adler</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Zszywacz skórny Precise Vista</td><td>3M</td><td>3998</td><td></td></tr><tr><td>Rurka PVC</td><td>McMaster-Carr</td><td>7132K117</td><td>rozszerzona średnica wewnętrzna 15,88 mm,&lt;br/&gt;odzyskana średnica wewnętrzna 7,95 mm</td></tr><tr><td>Kleszczyki kątowe, rozmiar średni</td><td>Adler</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze skalpela (#10-15)</td><td>Bard</td><td>373910</td><td></td></tr><tr><td>Rurka silikonowa</td><td>McMaster-Carr</td><td>51735K26</td><td>średnica zewnętrzna 16,64 mm, średnica wewnętrzna 9,52 mm</td></tr><tr><td>Strzykawka (5 cc)</td><td>BD Biosciences</td><td>309603</td><td></td></tr><tr><td>Tegaderm</td><td>3M</td><td>90001</td><td></td></tr><tr><td>Kurek trójdrożny</td><td>Kendall</td><td>170060</td><td></td></tr><tr><td>Rurka tytanowa (Ti Tube)</td><td>Tico Titanium</td><td>N/A</td><td>Określona jako &amp;#189;&quot; średnicy zewnętrznej, ścianka .065&quot;, średnica wewnętrzna .370&quot;, .1737 lbs/ft</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-5012</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór neutralizujący trypsynę (TNS)</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-5002</td><td>0,03%</td></tr><tr><td>Vetropolycin</td><td>Pharmaderm Animal Health</td><td></td><td>NAC #: 12920110</td></tr><tr><td>Szew Vicryl (3-0)</td><td>Ethicon Inc.</td><td>J808T</td><td></td></tr><tr><td>Myjka ultradźwiękowa w kąpieli wodnej</td><td>Branson</td><td>B200</td><td></td></tr></tbody></table>

technologia zasiewiania autologicznych komórek progenitorowych śródbłonka oraz badanie biokompatybilności urządzeń sercowo-naczyniowych w modelu dużych zwierząt

Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model

Implantowalne urządzenia naczyniowo-sercowe są produkowane z materiałów sztucznych (np. tytanu (Ti), rozszerzonego politetrafluoroetylenu), które niosą ryzyko powstawania zakrzepów zatorowych1,2,3. Opracowaliśmy metodę wykładania wewnętrznej powierzchni rurek z Ti autologicznymi ludzkimi lub świńskimi komórkami progenitorowymi śródbłonka (EPCs) pochodzącymi z krwi4. Poprzez implantację rurek z Ti zawierających zlewne warstwy świńskich EPCs w żyłę główną dolną (IVC) świń, przetestowaliśmy poprawioną biokompatybilność powierzchni zasianej komórkami w prozakrzepowym środowisku dużego modelu zwierzęcego i porównaliśmy ją z niemodyfikowanymi powierzchniami gołego metalu5,6,7 (Rysunek 1). Metoda ta może być wykorzystana do endotelializacji urządzeń w ciągu kilku minut od implantacji oraz do testowania ich funkcji przeciwzakrzepowej in vivo.
Krew obwodową pobrano od świń rasy Yorkshire o masie 50 kg, a jej frakcję komórek mononuklearnych hodowano w celu wyizolowania EPC4,8. Rurki z Ti (średnica wewnętrzna 9,4 mm) przecięto wcześniej na trzy 4,5 cm odcinki wzdłużne i połączono ponownie za pomocą rurek termokurczliwych. Zbudowano urządzenie do zasiewania, które umożliwia powolną rotację rurek z Ti.
U świń wykonano laparotomię, a następnie wypreparowano jelita i pęcherz moczowy. Do odsłonięcia żyły głównej dolnej (IVC) od jej rozwidlenia powyżej prawej tętnicy nerkowej zastosowano ostrą i tępą dyssekcję. Rurki tytanowe (Ti) wypełniono zawiesiną autologicznych komórek EPC znakowanych fluorescencyjnie i obracano z prędkością 10 RPH przez 30 min, aby uzyskać jednorodną powłokę komórkową9. Po podaniu 100 USP/kg heparyny zaklemowano oba końce IVC oraz żyłę lędźwiową. Wykonano wenotomię o długości 4 cm, po czym wprowadzono urządzenie i wypełniono je solą fizjologiczną (PBS). Podczas zamykania wenotomii ciągłym szwem z nici Prolene 4-0, zdjęto jeden zacisk, aby odpowietrzyć IVC. Na koniec zabiegu powięź zszyto nicią 0-PDS (polidoksanon), przestrzeń podskórną zamknięto nicią 2-0 Vicryl, a skórę zamknięto zszywkami. 
Po 3 – 21 dniach świnie zostały poddane eutanazji, a urządzenie wyeksplantowano w całości i utrwalono. Rurki z Ti zostały rozmontowane, a ich powierzchnie wewnętrzne obrazowano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
Stwierdzono, że rurki z gołego tytanu uległy całkowitemu zamknięciu, podczas gdy rurki zasiane komórkami EPC pozostały drożne. Ponadto udało się wykazać obecność konfluencyjnej warstwy EPC na wewnętrznej powierzchni stykającej się z krwią.
Podsumowując, nasza technologia może być wykorzystana do endotelializacji rurek z Ti w ciągu kilku minut od implantacji przy użyciu autologicznych EPC w celu zapobiegania zakrzepicy urządzenia. Nasza metoda chirurgiczna umożliwia testowanie poprawionej biokompatybilności tak zmodyfikowanych urządzeń przy minimalnej utracie krwi i minimalnym naruszeniu powierzchni zasianej komórkami EPC.

Opisano metodę zasiewania autologicznymi komórkami biomateriałów tytanowych mających kontakt z krwią oraz testowania ich biokompatybilności. Metoda ta wykorzystuje komórki progenitorowe śródbłonka oraz rurki tytanowe, zasiewane na kilka minut przed chirurgiczną implantacją do żył głównych świni. Technika ta może zostać dostosowana do wielu innych implantowalnych urządzeń biomedycznych.

Technologia zasiewiania autologicznych komórek progenitorowych śródbłonka oraz badanie biokompatybilności urządzeń sercowo-naczyniowych w modelu dużych zwierząt

Implantowalne urządzenia naczyniowo-sercowe są produkowane z materiałów sztucznych (np. tytanu (Ti), rozszerzonego politetraafloroetylenu), które stwarzają ryzyko ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest zasiedlenie implantów naczyniowych autologicznymi komórkami progenitorowymi śródbłonka pochodzącymi z krwi, a następnie obserwacja wpływu tej terapii na zakrzepicę w modelu dużych zwierząt. Cel ten osiąga się poprzez pobranie próbki krwi obwodowej od świń w celu wyizolowania późnych komórek progenitorowych śródbłonka świni (late outgrowth porcine endothelial progenitor cells). Następnie wykorzystuje się urządzenie implantowalne.Tytanowa rurka w naszym badaniu dowodzącym koncepcji została obsadzona autologicznymi PC. Następnie urządzenie zaimplantowano do żyły głównej dolnej świni. Wyniki wykazują ochronę przed zakrzepicą, co oparto na drożności tytanowej rurki obsadzonej EPC w przeciwieństwie do kontrolnej, niedrożnej rurki z gołego metalu.Klinika chirurgii Uniwersytetu Duke dąży do wspierania przełomowych i innowacyjnych badań. Poniższa prezentacja jest przykładem współpracy międzywydziałowej i interdyscyplinarnej w celu rozwoju medycyny. Dr EK kieruje projektem badawczym nad opracowaniem technologii osadzania komórek, która ma zapobiegać zakrzepicy poprzez wyściełanie powierzchni urządzeń naczyniowych mających kontakt z krwią własnymi komórkami progenitorowymi pacjenta.Ponieważ komórki te zostały pozyskane od tych samych pacjentów, którzy otrzymają implant, unikamy odrzucenia przez układ odpornościowy. Nasz sukces oraz opisane tutaj metody są wynikiem wysiłku całego zespołu. Implantację chirurgiczną zademonstrują Sean Gage z oddziału chirurgii naczyniowej, Whitney Lane, studentka medycyny na Duke University oraz ja.Chciałbym teraz przedstawić Alexandra Janssena, doktoranta z Katedry Inżynierii Biomedycznej, który szczegółowo omówi proces zasiewania komórek. Zademonstruję, jak zasiewać rurki tytanowe endotelialnymi komórkami progenitorowymi pochodzącymi z krwi bezpośrednio przed implantacją w modelu świni. Metoda ta służy jako dowód koncepcji, a te same podstawowe zasady można zastosować do wielu innych urządzeń implantowalnych, takich jak stenty z nitinolu i mechaniczne urządzenia wspomagania krążenia. EPC są izolowane poprzez wysiew frakcji komórek jednojądrowych krwi świń i zazwyczaj pojawiają się po około siedmiu dniach.Można je rozpoznać po typowej morfologii przypominającej brukowanie. Namnażaj EPC do całkowitej liczby 9 milionów komórek w hodowli. Przepłucz przygotowane EPC dwukrotnie w medium bezsurowiczym, dbając o ograniczenie ekspozycji na światło podczas i po znakowaniu.Następnie należy pokryć komórki markerem fluorescencyjnym PKH 26 i odnotować objętość naniesionego roztworu. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez cztery minuty. Przerwać reakcję znakowania, dodając minutę później do roztworu barwnika taką samą objętość surowicy wieprzowej.Rozcieńczyć połączone roztwory w stosunku jeden do jednego pełną pożywką wzrostową. Następnie odessać ciecz i przepłukać komórki trzykrotnie pełną pożywką wzrostową, a następnie dwukrotnie przemyć DPBS bez chlorku wapnia i magnezu. Następnie pokryć komórki trypsyną, odnotowując zużytą objętość, i inkubować je w temperaturze 37 °C.Po trzech minutach inkubacji należy sprawdzić pod mikroskopem, czy komórki oddzieliły się od podłoża, a jeśli tak, dodać dwukrotność objętości roztworu neutralizującego trypsynę, która została dodana wcześniej. Po neutralizacji trypsyny należy połączyć zawiesiny komórkowe w jednej probówce i zmierzyć gęstość komórek za pomocą cytometru hematologicznego. Na koniec należy odwirować zawiesinę komórkową, a otrzymany osad resuspenderować w co najmniej 4.5 milliliters medium bezsurowiczego.Po przygotowaniu świni do zabiegu, wykonaj nacięcie w linii pośrodkowej za pomocą ostrza skalpela nr 15, zaczynając od drugiej pary gruczołów mlekowych. Ostrożnie prowadź nacięcie do przedostatniej pary gruczołów, używając elektrokoagulatora. Kontynuuj preparację aż do powięzi brzusznej.Unieś otrzewną za pomocą kleszczyków typu mosquito i ostrożnie przetnij ją nożyczkami Metzenbauma, wyciągnij pęcherz moczowy na zewnątrz i nałóż szew sakulacyjny z nici Vicryl 3-0 w ścianie pęcherza. Wykonaj nacięcie punktowe w jego centrum i wprowadź do nacięcia cewnik Foleya 16 Fr. Następnie podawaj płyny dożylnie, aby utrzymać diurezę na poziomie co najmniej 1 mL/kg/h podczas operacji.Następnie należy wyprowadzić na zewnątrz niewielką, poszerzoną pętlę jelita i umieścić dwa retraktory chirurgiczne Bour, aby odsłonić tylną część jamy otrzewnej, a następnie zidentyfikować żyłę główną dolną (IVC), stosując ostrą i tępą dyssekcję. Należy ostrożnie uwolnić IVC z otaczających tkanek. Następnie należy przeprowadzić szkieletyzację naczynia od prawej tętnicy nerkowej proksymalnie do rozwidlenia IVC dystalnie.Podczas preparowania żyły głównej dolnej (IVC) należy zachować szczególną ostrożność, ponieważ nawet bardzo niewielki defekt w IVC może doprowadzić do gwałtownego krwotoku i wykrwawienia podwiązanego zwierzęcia. Należy podwiązać wszystkie odgałęzienia boczne segmentu IVC, zwracając szczególną uwagę na preparowanie i podwiązywanie dwóch dużych żył lędźwiowych tylnych znajdujących się bezpośrednio proksymalnie względem rozwidlenia IVC. Po stronie tylnej często występuje duża żyła lędźwiowa.Wypreparuj tę żyłę i zabezpiecz ją za pomocą pętli naczyniowych. Teraz, równolegle do przebiegu operacji, rozpocznij zasiewanie implantu komórkami EPC przed przystąpieniem do tej procedury. Rusztowania do osadzania tkanki w rurce tytanowej muszą być w pełni zmontowane i gotowe do użycia w polu jałowym.Otwórz sterylizowaną gazowo rurkę tytanową z zestawem w strzykawce 5 cc. Następnie wyjmij tłok ze strzykawki 5 cc, ale go nie wyrzucaj. Przymocuj zakrętkę do strzykawki. Za pomocą pipety napełnij strzykawkę zawiesiną EPC.Następnie załóż tłok. Zdejmij nasadkę i wsuń koniec strzykawki z łącznikiem do otwartego silikonowego przewodu zestawu, aż będzie on dopasowany. Następnie usuń pęcherzyki powietrza, powoli przesuwając roztwór komórkowy, aż dotrze on do górnej części głowicy.Następnie zamknąć układ za pomocą nakrętki Luer i szczelnie zakleić go taśmą, pracując w sterylnej rękawiczce. Cały tak przygotowany układ umieścić w precyzyjnie wykonanym uchwycie do strzykawki, a następnie włożyć do inkubatora ustawionego na 37 °C. Użyć poziomicy, aby upewnić się, że komory osadzające znajdują się w poziomie, i inkubować układ przy łagodnej rotacji.Kontynuuj zabieg bezpośrednio po podwiązaniu IVC, podając 100 jednostek heparyny na kilogram masy ciała świni. Następnie natychmiast załóż klamry na IVC pod kątem 45 stopni, najpierw dystalnie na IVC i żyłę lędźwiową, a następnie proksymalnie. W dalszej kolejności, używając ostrza skalpela nr 11 i nożyc tętniczych, wykonaj czterocentymetrową podłużną wenotomię między klamrą proksymalną a dystalną.Usunąć krew z IVC i przepłukać jego wewnętrzny światło sterylnym DPBS. Następnie wprowadzić do IVC implant z osadzonymi EPC lub kontrolną gołą metalową konstrukcję, aby zapobiec wysychaniu komórek i usunąć powietrze. Wypełnić IVC roztworem DPBS z chlorkiem wapnia i chlorkiem magnezu.Następnie zamknąć wenotomię za pomocą szwu ciągłego z nici Prolene 4-0 i usunąć jeden zacisk proksymalny, aby odpowietrzyć żyłę główną dolną (IVC) poprzez kontrolowane, niewielkie krwawienie wsteczne. Po odprowadzeniu powietrza usunąć zacisk dystalny, aby utrzymać implant na miejscu. Założyć szew stabilizujący do rurki PVC przechodzącej przez ścianę żyły.Zamknij powięź szwem OPDS za pomocą igły CT. Zamknij przestrzeń podskórną dwoma szwami ciągłymi Vicryl. Następnie zamknij skórę za pomocą zszywek.Podać podskórnie do 20 mililitrów 0,25% Marcaine wzdłuż miejsca nacięcia, a ranę zabezpieczyć gazą i tegadermem w celu uśmierzenia bólu. W razie potrzeby podać podskórnie flu Nixon oraz oksymorfon. Po zakończeniu znieczulenia i przebudzeniu się świni, umieścić ją z powrotem w klatce na kolejne siedem dni.Podawaj atri co 24 godziny jako antybiotyk profilaktyczny i upewnij się, że plaster z fentanylem zaaplikowany przed operacją pozostaje przyklejony przez łącznie trzy dni. Po trzech dniach usunięto osadzone tytanowe implanty rurkowe i zbadano ich powierzchnie wewnętrzne. Przy długości fali wzbudzenia 550 nanometrów w drugiej rurce stwierdzono obecność konfluentnej warstwy komórek znakowanych fluorescencyjnie.Komórki w przekrojach dodatkowo barwiono markerem adhezji płytek krwi do komórek śródbłonka, aby uwidocznić granice komórek. W tej procedurze można zastosować szeroką gamę barwień. W przeciwieństwie do tego, implant w postaci gołej rurki tytanowej ulega całkowitemu zamknięciu w prozakrzepowym środowisku o niskim ścinaniu w żyle głównej dolnej.Jak pokazano na obrazach A i C, osadzona w komórce rurka tytanowa przedstawiona jest na obrazie B i pozostała wolna od skrzepu po zastosowaniu naszej procedury izolacji z krwi szczytowej. EPC pojawiają się średnio po siedmiu dniach hodowli. Podczas wykonywania procedury chirurgicznej bardzo ważne jest uważne i delikatne wypreparowanie IVC, ponieważ nawet najmniejsze przerwanie IVC lub jego odgałęzień bocznych może prowadzić do wykrwawienia świni. Po tej procedurze inne materiały kontaktujące się z krwią mogą zostać szybko endotelializowane, aby zapobiec zakrzepicy.Stenty naczyniowe wyścielone śródbłonkiem, na przykład z wykorzystaniem naszych EPC, naśladują naturalną wyściółkę ściany naczynia krwionośnego i mogą zapobiegać restenozie oraz zakrzepicy stentu po jego wszczepieniu. Nasza technologia szybkiej aplikacji umożliwi wyścielanie urządzeń wewnątrznaczyniowych pochodzącymi z krwi pacjenta komórkami progenitorowymi śródbłonka w ciągu kilku minut na sali operacyjnej lub w pracowni hemodynamicznej. Eliminuje to tym samym konieczność przedłużonej hodowli ex vivo.Unika się czasu spędzonego bezpośrednio na urządzeniu, dzięki czemu technologia ta staje się praktyczna do wdrożenia w praktyce klinicznej.

autologous-endothelial-progenitor-cell-seeding-technology

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Technologia wysiewu komórek autologousowych komórek prążkowiakowatych oraz testowanie biokompatybilności urządzeń krążeniowych na dużym modelu zwierzęcym

Endotelialne komórki progenitorowe tworzące kolonie (ECFCs) stanowią obiecujące narzędzie do badania homeostazy i regeneracji naczyń krwionośnych.1,2 Niniejsza praca przedstawia nową metodę izolacji i ekspansji ECFC z heparynowanej krwi obwodowej dorosłego człowieka bez użycia surowicy zwierzęcej, z wykorzystaniem puli lizatu płytek krwi człowieka (pHPL), co zmniejsza ryzyko immunizacji przeciwko białkom bydlęcym.

Izolacja i wielkoskalowa ekspansja dorosłych ludzkich endotelialnych komórek progenitorowych zdolnych do tworzenia kolonii

W niniejszej pracy opisujemy metodologię podskórnego wprowadzania do myszy z niedoborem odporności ludzkich komórek endotelialnych tworzących kolonie (ECFCs) pochodzących z krwi pępowinowej oraz mezenchymalnych komórek macierzystych (MSCs) pochodzących z szpiku kostnego, osadzonych w żelu kolagenowo-fibronektynowym. Ta kombinacja komórek i żelu generuje ludzką sieć naczyniową, która łączy się z układem naczyniowym myszy.

Bioinżynieria ludzkich sieci mikro naczyniowych u myszy z niedoborem odporności

Aby poszerzyć naszą wiedzę na temat komórkowego i molekularnego tworzenia się nowotworów, niedawno opracowano mysi model TEVG. Przeszczepy wszczepiono jako przeszczepy z interpozycją żyły głównej podnerkowej u myszy C57BL/6. Model ten osiąga wyniki podobne do tych osiągniętych w naszym badaniu klinicznym, ale w znacznie krótszym czasie.

Implantacja przeszczepu interpozycji żyły głównej dolnej w modelu mysim

Protokół krok po kroku do międzypozycyjnego umieszczania naczyń TEV (Tissue Engineered Departments) w tętnicy szyjnej owcy za pomocą zespolenia end-to-end i cyfrowej oceny w czasie rzeczywistym in vivo, aż do uśmiercenia zwierzęcia.

Technika chirurgiczna implantacji przeszczepów naczyniowych wykorzystujących inżynierię tkankową, a następnie monitorowanie in vivo

Tutaj prezentujemy protokół do generowania przeszczepów naczyń krwionośnych z inżynierii tkankowej, które są funkcjonalne do szczepienia myszom poprzez podwójne wysiewanie częściowo indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (PiPSC) - pochodzących komórek mięśni gładkich i PiPSC - pochodzących komórek śródbłonka na bezkomórkowym bioreaktorze rusztowania naczyń krwionośnych.

Wytwarzanie i przeszczepianie naczyń krwionośnych metodą inżynierii tkankowej w modelu mysim

Opisujemy mikrochirurgiczne podejście do generowania pętli tętniczo-żylnej (AV) jako model do analizy unaczynienia in vivo w izolowanym i dobrze scharakteryzowanym środowisku. Model ten jest nie tylko przydatny do badania angiogenezy, ale jest również optymalnie przystosowany do inżynierii osiowo unaczynionych i przeszczepialnych tkanek.

Pętla tętniczo-żylna (AV) w małym modelu zwierzęcym do badania angiogenezy i inżynierii tkanek unaczynionych

Obecnie każdy rodzaj unaczynionej allotransplantacji kompozytowej zależy od długotrwałej immunosupresji, co jest trudne do wsparcia w przypadku wskazań niekrytycznych dla życia. Przedstawiamy nowy model VCA kości piszczelowej świni, który można wykorzystać do badania VCA kości i zademonstrowania zastosowania angiogenezy chirurgicznej w celu utrzymania żywotności kości bez konieczności długotrwałej modulacji immunologicznej.

Angiogeneza chirurgiczna w allotransplantacji kości piszczelowej świń: nowy model allotransplantacji kompozytowej z unaczynionymi kośćmi dużych zwierząt

Tutaj opisujemy przedkliniczny model ortotopowego przeszczepu serca na dużych zwierzętach (świniach), który został mocno ugruntowany i wykorzystany do zbadania nowych strategii kardioprotekcyjnych.

Przedkliniczny model ortotopowego przeszczepiania serca od świń

Ten protokół ma na celu przeszczepienie biodrukowanej łatki 3D na nasierdzie myszy z zawałem, modelując niewydolność serca. Zawiera szczegóły dotyczące znieczulenia, chirurgicznego otwarcia klatki piersiowej, trwałego podwiązania lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej (LAD) i nałożenia biodrukowanego plastra na obszar serca po zawale.

Przeszczep biodrukowanego plastra 3D w mysim modelu zawału mięśnia sercowego

Tutaj przedstawiono protokół implantacji przeszczepu naczyniowego z wykorzystaniem inżynierii tkankowej do tętnicy szyjnej myszy za pomocą techniki mankietowej, dostarczając odpowiedniego modelu zwierzęcego do badania mechanizmów regeneracji tkanki naczyniowej.

Implantacja przeszczepu naczyniowego z wykorzystaniem inżynierii tkankowej w tętnicy szyjnej myszy za pomocą techniki mankietowej

W pracy przedstawiono model świni do oceny przeszczepów o małej średnicy w tętnicach udowych. Model naśladuje dynamikę naczyń krwionośnych człowieka i kompleksowo ocenia drożność przeszczepów, hemodynamikę i przebudowę naczyń. Stanowi cenną platformę do badania przeszczepów naczyniowych i monitorowania ich za pomocą ultrasonografii dopplerowskiej i angiografii.

Implantacja przeszczepu naczyniowego kości udowej w modelu trzody chlewnej w celu przetestowania przeszczepów naczyniowych o małej średnicy

Poznaj technologię wysiewu autologicznych komórek progenitorowych śródbłonka na implanty tytanowe w celu zwiększenia biokompatybilności i zapobiegania zakrzepicy w dużym modelu zwierzęcym.

Technologia wysiewu autologicznych komórek progenitorowych śródbłonka i testy biokompatybilności urządzeń sercowo-naczyniowych w dużym modelu zwierzęcym (Wideo) | JoVE Journal

Technologia zasiewiania autologicznych komórek progenitorowych śródbłonka oraz badanie biokompatybilności urządzeń sercowo-naczyniowych w modelu dużych zwierząt

Przeglądaj więcej filmów