Eksperymentalne wytwarzanie fibroblastów związanych z rakiem (CAF) z ludzkich fibroblastów sutkowych

Fibroblasty (CAF) związane z rakiem, bogate w miofibroblasty obecne w zrębie guza, odgrywają główną rolę w napędzaniu progresji nowotworu. Opracowaliśmy model ksenprzeszczepu guza koimplantacyjnego do eksperymentalnego generowania CAF z ludzkich fibroblastów sutka. Protokół opisuje, w jaki sposób ustanowić miofibroblasty CAF, które nabywają zdolność do promowania nowotworzenia.

Ten film opisuje procedurę generowania fibroblastów lub cieląt związanych z rakiem na podstawie pierwotnej hodowli ludzkiej pamięci. Raki fibroblastów to złożone tkanki składające się z komórek nowotworowych i nienowotworowego przedziału określanego jako stromer. Zrąb S związany z nowotworem składa się z macierzy zewnątrzkomórkowej i różnych komórek zrębu, w tym fibroblastów, miofibroblastów, komórek śródbłonka, pasożytów i leukocytów fibroblastów związanych z rakiem bogatych w miofibroblasty, cechę charakterystyczną aktywowanych fibroblastów obecnych w guzie.

Stromer odgrywa główną rolę w napędzaniu progresji guza. Można je wytworzyć in vitro, najpierw izolując pierwotne ludzkie fibroblasty sutka ze zdrowej tkanki piersi uzyskanej w wyniku mammoplastyki redukcyjnej. Uzyskana tkanka jest dysocjowana na zawiesinę pojedynczej komórki, a następnie umierniana przez transdukcję wirusa i modyfikowana do ekspresji GFP i genu oporności na mycynę puram.

Komórki są następnie wstrzykiwane jednocześnie z ludzkim rakiem piersi. MCF siedem komórek RZS podskórnie do myszy z niedoborem odporności. Wstrzyknięte ludzkie fibroblasty pamięci będą ewoluować w miofibroblasty cielęcych promujące nowotwór.

Następnie fibroblasty sutka humoru rodzicielskiego są ekstrahowane z ksenoprzeszczepów nowotworowych i hodowane w obecności pur mycyny. Powstałe w ten sposób komórki oporne na pur mycynę, zwane eksperymentalnie generowanymi cielętami lub eksperymentalnie cielętami, analiza immunohistochemiczna ujawnia, że początkowo normalne ludzkie fibroblasty pamięci ewoluują w miofibroblasty cielęce w ksenoprzeszczepie guza, które nabyły zdolność do promowania nowotworu. Główną zaletą tej techniki przy istniejącej metodzie, takiej jak ekstrakcja z pierwotnymi calami od pacjenta z rakiem piersi, jest to, że jesteśmy uprawnieni do eksperymentalnego generowania cieląt z ludzkiego fibroblastu piersi przy użyciu guza implantacji koimplantacji.

Ogólnym modelem demonstrującym procedurę będzie Kar, adiunkt w moim laboratorium i Ahmed Kar, doktorant w laboratorium. Zacznij od jednego grama zdrowej ludzkiej tkanki piersi wyciętej z mammoplastyki redukcyjnej. Umyj chusteczkę kilka razy w PBS, a następnie umieść ją w 15-centymetrowej naczyniu do mięsa i za pomocą sterylnej żyletki zmielić ją na małe fragmenty o wielkości mniejszej niż 1,5 milimetra sześciennego.

Następnie za pomocą żyletki przenieś fragmenty tkanek do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów zawierającej 10 mililitrów buforu dysocjacji komórek na każde pół grama tkanki. Następnie wiruj przez jedną minutę z maksymalną prędkością. Umieść rurkę na kołysce w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i pozwól fragmentom tkanek trawić się przez 12 do 18 godzin.

Następnego dnia w wirze rurkowym pozostanie jeszcze wiele kawałków niestrawionych fragmentów tkanek. Najpierw z maksymalną prędkością umieść probówkę na blacie i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej bez mieszania. Po inkubacji użyj pięciomililitrowej pipety fizjologicznej, aby przenieść powstały natant SUP wzbogacony w komórki zrębu do nowej stożkowej probówki.

Następnie odwiruj frakcję zrębu przez pięć minut przy 250-krotności grawitacji. Po wirowaniu ponownie zawieś pelus komórkowy w PBS, a następnie odwiruj swój zysk przez pięć minut przy 250-krotności grawitacji. Następnie ponownie zawieś granulki w DMEM uzupełnione 10% FCS i przenieś je na 15-centymetrową szalkę Petriego.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po ośmiu do 10 dniach komórka powinna się zlewać. W tym momencie komórki są zbierane i można je zamrozić w celu długotrwałego przechowywania.

Aby unieśmiertelnić wyizolowane pierwotne ludzkie fibroblasty normalnej pamięci, wprowadź retrowirusowy wektor P MIG wyrażający zarówno kulturę H turt, jak i GFP, komórki przez cztery do pięciu dni, a następnie posortuj komórki GFP dodatnie za pomocą cytometrii przepływowej. Wprowadź retrowirusowy konstrukt P babe puro kodujący czysty gen oporności na mycynę do kultury unieśmiertelnionych fibroblastów znakowanej GFP. Komórki przez pięć do siedmiu dni w obecności czystej mycyny w końcowym stężeniu jednego mikrograma na mililitr.

Aby wyizolować znakowane GFP, PUR unieśmiertelnione fibroblasty ludzkiej pamięci są nieśmiertelne. Następnie należy zbadać, czy fibroblasty wytwarzają aktywne wirusy, które mogą prowadzić do poziomego transferu genów kodujących GFP i oporność na czystą mycynę. Hoduj 2,5 razy 10 do pięciu odpornych na pur mycynę, unieśmiertelnionych ludzkich fibroblastów pamięci na sześciocentymetrowej szalce Petriego przez dwa dni.

Zebrać i przefiltrować pożywkę kondycjonowaną przez fibroblasty za pomocą filtra strzykawkowego o wielkości porów 0,45 mikrona. Następnie dodać do 10 i pół t mysich komórek fibroblastów i hodować przez 12 godzin w obecności pięciu mikrogramów na mililitr siarczanu białka, co zwiększa skuteczność infekcji wirusowej po upływie 12 godzin. Zmień pożywkę na DMEM uzupełnioną 10% FCS i kulturą przez dodatkowe dwa dni.

Zbadaj komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. 10 i pół komórek T zakażonych wirusem GFP będzie GFP dodatnich. Teraz zmień pożywkę, aby potraktować komórki jednym mikrogramem na mililitr.

Pur mycynę przez pięć do siedmiu dni. Ponownie obserwuj komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby określić, czy jakiekolwiek odporne na pur mycynę namioty i pół komórki utworzyły kolonie. Należy zauważyć, że horyzontalny transfer genów przez aktywne wirusy wytwarzane przez rodzicielskie ludzkie fibroblasty sutka znakowane PU mycyną i GFP może sprawić, że otaczające je komórki myszy i komórki rakowe będą wrażliwe na pur mycynę.

Oporny na mycynę Pur i GFP dodatni w obrębie ksenoprzeszczepu guza. Może to utrudnić proces izolowania wstrzykniętych czystych, odpornych na mycynę ludzkich fibroblastów sutkowych znakowanych GFP z ksenoprzeszczepu guza w celu eksperymentalnego wygenerowania fibroblastów związanych z rakiem do wstrzyknięcia myszom z niedoborem odporności. Zacznij od trypsyny i policzenia właśnie przygotowanej ludzkiej linii komórkowej sutka wraz z ludzką linią komórkową raka piersi MCF siedem RA w nowych mikroprobówkach na śmieci.

Reus zawiesić jeden razy 10 do sześciu mc siedem siedmiu RZS ludzkich komórek raka piersi i trzy razy 10 do sześciu unieśmiertelnionych pur mycyny oznaczonych GFP. Ludzkie fibroblasty sutka w 400 mikrolitrach pożywki hodowlanej z 50% matrigelem na wstrzyknięcie. Umieść rurki na lodzie jako kontrolę.

Przygotuj również te same ludzkie fibroblasty sutka bez MCF siedmiu komórek RZS. Następnie, za pomocą igły o rozmiarze 27, wstrzyknij mieszaninę komórek w miejsce podskórne nagiej myszy z niedoborem odporności, aby zbadać wewnątrznowotworową zmienność fenotypów cieląt. Izoluj cielęta i kontroluj fibroblasty z kilku różnych ksenoprzeszczepów guza.

Następnie wszczep każdą mieszaninę w prawą i lewą długość każdej myszy. Pozwól ksenograftom guza lub fibroblastów rosnąć przez 42 dni po wstrzyknięciu. Okres inkubacji fibroblastów w ksenoprzeszczepie guza powinien być zoptymalizowany w oparciu o fenotyp miofibroblastów nabyty w macierzystych fibroblastach w guzie.

Aby wyekstrahować cielęta lub kontrolować fibroblasty od uśpionej myszy, należy umieścić co najmniej 0,5 grama tkanki ksenoprzeszczepu i co najmniej 0,1 grama tkanki ksenoprzeszczepu fibroblastów w oddzielnych naczyniach. Następnie użyj sterylnej żyletki, aby zmielić tkankę na małe fragmenty tkanki o wielkości mniejszej niż 1,5 milimetra sześciennego. Następnie za pomocą żyletki przenieś fragmenty tkanek do 15-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej bufor dysocjacji komórek i wiruj przez jedną minutę Przy maksymalnej prędkości inkubuj zawiesinę komórek przez trzy godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z ciągłą wirówką z powolnym mieszaniem do zawiesiny komórek.

Oddzielony od guza lub przeszczepu sano z włókna szklanego przez pięć minut przy 250-krotności grawitacji po wirowaniu. Zawiesić osad komórkowy w PBS i powtórzyć wirowanie. Następnie ponownie zawieś powstałą paletę komórek w DMEM uzupełnioną 10% FCS w celu wyizolowania odpornej na mycynę hodowli rodzicielskich ludzkich fibroblastów sutka.

Komórki pochodzące z guza lub fibroblastów tratwy na 15-centymetrowej szalce Petriego w obecności jednego mikrograma na mililitr. Puram mycyna to 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. To wyeliminuje wszelkie zanieczyszczające komórki raka i/lub myszy.

Komórki zrębu rozmnażają się w komórkach do momentu płynnego przechowywania komórek w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza za pomocą pożywki zamrażającej. Należy zauważyć, że powstałe komórki oporne na mycynę pur oznaczone jako 42-dniowe komórki cielęcia XP lub kontrolne fibroblasty są nieśmiertelne i dodatnie dla GFP Ludzkie fibroblasty pamięci zwiększają swój fenotyp miofibroblastyczny promujący guz w obrębie ksenoprzeszczepu guza poprzez interakcję z komórkami raka podczas progresji guza. Wymieszaj jeden razy 10 z sześcioma komórkami MCF z siedmioma RZS i trzy razy 10 z 6 42-dniowymi cielętami P.

Jedna komórka w 400 mikrolitrach pożywki hodowlanej z 50% wstrzyknięciem mocy matrigelu w 1,5 mililitrowej probówce Eend Orph. Przygotuj również trzy razy 10 do 6 42-dniowych fibroblastów kontrolnych jednej komórki bez komórek raka w probówce einor, aby jeszcze bardziej wzmocnić fenotypy miofibroblastyczne guza exp łydki jeden, wstrzyknąć mieszaninę tych komórek z siedmioma komórkami CF RA podskórnie do nagiej myszy. Wstrzyknąć również fibroblasty kontrolne same w jedną komórkę bez komórek rakowych, aby w razie potrzeby przygotować komórki kontrolne.

Inkubuj exp cielęce jedną komórkę przez dodatkowe okresy 200 dni w ksenoprzeszczepie guza, aby wytworzyć dwie komórki exp C w celu wzmocnienia fenotypu miofibroblastycznego promującego nowotwór. Generuj również kontrolę. Fibroblasty dwie komórki jako kontrola przeciwko exp cielęciu dwóch komórek poprzez wstrzyknięcie fibroblastów kontrolnych jednej komórki bez komórek rakowych do myszy, usunięcie guzów i umieszczenie ich w naczyniach do hodowli tkankowej.

Wypreparuj i dysocjuj przeszczep seno guza lub fibroblastów do zawiesiny pojedynczej komórki i hodowli. Komórki w 15-centymetrowej szalce petro z 10% F-C-S-D-M-E-M w obecności pur mycyny rozmnażają komórki, aż staną się dopełniaczem trypsyny i przechowują komórki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza za pomocą pożywki do zamrażania. Powstałe komórki oporne na pur mycynę są nazwane 242-dniowymi komórkami łydekowymi lub fibroblastami kontrolnymi dwie komórki oznaczone GFP exp cielę dwa i fibroblasty kontrolne dwie komórki wyekstrahowane z ksenoprzeszczepów guza piersi analizowano immunohisto chemicznie, jak pokazano na tym obrazie, komórki barwią się silnie dodatnio dla markerów mezenchymalnych, w tym specyficznej dla człowieka fermentacji prolo czterech hydroksylazy kolagenu jednego A fibronektyny S 100, Czwórka i białko powierzchniowe fibroblastów.

Wyniki te wskazują na ludzkie pochodzenie i mezenchymalny charakter tych komórek. W przeciwieństwie do tego, cytokeratyna, marker komórek nabłonkowych, nie została wybarwiona w tych fibroblastach GFP dodatnich razem wziętych. Odkrycia te sugerują, że dwie komórki EXP C i kontrolne fibroblasty pochodzą z rodzicielskich ludzkich fibroblastów sutkowych, początkowo wprowadzonych do ksenoprzeszczepów myszy.

Co ważne, znacznie wzrosła liczba dwóch komórek cielęcych XP wybarwionych dodatnio na obecność alfa SMA i glikoproteiny macierzy zewnątrzkomórkowej do nasyny C, z których obie są markerami miofibroblastów w porównaniu z dwoma komórkami kontrolnymi. Należy zauważyć, że większy odsetek miofibroblastów alfa SMMA-dodatnich jest obecny w dwóch komórkach exp cielęcia w porównaniu do obserwowanych w 42-dniowych komórkach exp cielęcia jeden. Dane te pokazują, że rezydujące ludzkie fibroblasty pamięci stopniowo angażują się w miofibroblasty cieląt w ksenoprzeszczepach guza podczas progresji guza po jego rozwoju.

Model ksenoprzeszczepu guza z komplementacją utorował drogę naukowcom zajmującym się mikrośrodowiskiem guza do zbadania procesów ewolucji normalnego fibroblastu w raka. Tak mówią fibroblasty.