Wizualizacja wewnątrzkomórkowego transportu ładunku w hodowanych astrocytach

Zacznij od przylegającej hodowli pierwotnych astrocytów myszy na szkiełku nakrywkowym w naczyniu hodowlanym.

Inkubuj za pomocą fluorescencyjnej sondy kwasotropowej, która przechodzi przez nienaruszone błony komórkowe, aby dostać się do astrocytów.

Sonda selektywnie gromadzi się wewnątrz kwaśnych pęcherzyków endolizosomalnych i fluorescencyjnie znakuje pęcherzyki w celu monitorowania ich transportu.

Umyj, aby usunąć nadmiar sondy i dodaj świeże podłoże.

Umieść kulturę pod mikroskopem konfokalnym i skup się na pojedynczej komórce, aby wykonać obrazowanie poklatkowe.

Wizualizuj oznaczony ładunek jako fluorescencyjną punkcję rozmieszczoną w obszarze okołojądrowym,

cytozolu i procesach astrocytowych.

Uchwyć wiele płaszczyzn ogniskowych wzdłuż osi Z, aby zobrazować ładunek w całej trójwymiarowej objętości komórki.

Wykonuj obrazowanie w określonych odstępach czasu, aby śledzić wewnątrzkomórkowy transport ładunku na różnych głębokościach w astrocytach.

Przeanalizuj ruch ładunku, aby odróżnić ładunek stacjonarny, ładunek poruszający się w kierunku obrzeża komórki i ładunek poruszający się w kierunku jądra.

30 minut przed obrazowaniem rozcieńczyć odpowiednią lizosomalną sondę znakującą w 200 mikrolitrach pożywki do hodowli astrocytów do stężenia roboczego 1 mikromola i oznaczyć astrocyty sondą przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie przemyj komórki jednym raz ciepłym podłożem do hodowli astrocytów i zastąp płukanie pożywką do obrazowania.

Natychmiast po znakowaniu sondy umieść pojemnik na kulturę astrocytów w odpowiednim adapterze na stoliku mikroskopu. Używając światła epifluorescencyjnego, zlokalizuj komórki, które wyrażają białka fluorescencyjne lub sondę. Użyj aparatu cyfrowego, aby dostosować oświetlenie próbki fluorescencyjnej, aby zobrazować wybrane komórki, a następnie dostosować ostrość i powiększenie do pojedynczej komórki.

Następnie użyj funkcji Zoom i definite focus, aby uzyskać pojedynczą serię poklatkową C-stack z częstotliwością jednej klatki co dwie sekundy w odstępach czasu od 300 do 500 sekund. Zapisz i wyeksportuj obrazy poklatkowe jako pliki stosu Avi lub TIFF.