Technologia wysiewu autologicznych komórek progenitorowych śródbłonka i testy biokompatybilności urządzeń sercowo-naczyniowych w dużym modelu zwierzęcym
9 września 2011
Opisano metodę wysiewania biomateriałów tytanowych mających kontakt z krwią z komórkami autologicznymi i testowania biokompatybilności. Metoda ta wykorzystuje śródbłonkowe komórki progenitorowe i tytanowe rurki, wysiewane w ciągu kilku minut od chirurgicznego wszczepienia do żył głównych świń. Technikę tę można dostosować do wielu innych wszczepialnych urządzeń biomedycznych.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest zasianie implantów naczyniowych autologicznymi komórkami progenitorowymi śródbłonka pochodzącymi z krwi, a następnie obserwacja wpływu tego leczenia na zakrzepicę w dużym modelu zwierzęcym. Osiąga się to poprzez uzyskanie próbki krwi obwodowej od świń w celu wyizolowania komórek progenitorowych śródbłonka świń o późnym wyrostku. Następnie urządzenie wszczepialne.
Tytanowa rurka w naszym badaniu potwierdzającym zasadę jest osadzona w autologicznych komputerach. Urządzenie jest następnie wszczepiane do żyły głównej dolnej świni. Wyniki pokazują, że ochrona przed zakrzepicą opiera się na drożności rurki tytanowej z gniazdem EPC, w przeciwieństwie do kontrolnej i okluzowanej rurki z gołego metalu.
Duke Surgery jest zaangażowana we wspieranie przełomowych, innowacyjnych badań. Poniższa prezentacja jest jednym z przykładów tego, jak pracujemy na różnych wydziałach i dyscyplinach, aby rozwijać medycynę. Dr EK prowadzi badania mające na celu opracowanie technologii osadzania komórek, która zapobiegnie zakrzepicy poprzez wyłożenie powierzchni styku krwi urządzeń naczyniowych własnymi komórkami progenitorowymi pacjenta.
Ponieważ komórki te pochodzą od tych samych pacjentów, którzy otrzymają implant, unikamy odrzucenia przez układ odpornościowy. Nasz sukces i opisane tu metody są wynikiem dużego wysiłku zespołowego. Chirurgiczne wszczepienie implantu zostanie zademonstrowane przez Seana Gage'a z sekcji chirurgii naczyniowej, Whitney Lane, studentkę medycyny na Uniwersytecie Duke'a i mnie.
Chciałbym teraz przedstawić Alexandra Janssena, doktoranta z Wydziału Inżynierii Biomedycznej, który przeprowadzi nas przez proces wysiewu komórek Szczegółowo pokażę, jak wysiewać tytanowe rurki komórkami progenitorowymi śródbłonka pochodzącymi z krwi tuż przed implantacją do modelu świni. Ta metoda służy jako dowód słuszności koncepcji, a te same podstawowe zasady można zastosować do wielu innych urządzeń do implantacji, takich jak stenty nitinolowe i mechaniczne urządzenia wspomagające krążenie. EPC są izolowane przez posiew jednojądrzastej frakcji komórkowej krwi świni i zwykle pojawiają się po około siedmiu dniach.
Można je rozpoznać po typowej morfologii kostki brukowej. Rozszerz EPC do łącznej liczby 9 milionów komórek w hodowli. Przygotowane EPC należy dwukrotnie przepłukać w podłożu bezsurowicy, zwracając uwagę na ograniczenie ich ekspozycji na światło w trakcie i po znakowaniu.
Następnie przykryj komórki etykietą fluorescencyjną PKH 26 i zapisz, ile roztworu zostało zastosowane. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez cztery minuty. Zatrzymaj reakcję etykietowania, dodając równą objętość surowicy świńskiej do roztworu barwnika minutę później.
Rozcieńczyć połączone roztwory jeden do jednego z pełnym podłożem wzrostowym. Następnie odessać płyn i trzykrotnie przepłukać komórki pełną pożywką wzrostową, a następnie dwukrotnie przepłukać i DPBS bez chlorku wapnia lub magnezu. Następnie przykryj komórki trypsyną, zwracając uwagę na użytą objętość i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Po trzech minutach inkubacji użyj mikroskopii, aby sprawdzić, czy komórki się odłączyły, a jeśli tak, dodaj dwa razy więcej roztworu neutralizującego trypsynę, niż zostało dodane. Trypsyna, połącz roztwory komórkowe w jedną probówkę i zmierz gęstość komórek za pomocą hemocytometru. Na koniec zawiesić zawiesinę komórek i ponownie zawiesić komórki w co najmniej 4,5 mililitra wolnego podłoża surowicy.
Po przygotowaniu świni do zabiegu należy naciąć linię środkową ostrzem skalpela numer 15 z drugiego zestawu gruczołów pamięci. Zgniot doprowadził do przedostatniego seta za pomocą elektrokoagulacji. Przenieś sekcję w dół do powięzi brzusznej.
Podnieś otrzewną za pomocą kleszczyków do komarów i ostrożnie wejdź do niej nożyczkami do metalu, uzewnętrznij pęcherz moczowy i umieść szew sznurkowy z trzema ochami Vicryl w ścianie pęcherza. Wykonaj nacięcie kłute w jego środku i wprowadź 16 francuski cewnik Foleya do nacięcia. Następnie podawaj dożylnie płyny, aby miareczkować wydalany mocz do co najmniej jednego mililitra na kilogram na godzinę podczas operacji.
Następnie uzewnętrznij powiększone jelito cienkie i umieść dwa zwijacze chirurgiczne, aby odsłonić tylną część jamy otrzewnej i zidentyfikować IVC za pomocą ostrej i sekcji. Ostrożnie uwolnij IVC z otaczającej tkanki. Następnie zeszkieletuj naczynie od prawej tętnicy nerkowej proksymalnie do rozwidlenia dystalnego ćwiczenia IVC.
Zachowaj szczególną ostrożność podczas sekcji IVC, ponieważ nawet bardzo mały ubytek IVC może prowadzić do szybkiego krwotoku i wykrwawienia zwierzęcia. Wszystkie boczne gałęzie segmentu IVC zwracają szczególną ostrożność, preparując i podwiązując dwie duże tylne żyły lędźwiowe bezpośrednio proksymalne do rozwidlenia IVC. Często po tylnej stronie znajduje się duża żyła lędźwiowa.
Odetnij tę żyłę i kontroluj ją za pomocą pętli naczyń. Teraz, równolegle z operacją, rozpocznij zasiewanie implantu EPC przed rozpoczęciem tej procedury. Rusztowania do osadzania tkanek z rurki tytanowej muszą być w pełni zmontowane i gotowe do użycia w sterylnym polu.
Otwórz zespół sterylizowanej gazem tytanowej rurki w strzykawce o pojemności pięciu cm3. Następnie wyjąć tłok ze strzykawki o pojemności pięciu cm3, ale nie wyrzucać go na stałe nasadki przyciągającej do strzykawki. Za pomocą pipety napełnić strzykawkę zawiesiną EPC.
Następnie wymienić tłok. Zdejmij nasadkę i włóż końcówkę przynęty strzykawki do otwartej silikonowej rurki zespołu, aż będzie dobrze dopasowana. Ale nie usuwaj dalej żadnych pęcherzyków, powoli przesuwając roztwór komórkowy, aż dotrze do górnej części nakrycia głowy.
Następnie zamknij zespół nasadką przynęty i zaklej go taśmą w sterylnej rękawicy. Włóż cały ten zespół do obrobionego maszynowo uchwytu strzykawki i umieść go w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Użyj miernika, aby upewnić się, że komory siedzenia są wypoziomowane i pozwól zespołowi inkubować się z delikatnym obracaniem.
Kontynuuj operację zaraz po podwiązaniu IVC, podając 100 jednostek heparyny na kilogram świni. Następnie natychmiast zacisnąć IVC pod kątem 45 stopni dystalnie na IVC i żyle lędźwiowej, a następnie proksymalnie. Następnie użyj ostrza skalpela numer 11 i nożyczek do doniczek, aby wykonać czterocentymetrową otomię żyły podłużnej między bliższymi i dystalnymi zaciskami.
Usunąć krew z IVC i przepłukać jej wewnętrzne światło sterylnym DPBS. Teraz włóż implant osadzony w EPC lub kontrolę z gołym metalem do IVC, aby zapobiec wysychaniu komórek i odprowadzaniu powietrza. Napełnij IVC DPBS chlorkiem wapnia i chlorkiem magnezu.
Następnie zamknij otomię żyły za pomocą czterech oh proline running shew i usuń jeden proksymalny zacisk, aby przewietrzyć IVC przez niewielką ilość krwawienia z tyłu. Po krwawieniu zdejmij dystalny zacisk, aby utrzymać implant na miejscu. Założyć szew podtrzymujący do rurki PVC przechodzącej przez ścianę żyły.
Zamknij powięź za pomocą OPDS na igle do tomografii komputerowej. Zamknij przestrzeń podskórną za pomocą dwóch o Vicryl biegnący. Następnie zszyj skórę pod kątem.
Podawać do 20 mililitrów 0,25% Marcainy podskórnie wzdłuż miejsca nacięcia i przykryć ranę gazą i tegadermem na ból. W razie potrzeby podaj podskórnie grypę Nixon i oksymorfon. Przerwij znieczulenie, a kiedy świnia się obudzi, wróć do klatki w ciągu następnych siedmiu dni.
Podawać atri co 24 godziny jako profilaktyczny antybiotyk i upewnić się, że plaster z fentanylem nałożony przed zabiegiem pozostaje przyklejony przez łącznie trzy dni. Po trzech dniach implanty z tytanowej rurki zostały usunięte, a ich wewnętrzne powierzchnie zostały zbadane. Pod długością fali wzbudzenia 550 nanometrów w innej probówce znaleziono zlewającą się warstwę fluorescencyjnie znakowanych komórek.
Komórki przekroju dodatkowo wybarwiono markerem adhezji komórek śródbłonka płytek krwi w celu uwidocznienia granic komórek. W tej procedurze można zastosować szeroką gamę plam. W przeciwieństwie do tego, goły implant rurki tytanowej całkowicie zamyka się w środowisku prozakrzepowym o niskim udziale żyły głównej dolnej.
Jak pokazano na obrazach A i C, tytanowa rurka osadzona w komórce jest pokazana na obrazie B i pozostała wolna od skrzepu Po naszym, powiedzmy, procedurze izolacji z szczytem krwi. EPC pojawiają się średnio po siedmiu dniach w hodowli Podczas wykonywania zabiegu chirurgicznego bardzo ważne jest, aby zarówno ostrożnie, jak i delikatnie szkieletować IVC, ponieważ nawet najmniejsze rozdarcie IVC lub jego bocznych gałęzi może doprowadzić do wykrwawienia świni. Po tej procedurze inne materiały mające kontakt z krwią mogą szybko leżeć w śródbłonku, aby zapobiec zakrzepicy.
Śródbłonkowe stenty naczyniowe, na przykład z naszymi EPC, naśladują natywną wyściółkę ściany naczynia krwionośnego i mogą zapobiegać ponownemu zwężeniu stentu i zakrzepicy po jego rozwoju. Nasza technologia szybkiego widzenia pozwoli na wyłożenie aparatów wewnątrznaczyniowych własnymi komórkami progenitorowymi śródbłonka pochodzącymi z krwi pacjenta w ciągu kilku minut na sali operacyjnej lub w pracowni cewnikowania. Dlatego przedłużona hodowla exvivo.
Unika się czasu spędzonego na samym urządzeniu, a technologia staje się praktyczna do przełożenia na praktykę kliniczną.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę zasiewania biomateriałów tytanowych mających kontakt z krwią autologicznymi endotelialnymi komórkami progenitorowymi (EPCs) w celu zwiększenia ich biokompatybilności. Technika ta polega na szybkim zasiewaniu EPCs do rurek tytanowych bezpośrednio przed chirurgicznym wszczepieniem ich do żył głównych świni, co wykazuje potencjał zastosowania w różnych implantowalnych urządzeniach biomedycznych.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria biomedyczna
- Chirurgia naczyniowa
- Terapia komórkowa
Wprowadzenie
- Endotelialne komórki progenitorowe (EPCs) mogą być pozyskiwane z krwi pacjenta.
- Stosowanie komórek autologicznych zmniejsza ryzyko odrzucenia immunologicznego.
- Zakrzepica jest istotnym powikłaniem w przypadku implantów naczyniowych.
- Poprzednie badania wykazały, że EPCs mogą poprawić biokompatybilność implantów.
Cel badania
- W celu zasiewania implantów naczyniowych autologicznymi EPC.
- W celu oceny wpływu leczenia EPC na zakrzepicę w modelu dużego zwierzęcia.
- W celu opracowania technologii zasiewania komórek, która poprawia wydajność urządzeń naczyniowych.
Zastosowane metody
- Izolacja późnych komórek progenitorowych śródbłonka (EPC) świni z próbek krwi obwodowej.
- Zasiewanie rurek tytanowych komórkami EPC przed implantacją.
- Chirurgiczna implantacja rurki tytanowej zasianej komórkami EPC do żyły głównej dolnej świni.
- Ocena zakrzepicy na podstawie drożności wszczepionego urządzenia.
Główne wyniki
- Rurka tytanowa zasiana komórkami EPC wykazała ochronę przed zakrzepicą.
- Wyniki wskazały na poprawę drożności w porównaniu z kontrolnymi rurkami z gołego metalu.
- Metoda ta wykazała możliwość zastosowania w innych urządzeniach implantowalnych.
- Współpraca międzywydziałowa poprawiła wyniki badań.
Wnioski
- Zasiewanie implantów tytanowych autologicznymi EPC jest obiecującym podejściem w celu zmniejszenia ryzyka zakrzepicy.
- Technikę tę można dostosować do różnych urządzeń biomedycznych.
- Dalsze badania są niezbędne w celu zoptymalizowania metody i oceny wyników długoterminowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla sektora przemysłowego
Niniejsza metoda odnosi się do krytycznego problemu w opracowywaniu urządzeń naczyniowych: powikłań zakrzepowych wynikających z kontaktu krwi z powierzchniami sztucznymi. Dzięki umożliwieniu szybkiego zasiedlania implantów tytanowych autologicznymi komórkami progenitorowymi śródbłonka (EPC) bezpośrednio przed implantacją, technologia ta oferuje sposób na poprawę biozgodności i zmniejszenie ryzyka zakrzepowego w badaniach przedklinicznych. Podejście to wspomaga mechanistyczną redukcję ryzyka w przypadku urządzeń naczyniowych poprzez zapewnienie fizjologicznie istotnej wyściółki śródbłonka pochodzącej od pacjenta w modelu dużego zwierzęcia, zwiększając tym samym pewność prognostyczną podczas oceny urządzeń na wczesnym etapie.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie mechanizmów trombogennych poprzez porównanie powierzchni metalowych zasianych komórkami EPC z powierzchniami niepowlekanymi w środowisku trombogennym.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalny model do oceny efektywności endotelializacji i tromboodporności potencjalnych biomateriałów.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych wyników opartych na fluorescencji w celu oceny pokrycia śródbłonkiem oraz drożności, co służy do porównawczego przesiewu urządzeń.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje procedury wysiewania i implantacji EPC, co umożliwia wysokowierną transfer analiz między laboratoriami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wykazuje tworzenie funkcjonalnej warstwy śródbłonka oraz utrzymanie drożności w klinicznie istotnym modelu dużego zwierzęcia.
- Wartość operacyjna: Łączy przygotowanie komórek in vitro z testami wydajności in vivo, umożliwiając podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z continuum odkryć, wspierając wczesną walidację biologiczną materiałów do urządzeń naczyniowych przed identyfikacją wiodących związków i optymalizacją przedkliniczną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących strategii endotelializacji w celu zmniejszenia ryzyka zakrzepowego w projektowaniu wyrobów medycznych.
- Przesiew: Umożliwia zstandaryzowaną ocenę modyfikacji powierzchni poprzez mierzalne punkty końcowe w postaci stopnia pokrycia śródbłonkiem i drożności wyrobu.
- Analityka: Zapewnia opartą na fluorescencji kwantyfikację pokrycia przez EPC oraz zakrzepowej niedrożności jako kluczowe odczyty porównawcze.
- Badania translacyjne: Łączy pozyskiwanie autologicznych komórek z wydajnością wyrobu w porcine IVC model, wspierając ciągłość badań przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny strategii endotelializacji w różnych typach wyrobów (np. stentach, urządzeniach wspomagających).
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Poprawia walidację celu poprzez zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w zakresie oddziaływań krew-urządzenie.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki ustandaryzowanym protokołom izolacji, znakowania i wysiewania EPC.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje typu go/no-go poprzez dostarczanie wczesnych danych dotyczących tromboodporności, co zmniejsza ryzyko biologicznej awarii na późnym etapie.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów na urządzenia z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o potencjał endotelializacji i profile biokompatybilności.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórkowych, znakowaniu fluorescencyjnym oraz technikach chirurgii naczyniowej.
- Zależność od sterylnego sprzętu do manipulacji komórkami, inkubatorów oraz mikroskopii fluorescencyjnej w celu walidacji.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa między zespołami zajmującymi się przetwarzaniem komórek a zespołami chirurgicznymi w celu zapewnienia terminowej implantacji.
- Adaptacja do alternatywnych biomateriałów (np. nitinolu, polimerów) może wymagać optymalizacji modyfikacji powierzchni.
- Ograniczenie czasowe związane z hodowlą ex vivo w celu ekspansji EPC, która musi być skoordynowana z harmonogramem zabiegów chirurgicznych.
