Doświadczalne generowanie fibroblastów towarzyszących rakowi (CAF) z ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego

W niniejszym filmie opisano procedurę generowania fibroblastów związanych z rakiem (carcinoma associated fibroblasts, CAFs) z pierwotnych kultur ludzkich fibroblastów. Raki fibroblastyczne to złożone tkanki składające się z komórek nowotworowych oraz komponentu nienowotworowego, zwanego zrębem. Zrąb związany z guzem składa się z macierzy zewnątrzkomórkowej i różnego rodzaju komórek zrębowych, w tym fibroblastów, myofibroblastów, komórek śródbłonka, pericytów i leukocytów; fibroblasty związane z rakiem są bogate w myofibroblasty, które są charakterystyczne dla aktywowanych fibroblastów obecnych w obrębie guza.

Stroma odgrywa główną rolę w napędzaniu progresji nowotworu. Może ona być generowana in vitro poprzez wstępną izolację pierwotnych ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego z tkanki piersi pobranej podczas redukcyjnej plastyki piersi. Uzyskaną tkankę dysocjuje się do postaci zawiesiny pojedynczych komórek, a następnie unieśmiertelnia za pomocą transdukcji wirusowej i modyfikuje genetycznie w celu ekspresji GFP oraz genu oporności na puramycynę.

Następnie komórki są wstrzykiwane wspólnie z komórkami raka piersi człowieka MCF-7 podskórnie myszy z niedoborem odporności. Wstrzyknięte ludzkie fibroblasty pamięci przekształcą się w promujące nowotwór myofibroblasty nowotworu.

Następnie macierzyste fibroblasty gruczołu piersiowego są izolowane z ksenoprzeszczepów nowotworowych i hodowane w obecności puromycyny. Powstałe komórki oporne na puromycynę, nazywane eksperymentalnie wygenerowanymi CAF-ami (exp CAF), poddano analizie immunohistochemicznej, która wykazała, że pierwotnie obecne prawidłowe ludzkie fibroblasty piersiowe przekształcają się wewnątrz ksenoprzeszczepu nowotworowego w myofibroblasty CAF, które nabyły zdolność do promowania tumorigennezy. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak izolacja pierwotnych CAF-ów od pacjentek z rakiem piersi, jest możliwość eksperymentalnego generowania CAF-ów z ludzkich fibroblastów piersiowych poprzez współimplantację nowotworu.

Ogólną procedurę modelową zademonstrują Kar, stażysta podoktorski w moim laboratorium, oraz Ahmed Kar, doktorant w tym samym laboratorium. Należy rozpocząć od jednego grama zdrowej tkanki piersi człowieka, pobranej podczas redukcyjnej plastyki piersi. Tkankę należy kilkakrotnie przemyć w PBS, a następnie umieścić w 15 centymetrowej szalce Petriego i za pomocą sterylnego ostrza do golenia posiekać na małe fragmenty o rozmiarze mniejszym niż 1,5 mm³.

Następnie za pomocą żyletki przenieś fragmenty tkanki do probówki stożkowej o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml buforu do dysocjacji komórek na każde pół grama tkanki. Następnie wymieszaj na vortexu przez jedną minutę z maksymalną prędkością. Umieść probówkę na kołysce w inkubatorze w temperaturze 37 °C i pozostaw fragmenty tkanki do trawienia na 12 do 18 godzin.

Następnego dnia w probówce wciąż będzie znajdować się wiele nieprzetrawionych fragmentów tkanki; należy je wymieszać w wortexie. Najpierw, po wirowaniu z maksymalną prędkością, należy postawić probówkę na blacie i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej bez mieszania. Po inkubacji, za pomocą pipety fizjologicznej o pojemności pięciu mililitrów, należy przenieść otrzymany nadsącz (SUP) wzbogacony w komórki zrębu do nowej probówki stożkowej.

Następnie wiruj frakcję stromalną przez pięć minut przy 250 ×g. Po wirowaniu ponownie zawieś osad komórkowy w PBS, a następnie ponownie wiruj przez pięć minut przy 250 ×g. Następnie zawieś osad w DMEM uzupełnionym o 10% FCS i przenieś komórki do 15-centymetrowej szalki Petriego.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide. Po ośmiu do 10 dniach komórki powinny osiągnąć konfluencję. W tym momencie komórki należy zebrać; mogą one zostać zamrożone do długoterminowego przechowywania.

Aby unieśmiertelić wyizolowane pierwotne ludzkie prawidłowe fibroblasty pamięci, należy wprowadzić wektor retrowirusowy P MIG wykazujący ekspresję zarówno H turt, jak i GFP, hodować komórki przez cztery do pięciu dni, a następnie wyselekcjonować komórki GFP-dodatnie za pomocą cytometrii przepływowej. Do hodowli unieśmiertelnionych fibroblastów znakowanych GFP należy wprowadzić konstrukt retrowirusowy P babe puro kodujący gen oporności na puromycynę. Hodować komórki przez pięć do siedmiu dni w obecności puromycyny w stężeniu końcowym 1 µg/mL.

W celu wyizolowania unieśmiertelnionych ludzkich fibroblastów pamięci opornych na puromycynę i znakowanych GFP. Następnie należy zbadać, czy fibroblasty produkują aktywne wirusy, które mogą prowadzić do horyzontalnego transferu genów kodujących GFP oraz oporność na puromycynę. Przez dwa dni hodować 2,5 × 10⁵ unieśmiertelnionych ludzkich fibroblastów pamięci opornych na puromycynę w sześciocentymetrowej szalce Petriego.

Zebrać i przefiltrować medium warunkowane fibroblastów za pomocą filtra strzykawkowego o rozmiarze porów 0,45 micron. Następnie dodać je do komórek fibroblastów myszych w stadium 10 i pół i inkubować przez 12 godzin w obecności 5 µg/mL siarczanu białka, co zwiększa wydajność infekcji wirusowej. Po upływie 12 godzin wymienić medium na DMEM uzupełniony o 10% FCS i inkubować przez kolejne dwa dni.

Badanie komórek należy przeprowadzić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. 10 i pół komórki zakażonych wirusem GFP będzie wykazywać fluorescencję GFP. Następnie należy wymienić medium, aby poddać komórki działaniu stężenia 1 µg/mL.

Inkubuj z puromycyną przez pięć do siedmiu dni. Ponownie obserwuj komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby ustalić, czy komórki oporne na puromycynę utworzyły kolonie. Należy zauważyć, że horyzontalny transfer genów za pośrednictwem aktywnych wirusów wytwarzanych przez rodzielskie, oporne na puromycynę i znakowane GFP ludzkie fibroblasty gruczołu piersiowego może nadać oporność otaczającym, wrażliwym na puromycynę komórkom mysim oraz komórkom raka.

Oporność na puromycynę i pozytywność GFP wewnątrz ksenograftu nowotworowego. Może to utrudniać proces izolacji wstrzykniętych, znakowanych GFP i opornych na puromycynę ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego z ksenograftu w celu eksperymentalnego wytworzenia fibroblastów związanych z rakiem do wstrzyknięcia myszy z niedoborem odporności. Należy rozpocząć od trypsynizacji i policzenia nowo przygotowanej linii komórkowej ludzkiego gruczołu piersiowego wraz z linią komórkową ludzkiego raka piersi MCF7 RAs w nowych probówkach typu microcentrifuge.

Resuspend 1×10⁶ komórek raka piersi człowieka MC77R oraz 3×10⁶ GFP-znakowanych, opornych na puromycynę unieśmiertelnionych fibroblastów gruczołu piersiowego człowieka w 400 µL pożywki hodowlanej z 50% matrigelu na jedną iniekcję. Protki należy umieścić na lodzie jako kontrolę.

Przygotuj również analogiczne fibroblastami gruczołu piersiowego człowieka, lecz bez komórek MCF seven RA. Następnie, używając igły o rozmiarze 27 G, wstrzyknij mieszaninę komórek podskórnie u immunodeficyjnej myszy nude, aby zbadać wewnątrznowotworową zmienność fenotypów calfs. Wyizoluj calfs oraz fibroblasty kontrolne z kilku różnych ksenoprzeszczepów nowotworowych.

Następnie wszczep każdą z mieszanin w prawą i lewą stronę u każdej myszy. Pozostaw ksenoprzeszczepy guza lub fibroblastów do wzrostu przez 42 dni po iniekcji. Okres inkubacji fibroblastów w obrębie ksenoprzeszczepu guza należy zoptymalizować w zależności od fenotypu miofibroblastów nabytego przez fibroblasty rodzicielskie w guzie.

Aby wyizolować fibroblasty z ciał ksetnograftów lub grup kontrolnych z uśpionej myszy, umieść co najmniej 0,5 g tkanki ksetnograftu oraz co najmniej 0,1 g tkanki ksetnograftu z fibroblastami w osobnych naczyniach. Następnie, za pomocą sterylnej żyletki, posiekaj tkankę na małe fragmenty o objętości mniejszej niż 1,5 mm³. Potem przenieś fragmenty tkanki żyletką do probówki stożkowej o pojemności 15 ml zawierającej bufor do dysocjacji komórek i wiruj w wstrząsarku wortex przez jedną minutę z maksymalną prędkością. Inkubuj zawiesinę komórkową przez trzy godziny w temperaturze 37 °C przy ciągłym, powolnym mieszaniu, a następnie odwiruj zawiesinę komórkową.

Rozdzielono albo z guza, albo z przeszczepu sano z włókna szklanego przez pięć minut przy 250 ×g podczas wirowania. Osad komórkowy zawieszono ponownie w PBS i powtórzono wirowanie. Następnie otrzymany osad komórkowy zawieszono ponownie w DMEM uzupełnionym o 10% FCS, aby wyizolować kulturę rodzistych ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego opornych na purmycynę.

Komórki pochodzące z guza lub fibroblasty hoduje się na płycie Petri o średnicy 15 cm w obecności 1 µg/mL puramycyny w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Pozwoli to na wyeliminowanie wszelkich zanieczyszczeń komórkami raka i/lub komórkami mysimi.

Namnażaj komórki stromalne aż do uzyskania konfluencji, a następnie przechowuj je w temperaturze -80 °C w medium do mrożenia. Należy pamiętać, że otrzymane komórki oporne na purymycynę, oznaczone jako 42-dniowe komórki XP calf 1 lub kontrolne komórki fibroblast 1, są nieśmiertelne i wykazują ekspresję GFP. Fibroblasty pamięciowe człowieka zwiększają swój pronowotworowy fenotyp myofibroblastyczny wewnątrz ksenoprzeszczepu guza poprzez oddziaływanie z komórkami raka podczas progresji nowotworu. Wymieszaj 1 × 10⁶ komórek MCF7 RA oraz 3 × 10⁶ komórek 42-dniowych P calf.

Zawiesić komórki w 400 µL pożywki hodowlanej z 50% Matrigel w 1,5 ml probówce typu Eppendorf. Przygotować również 3 × 10⁶ 42-dniowych fibroblastów kontrolnych w probówce, bez komórek raka, aby dodatkowo wzmocnić pronowotworowe fenotypy myofibroblastyczne komórek exp calf. Mieszaninę tych komórek wraz z komórkami CF seven RA wstrzyknąć podskórnie myszy nude. W razie potrzeby wstrzyknąć same fibroblasty kontrolne bez komórek nowotworowych w celu przygotowania grupy kontrolnej.

Inkubować komórki exp calf one przez dodatkowe 200 dni w ksenoprzeszczepie nowotworowym w celu wygenerowania komórek exp C two, aby wzmocnić myofibroblastyczny fenotyp promujący rozwój nowotworu. W celu uzyskania kontroli dla komórek exp calf two należy również wygenerować komórki control fibroblasts two poprzez wstrzyknięcie komórek control fibroblasts one bez komórek raka do myszy, a następnie usunąć guzy i przenieść je do naczyń hodowlanych.

Przeprowadź dyssekcję i dysocjację guza lub przeszczepu fibroblastów do postaci zawiesiny pojedynczych komórek i poddaj je hodowli. Komórki w 15 centymetrowej płytce Petri z 10% F-C-S-D-M-E-M w obecności purmycyny namnażaj aż do osiągnięcia konfluencji, następnie potraktuj trypsyną i zamroź komórki w temperaturze -80°C, stosując medium do mrożenia. Powstałe oporne na purmycynę komórki nazwano komórkami 242 day old exp calf two lub kontrolnymi komórkami fibroblastów two cells GFP labeled exp calf two i kontrolnymi komórkami fibroblastów two cells. Komórki wyizolowane z ksenoprzeszczepów guzów piersi analizowano immunohistochemicznie, jak pokazano na tym obrazie; komórki wykazują silne barwienie w kierunku markerów mezenchymalnych, w tym specyficznej dla ludzi prolylohydroksylazy kolagenu typu I, fibronektyny, S 100, A4 oraz białka powierzchniowego fibroblastów.

Wyniki te wskazują na ludzkie pochodzenie oraz mezenchymalny charakter tych komórek. W przeciwieństwie do tego, cytokeratyna, będąca markerem komórek nabłonkowych, nie wybarwiła się w tych pozytywnych pod kątem GFP fibroblastach. Powyższe ustalenia sugerują, że komórki EXP C two oraz fibroblasty kontrolne two pochodzą od rodzicielskich ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego, które zostały początkowo wprowadzone do ksenograftów mysich.

Co istotne, znacznie większa liczba komórek XP calf two wykazala pozytywne barwienie dla alpha SMA oraz glikoproteiny macierzy zewnątrzkomórkowej tenascyny C, które są markerami miofibroblastów, w porównaniu do kontrolnych komórek fibroblastów two. Należy zauważyć, że w komórkach exp calf two występuje wyższy odsetek miofibroblastów pozytywnych pod kątem alpha smma niż w komórkach exp calf one w 42. dniu. Dane te wykazują, że rezydentne ludzkie fibroblasty pamięci stopniowo przekształcają się w miofibroblasty calf w ksenoprzeszczepach guza podczas jego progresji po rozwoju.

Model ksenoprzeszczepu guza z komplementacją utorował drogę badaczom zajmującym się mikrośrodowiskiem nowotworowym do badania procesów ewolucji prawidłowych fibroblastów w komórki nowotworowe. Tak mówią fibroblasty.