Name: Eksperymentalne wytwarzanie fibroblastów związanych z rakiem (CAF) z ludzkich fibroblastów sutkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 43 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania fibroblastów związanych z rakiem (CAF) z ludzkich fibroblastów sutkowych przy użyciu modelu ksenograftu. Ta technika pozwala badać rolę mikrośrodowiska nowotworowego w progresji raka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr. Robertowi A. Weinbergowi (Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge) za hojne wsparcie i nadzór nad tą pracą oraz panu Kieranowi Mellody'emu (University of Manchester, Manchester) za krytyczną redakcję niniejszego manuskryptu. Projekt ten był wspierany przez grant Research UK (CR-UK) o numerze C147/A6058 (A.O.).

1. Izolacja pierwotnych hodowli ludzkich normalnych fibroblastów gruczołu piersiowego
Procedury eksperymentalne dotyczące izolacji pierwotnych hodowli ludzkich prawidłowych fibroblastów gruczołu piersiowego przedstawiono na Rys. 1A.
<ol>
	<li>Przygotować bufor do dysocjacji komórek zgodnie z wcześniejszym opisem12: podłoże DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) z 10% płodową surowicą cielęcą (FCS), penicyliną-streptomycyną (200 units/ml), kolagenazą typu I (1 mg/ml) oraz hialuronidazą (125 units/ml).</li>
	<li>Tkankę piersi pobraną podczas plastyki redukcyjnej (~0.5 gram) kilkukrotnie przemyć w solance fosforanowej (PBS). Tkankę rozdrobnić na małe fragmenty (&lt;1.5 mm3) za pomocą sterylnych żyletek.</li>
	<li>Fragmenty tkanki przenieść do probówki stożkowej o pojemności 15 ml zawierającej odpowiednią ilość powyższego buforu do dysocjacji komórek (10 ml na 0.5 gram tkanki) i mieszać na wirówce typu vortex przez 1 min z maksymalną prędkością.</li>
	<li>Trawić fragmenty tkanki w buforze do dysocjacji komórek przez 12-18 h w temperaturze 37°C przy wolnym mieszaniu. *Należy pamiętać, że w probówce pozostanie wciąż wiele nieprzetrawionych fragmentów tkanki.</li>
	<li>Inkubować probówkę przez 5 min w temperaturze pokojowej bez mieszania. Powstały nadsącz wzbogacony w komórki zrębowe przenieść do nowej probówki stożkowej za pomocą pipety serologicznej 5 ml.</li>
	<li>Frakcję zrębową wirować przez 5 min przy 250 X g i resuspendować osad komórkowy w PBS. Wirować ponownie przez 5 min przy 250 X g i resuspendować osad komórkowy w podłożu DMEM uzupełnionym o 10% FCS. Hodować komórki w podłożu DMEM zawierającym 10% FCS w szalce Petriego o średnicy 15 cm w temperaturze 37°C i 5% dwutlenku węgla.</li>
	<li>Namnażać komórki do momentu uzyskania konfluencji. Zazwyczaj trwa to 8-10 dni. Komórki przechowywać w temperaturze -80°C w medium do mrożenia (10% dimetylosulfoksyd i 20% FCS w DMEM). Przygotować 5 zamrożonych fiolek jako zapas pierwotny. Rozmrozić jedną fiolkę i namnożyć komórki, aby przygotować 5 fiolek zapasu wtórnego zawierającego fibroblasty pasażowane w obrębie 5 podwojeń populacji (PDs) do kolejnych eksperymentów. Procedury te minimalizują selekcję klonalną oraz stres hodowlany, które mogłyby wystąpić podczas przedłużonej hodowli tkankowej. *Należy pamiętać, że procedury P1.1-7 mogą być również stosowane do izolacji CAF z raków piersi pobranych podczas mastektomii12.</li>
</ol>
2. Generowanie unieśmiertelnionych ludzkich normalnych fibroblastów piersiowych, znakowanych GFP i opornych na puromycynę
<ol>
	<li>Aby unieśmiertelnić pierwotne ludzkie normalne fibroblasty piersiowe wyizolowane w P1.7), wprowadź wektor retrowirusowy pMIG (MSCV-IRES-GFP)12, wykazujący ekspresję zarówno hTERT, jak i GFP. Hoduj komórki przez 4-5 dni, a następnie wyselekcjonuj komórki GFP-dodatnie za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Wprowadź konstrukt retrowirusowy pBabe-puro kodujący gen oporności na puromycynę do oznakowanych GFP unieśmiertelnionych fibroblastów. Hoduj komórki przez 5-7 dni w obecności puromycyny (stężenie końcowe: 1 μg/ml), aby wyizolować GFP-dodatnie (GFP+), oporne na puromycynę (puroR) unieśmiertelnione ludzkie fibroblasty piersiowe.</li>
	<li>Następnie, aby zbadać, czy fibroblasty te produkują aktywne wirusy, co może prowadzić do horyzontalnego transferu genów kodujących GFP i oporność na puromycynę, wyhoduj 2,5x105 GFP+puroR unieśmiertelnionych ludzkich fibroblastów piersiowych w 6 cm szalce Petriego przez 2 dni.</li>
	<li>Przefiltruj medium warunkowane przez te fibroblasty za pomocą filtra strzykawkowego (rozmiar porów: 0,45 μm) i dodaj je do mysich komórek fibroblastycznych 10T1/2 na 12h w obecności siarczanu protaminy (5 μg/ml), który zwiększa wydajność infekcji wirusowej. Następnie zmień medium na 10% FCS-DMEM na kolejne 2 dni.</li>
	<li>Zbadaj komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Komórki 10T1/2 zainfekowane wirusem GFP staną się GFP-dodatnie. Poddaj komórki działaniu puromycyny (1 μg/ml) przez 5-7 dni i obserwuj szalkę, czy występują jakiekolwiek komórki 10T1/2 puroR i czy tworzą one kolonie po traktowaniu puromycyną.</li>
	<li>Należy zauważyć, że horyzontalny transfer genów za pomocą aktywnych wirusów produkowanych przez rodzicele GFP+puroR ludzkie fibroblasty piersiowe może sprawić, że otaczające mysie komórki i/lub komórki raka staną się GFP+puroR w obrębie ksenoprzeszczepów nowotworowych. Może to utrudnić procesy izolacji początkowo wstrzykniętych GFP+puroR ludzkich fibroblastów piersiowych z ksenoprzeszczepów nowotworowych.</li>
</ol>
3a. Współiniekcja ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego wraz z komórkami raka piersi do myszy z niedoborem odporności
Procedury eksperymentalne służące do generowania exp-CAF przedstawiono na rys. 1Ba.
<ol>
	<li>Wymieszać 1x106 komórek raka piersi człowieka MCF-7-ras oraz 3x106 GFP+puroR unieśmiertelnionych fibroblastów gruczołu piersiowego człowieka wytworzonych w P2.2). Przygotować komórki w 400 μl pożywki hodowlanej z 50% (v/v) Matrigel na jedną iniekcję.</li>
	<li>Wstrzyknąć mieszaninę komórek podskórnie w immunodeficyjną mysz naga. W przypadku niezależnego pozyskiwania CAF z różnych guzów, wszczepić każdą mieszaninę w prawy i lewy bok kilku myszy.</li>
</ol>
3b. Iniekcja ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego do myszy z niedoborem odporności
<ol>
	<li>Aby wygenerować fibroblasty kontrolne w opozycji do exp-CAFs, przygotować 3x106 unieśmiertelnionych ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego GFP+puroR wygenerowanych w P2.2 w 400 μl pożywki hodowlanej z 50% (v/v) Matrigel na jedną iniekcję (Ryc. 1Bb). NIE mieszać fibroblastów z komórkami raka.</li>
	<li>Zaimplantować fibroblasty przygotowane w P3b.1 w miejsca podskórne myszy nude.</li>
</ol>
*Należy pamiętać, że zaszczepione fibroblasty utworzą tkankę fibroblastyczną, a nie guz pod skórą.
4a. Disekcja ksenoprzeszczepu nowotworowego
<ol>
	<li>Uśmierć mysz z podskórnym ksenoprzeszczepem ludzkiego raka piersi 42 dni po implantacji (Rys. 1Ba). *Należy pamiętać, że w przypadku współimplantacji innych komórek raka i/lub fibroblastów, fibroblasty mogą wymagać inkubacji w ksenoprzeszczepie nowotworowym przez okres dłuższy niż 42 dni, aby zainicjować swój fenotyp miofibroblastyczny.</li>
	<li>Pobierz ksenoprzeszczep nowotworu z boku myszy, stosując rozszerzanie tępe za pomocą pęsety i nożyczek. Zanurz tkankę nowotworową w PBS.</li>
</ol>
4b. Disekcja ksenoprzeszczepu fibroblastów
<ol>
	<li>Uśmierć mysz z ksenoprzeszczepem fibroblastów 42 dni po implantacji (Rys. 1Bb).</li>
	<li>Wypreparuj podskórny ksenoprzeszczep fibroblastów za pomocą pęsety i nożyczek. Umieść tkankę fibroblastyczną w PBS. *Należy pamiętać, że ksenoprzeszczep fibroblastów, który wygląda jak niewielka przezroczysta tkanka, może być trudny do odnalezienia pod skórą.</li>
</ol>
5. Przygotowanie pierwotnych kultur komórkowych z ksenoprzeszczepów
<ol>
	<li>W sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza należy przeprowadzić sekcję guza (˜0.5 gram) lub tkanki fibroblastycznej (˜0.1 gram). Wycięte tkanki przenieść na dno 15 cm szalki hodowlanej z 1 ml PBS. Tkanki posiekać na małe fragmenty (&lt;1.5 mm3) za pomocą sterylnych żyletek. *Uwaga: jeśli ksenoprzeszczep fibroblastyczny waży mniej niż 0.1 gram, należy zebrać kilka dodatkowych ksenoprzeszczepów i wymieszać je ze sobą, aby zwiększyć liczbę komórek do izolacji.</li>
	<li>Fragmenty tkanki przenieść do 15 ml probówki stożkowej zawierającej bufor do dysocjacji komórek (10 ml na 0.5 gram tkanki) i mieszać w wirówce typu vortex przez 1 min z maksymalną prędkością.</li>
	<li>Zawiesinę komórkową inkubować przez 3 h w temperaturze 37°C przy ciągłym, wolnym mieszaniu.</li>
</ol>
6. Izolacja komórek opornych na puromycynę w hodowli
<ol>
	<li>Odwiruj zawiesinę komórkową wydzieloną z ksenoprzeszczepu guza lub fibroblastów przez 5 min przy 250 X g, a następnie resuspenduj osad komórkowy w PBS. Odwiruj ponownie przez 5 min przy 250 X g. Resuspenduj otrzymany osad komórkowy w 10% FCS-DMEM. Hoduj komórki w 15 cm szalce Petriego w obecności puromycyny (1 μg/ml) w temperaturze 37°C i 5% dwutlenku węgla, aby wyeliminować wszelkie zanieczyszczające komórki raka i/lub mysie komórki zrębu. Namnażaj komórki do momentu osiągnięcia konfluencji (2-4 tygodnie). Przechowuj komórki w temperaturze -80°C, używając medium do mrożenia. *Należy zauważyć, że otrzymane komórki puroR, oznaczone jako 42-day-old exp-CAF1 (Ryc. 1Ba) lub kontrolne komórki fibroblast-1 (Ryc. 1Bb), są nieśmiertelne i wykazują pozytywny wynik dla GFP. Zaleca się sprawdzenie, czy komórki te produkują aktywne wirusy, wykorzystując komórki 10T1/2, zgodnie z opisem w P2.3-6.</li>
</ol>
7a. Izolacja komórek exp-CAF2 w hodowli
Aby dodatkowo wzmocnić aktywowany fenotyp miofibroblastyczny CAF, zmieszać 42-dniowe komórki exp-CAF1 z komórkami MCF-7-ras i ponownie wstrzyknąć je podskórnie myszy nude na dodatkowy okres 200 dni. Wypreparować i zdysocjować ksenoprzeszczep nowotworowy do postaci zawiesiny pojedynczych komórek, a następnie hodować komórki w 15 cm szalce Petriego w DMEM z 10% FCS w obecności puromycyny (1 μg/ml), zgodnie z opisem w P6.1. Namnażać komórki do momentu osiągnięcia konfluencji (8-10 dni). Przechowywać komórki w temperaturze -80°C przy użyciu medium do mrożenia. Otrzymane komórki puroR nazwano 242-dniowymi komórkami exp-CAF2 (Ryc. 1Ba).
7b. Ekstrakcja kontrolnych hodowli komórek fibroblast-2
Aby uzyskać fibroblasty kontrolne przeciwko komórkom exp-CAF2, wstrzyknij podskórnie u myszy nude same komórki kontrolnego fibroblasta-1 w wieku 42 dni, bez komórek raka, i utrzymuj przez kolejne 200 dni. Wypreparuj i zdysocjuj tkankę fibroblastyczną do postaci zawiesiny pojedynczych komórek, a następnie hoduj komórki w 15 cm szalce Petriego w pożywce 10% FCS-DMEM z dodatkiem puromycyny (1 μg/ml), zgodnie z opisem w P6.1. Namnażaj komórki do momentu uzyskania konfluencji (3-4 tygodnie). Przechowuj komórki w temperaturze -80°C w medium do zamrażania. Uzyskane komórki puroR nazwano komórkami kontrolnego fibroblasta-2 (Rys. 1Bb).
8. Reprezentatywne wyniki:
Kontrolne komórki fibroblast-2 oraz exp-CAF2, wyizolowane z ksenoprzeszczepów guzów piersi, wykazały silnie dodatnie barwienie na markery mezenchymalne, w tym specyficzną dla ludzi wimentynę, prolylo-4-hydroksylazę, kolagen 1A, fibronektynę, S100A4 oraz białko powierzchniowe fibroblastów (Rys. 2A)11, co wskazuje na ludzkie pochodzenie i charakter mezenchymalny tych komórek. Z kolei cytokeratyna, będąca markerem komórek nabłonkowych, nie uległa zabarwieniu w tych fibroblastach GFP+ (Rys. 2B). Wyniki te sugerują zatem, że wyizolowane komórki exp-CAF2 i kontrolne fibroblast-2 pochodzą od rodzicielskich ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego, które zostały początkowo wprowadzone do ksenoprzeszczepów mysich.
Co istotne, wyższy odsetek komórek exp-CAF2 barwił się dodatnio na α-SMA oraz glikoproteinę macierzy zewnątrzkomórkowej tenascynę-C5, które są markerami miofibroblastów, w porównaniu do 42-dniowych komórek exp-CAF1 oraz kontrolnych fibroblastów-2 (Ryc. 2C, D)11. Dane te wskazują, że rezydentne ludzkie fibroblasty gruczołu piersiowego stopniowo przekształcają się w miofibroblasty CAF w ksenograftach nowotworowych.
<img alt="Schemat interakcji między komórkami raka piersi a fibroblastami; sortowanie FACS; proces progresji guza." src="/files/ftp_upload/3201/3201fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1 Schematyczna reprezentacja izolacji ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego. A) Tkankę z plastyki redukcyjnej piersi posiekano za pomocą sterylnych żyletek (P1.2) i przeniesiono do stożkowej probówki 15 ml (P1.3). Małe fragmenty tkanki poddano trawieniu w buforze do dysocjacji komórek (P1.4) i przygotowano do hodowli in vitro (P1.5-7). Aby unieśmiertelić wyizolowane pierwotne ludzkie fibroblasty gruczołu piersiowego, wprowadzono retrowirusowy wektor pMIG (MSCV-IRES-GFP), wykazujący ekspresję zarówno hTERT, jak i GFP, a otrzymane komórki GFP-dodatnie posortowano przy użyciu cytometrii przepływowej (P2.1). Następnie do tych komórek wprowadzono retrowirusowy wektor pBabe-puro kodujący gen oporności na puromycynę. Po zastosowaniu puromycyny wyizolowano unieśmiertelone ludzkie fibroblasty gruczołu piersiowego znakowane GFP (GFP+) i oporne na puromycynę (PuroR) (P2.2).
Ba) W celu wygenerowania exp-CAF, unieśmiertelnione ludzkie fibroblasty gruczołu piersiowego GFP+puroR wstrzyknięto wspólnie z komórkami raka piersi MCF-7-ras podskórnie immunodeficyjnej myszy naga (P3a). Ksenoprzeszczep guza wycięto 42 dni po implantacji (P4a) i poddano dysocjacji do zawiesiny pojedynczych komórek (P5). Komórki te hodowano następnie in vitro w obecności puromycyny, aby wyeliminować wszelkie zanieczyszczające komórki raka oraz komórki stromalne myszy (P6). Uzyskane komórki oporne na puromycynę określono jako eksperymentalnie wygenerowane komórki CAF1 (exp-CAF1). Komórki te, wycięte 42 dni po implantacji, ponownie zmieszano z komórkami MCF-7-ras i zaimplantowano podskórnie myszy biorcy w taki sam sposób jak poprzednio (P7a). Powstałemu guzowi pozwolono rosnąć przez dodatkowe 200 dni, a następnie go wycięto, poddano dysocjacji i hodowano w obecności puromycyny. Wyizolowane komórki oporne na puromycynę określono jako komórki exp-CAF2 (wiek 242 dni).
Bb)W celu wyizolowania komórek kontrolnych do porównania z exp-CAF, unieśmiertelnione ludzkie fibroblasty gruczołu piersiowego GFP+puroR wstrzyknięto podskórnie myszy nude jako czyste hodowle, bez dodatku komórek MCF-7-ras (P3b). Tkankę fibroblastyczną, wyciętą 42 dni po implantacji (P4b), rozdzielono do zawiesin pojedynczych komórek (P5), a komórki oporne na puromycynę, nazwane komórkami fibroblastów kontrolnych-1, wyizolowano zgodnie z wcześniejszym opisem (P6). Fibroblasty te ponownie implantowano podskórnie myszy nude, ponownie bez komórek MCF-7-ras, na okres 200 dni (P7b). Tkankę fibroblastyczną wycięto, rozdzielono i hodowano w obecności puromycyny. Wyizolowane komórki oporne na puromycynę nazwano komórkami fibroblastów kontrolnych-2 (w wieku 242 dni).
<img alt="Ekspresja białek komórkowych; Obrazy immunofluorescencyjne; Fibroblasty eksperymentalne i kontrolne; Wyniki przedstawione na wykresie słupkowym." src="/files/ftp_upload/3201/3201fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2 Exp-CAF i fibroblasty kontrolne pochodzą od macierzystych ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego. (A) Analizy immunofluorescencyjne komórek fibroblastu kontrolnego-2 (control f.) i exp-CAF2. Oba typy komórek wykazują pozytywne barwienie na markery mezenchymalne (czerwony), w tym ludzką wimentynę, prolylo-4-hydroksylazę, kolagen 1A, fibronektynę, S100A4 oraz białko powierzchniowe fibroblastów. (B) W przeciwieństwie do tego, pan-cytokeratyna, marker komórek nabłonkowych, nie jest wykrywana w komórkach exp-CAF2 exprimujących GFP (zielony). Jądra komórkowe są barwione 4'-6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI) (niebieski). Pasek skali, 50 μm (za: Kojima et al.11)
(C) Immunofluorescencja komórek exp-CAF2 oraz kontrolnych fibroblastów-2 (control f.) z użyciem przeciwciał przeciwko α-SMA (czerwony) lub tenascynie-C (TN-C) (czerwony). Jądra komórkowe są barwione DAPI (niebieski). Pasek skali, 50 μm. (D) 48% komórek exp-CAF2 wykazuje pozytywne barwienie na α-SMA, podczas gdy 14% 42-dniowych komórek exp-CAF1 oraz 2,5% populacji kontrolnych fibroblastów-2 jest pozytywnych pod kątem α-SMA. (adapted from Kojima et al.11)

<ol><li>Ronnov-Jessen, L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+by+proxy%3A+can+the+microenvironment+be+both+the+cause+and+consequence%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Breast cancer by proxy: can the microenvironment be both the cause and consequence?</a> Trends Mol. Med. 15, 5-13 (2009).</li>
<li>Mueller, M. M., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friends+or+foes+-+bipolar+effects+of+the+tumour+stroma+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 4, 839-849 (2004).</li>
<li>Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+fibroblasts+in+cancer+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression.</a> Nature. 432, 332-337 (2004).</li>
<li>Kalluri, R., Zeisberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).</li>
<li>De Wever, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tenascin-C+and+SF%2FHGF+produced+by+myofibroblasts+in+vitro+provide+convergent+pro-invasive+signals+to+human+colon+cancer+cells+through+RhoA+and+Rac%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Tenascin-C and SF/HGF produced by myofibroblasts in vitro provide convergent pro-invasive signals to human colon cancer cells through RhoA and Rac.</a> 18, 1016-1018 (2004).</li>
<li>Serini, G., Gabbiani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+myofibroblast+activity+and+phenotypic+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation.</a> Exp. Cell. Res. 250, 273-283 (1999).</li>
<li>Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinoma-associated+fibroblasts+are+a+rate-limiting+determinant+for+tumour+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression.</a> Semin. Cell. Dev. Biol. 21, 19-25 (2010).</li>
<li>Pietras, K., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+interactions+with+the+tumor+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma.</a> Exp. Cell. Res. 316, 1324-1331 (2010).</li>
<li>Polyak, K., Haviv, I., Campbell, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-evolution+of+tumor+cells+and+their+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Co-evolution of tumor cells and their microenvironment.</a> Trends in Genetics. 25, 30-38 (2009).</li>
<li>Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+associated+fibroblasts+in+cancer+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis.</a> Semin. Cell. Dev. Biol. 21, 33-39 (2010).</li>
<li>Kojima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine+TGF-beta+and+stromal+cell-derived+factor-1+%28SDF-1%29+signaling+drives+the+evolution+of+tumor-promoting+mammary+stromal+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 20009-20014 (2010).</li>
<li>Orimo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+fibroblasts+present+in+invasive+human+breast+carcinomas+promote+tumor+growth+and+angiogenesis+through+elevated+SDF-1%2FCXCL12+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion.</a> Cell. 121, 335-348 (2005).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Brak markerów specyficznych dla CAF oraz poziom heterogeniczności obserwowany wśród tych komórek sprawiają, że charakterystyka tego typu komórek stanowi samo w sobie wyzwanie. Badania nad CAF in vitro były dodatkowo utrudnione przez fakt, że komórki te ulegają starzeniu i przestają proliferować podczas długotrwałej hodowli. Nasza poprzednia próba bezpośredniej immortalizacji pierwotnych CAF z użyciem retrowirusowej konstrukcji cDNA hTERT zakończyła się niepowodzeniem. Aby zatem dalej badać właściwości pronowotwo...

<table><tbody><tr><td>DMEM </td><td>Invitrogen</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>Surowica z płodu cielęcego </td><td>GIBCO, firmy Life Technologies</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna </td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu I </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130-1G</td><td></td></tr><tr><td>hialuronidaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4272</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko wimentynie (V9)</td><td>Novocastra Laboratories</td><td>&lt;p&gt;NCL-L-&lt;/p&gt;VIM-V9</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko tenascynie C (BC-8)</td><td></td><td></td><td>&lt;p&gt;uprzejmie otrzymany od&lt;br/&gt;dr &lt;strong&gt;Luciano &lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;&lt;strong&gt;Zardi&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&amp;alpha;przeciwciało -SMA-Cy3 (1A4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6198</td><td></td></tr><tr><td>&lt;p&gt;Prolilo-4-hydroksylaza &lt;/p&gt;</td><td>Dako</td><td>M0877</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało (5B5)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko kolagenowi typu 1 1A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA011795</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko pankytokeratynie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5992</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko fibronektynie</td><td>BD Biosciences</td><td>610077</td><td></td></tr><tr><td>&lt;p&gt;S100A4/FSP-1 (białko specyficzne dla fibroblastów-&lt;/p&gt;przeciwciało przeciwko białku specyficznemu 1 (specific protein-1)</td><td>Dako</td><td>A5114</td><td></td></tr><tr><td>&lt;p&gt;Białko powierzchniowe fibroblastów &lt;/p&gt;przeciwciało (klon 1B10)</td><td>Abcam</td><td>ab11333</td><td></td></tr><tr><td>konstrukt MSCV-IRES-GFP</td><td></td><td></td><td>Prośba do autorów</td></tr><tr><td>konstrukt pBabe-puro</td><td></td><td></td><td>&lt;p&gt;Zakup &lt;/p&gt;z Addgene</td></tr><tr><td>Puromycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>probówka stożkowa 15 ml</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>Myszy nago (myszy nude)</td><td>Taconic</td><td>NCRNU-F</td><td>Samice myszy NCr nude</td></tr><tr><td>komórki C3H/10T1/2</td><td>ATCC</td><td></td><td>CCL-226</td></tr></tbody></table>

doświadczalne generowanie fibroblastów towarzyszących rakowi (caf) z ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Rakowiaki są złożonymi tkankami składającymi się z komórek nowotworowych oraz komponentu niezłośliwego, określanego mianem „zrębu”. Zrąb składa się z macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) oraz różnorodnych komórek mezenchymalnych, w tym fibroblastów, myofibroblastów, komórek śródbłonka, perycytów i leukocytów 1-3.
Zraz zorientowany na guz odpowiada na liczne sygnały parakrynne uwalniane przez sąsiadujące komórki raka. W przebiegu choroby zraz często zostaje zasiedlony przez fibroblasty związane z rakiem (CAF), w tym liczne miofibroblasty. Komórki te były wcześniej izolowane z wielu różnych typów ludzkich raków w celu ich hodowli in vitro. Subpopulację CAF można odróżnić na podstawie zwiększonej ekspresji α-aktyny mięśni gładkich (α-SMA)4,5. Komórki te są cechą charakterystyczną dla „aktywowanych fibroblastów”, które wykazują właściwości podobne do miofibroblastów powszechnie obserwowanych w uszkodzonych i zwłókniałych tkankach 6. Obecność tej miofibroblastycznej podgrupy CAF jest ściśle związana z nowotworami wysokiego stopnia złośliwości i wiąże się ze złym rokowaniem u pacjentów.
Wiele laboratoriów, w tym nasze, wykazało, że CAF-y po wstrzyknięciu wraz z komórkami raka do myszy z niedoborem odporności są w stanie znacznie promować tumorigenezę 7-10. Jednak CAF-y pozyskane od pacjentów z rakiem często ulegają starzeniu podczas hodowli, co ogranicza możliwość ich szerokiego wykorzystania w toku prowadzonych eksperymentów. Aby przezwyciężyć tę trudność, opracowaliśmy nową technikę eksperacyjnego generowania unieśmiertelnionych linii komórkowych ludzkich CAF gruczołu piersiowego (exp-CAF) z ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego, wykorzystując model ksenoprzeszczepu guza piersi z implantacją współdzieloną.
W celu wygenerowania exp-CAF, macierzyste ludzkie fibroblasty gruczołu piersiowego, uzyskane z tkanki po redukcyjnej mammoplastyce, zostały najpierw unieśmiertelnione za pomocą hTERT, katalitycznej podjednostki holoenzymu telomerazy, oraz zmodyfikowane tak, aby eksponowały GFP oraz gen oporności na puromycynę. Komórki te zostały współimplantowane wraz z ludzkimi komórkami raka piersi MCF-7 eksponującymi aktywny onkogen ras (komórki MCF-7-ras) do ksenoprzeszczepu mysiego. Po okresie inkubacji in vivo, pierwotnie wstrzyknięte ludzkie fibroblasty gruczołu piersiowego wyekstrahowano z ksenoprzeszczepów nowotworowych na podstawie ich oporności na puromycynę 11.
Zaobserwowaliśmy, że rezydentne ludzkie fibroblasty piersi uległy różnicowaniu, przyjmując fenotyp miofibroblastyczny i nabywając właściwości pronowotworowe w przebiegu progresji guza. Co istotne, komórki te, zdefiniowane jako exp-CAF, ściśle naśladują pronowotworowy fenotyp miofibroblastyczny CAF izolowanych z raków piersi pobranych od pacjentów. Zatem nasze exp-CAF pochodzące z ksenoprzeszczepów nowotworowych stanowią skuteczny model do badania biologii CAF w ludzkich rakach piersi. Opisany protokół można również rozszerzyć w celu generowania i charakteryzowania różnych populacji CAF pochodzących z innych typów raków ludzkich.

Fibroblasty związane z rakiem (CAFs), bogate w myofibroblasty obecne w zrębie guza, odgrywają kluczową rolę w stymulowaniu progresji nowotworu. Opracowaliśmy model ksenoprzeszczepu guza z jednoczesną implantacją w celu eksperymentalnego generowania CAF z ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego. Protokół opisuje sposób tworzenia myofibroblastów CAF, które nabywają zdolności do promowania tumorigennezy.

Doświadczalne generowanie fibroblastów towarzyszących rakowi (CAF) z ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego

Gruczolaki to złożone tkanki składające się z komórek nowotworowych oraz komponentu nienowotworowego, określanego mianem „zrębu”. Zrąb składa się z ...

W niniejszym filmie opisano procedurę generowania fibroblastów związanych z rakiem (carcinoma associated fibroblasts, CAFs) z pierwotnych kultur ludzkich fibroblastów. Raki fibroblastyczne to złożone tkanki składające się z komórek nowotworowych oraz komponentu nienowotworowego, zwanego zrębem. Zrąb związany z guzem składa się z macierzy zewnątrzkomórkowej i różnego rodzaju komórek zrębowych, w tym fibroblastów, myofibroblastów, komórek śródbłonka, pericytów i leukocytów; fibroblasty związane z rakiem są bogate w myofibroblasty, które są charakterystyczne dla aktywowanych fibroblastów obecnych w obrębie guza.Stroma odgrywa główną rolę w napędzaniu progresji nowotworu. Może ona być generowana in vitro poprzez wstępną izolację pierwotnych ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego z tkanki piersi pobranej podczas redukcyjnej plastyki piersi. Uzyskaną tkankę dysocjuje się do postaci zawiesiny pojedynczych komórek, a następnie unieśmiertelnia za pomocą transdukcji wirusowej i modyfikuje genetycznie w celu ekspresji GFP oraz genu oporności na puramycynę.Następnie komórki są wstrzykiwane wspólnie z komórkami raka piersi człowieka MCF-7 podskórnie myszy z niedoborem odporności. Wstrzyknięte ludzkie fibroblasty pamięci przekształcą się w promujące nowotwór myofibroblasty nowotworu.Następnie macierzyste fibroblasty gruczołu piersiowego są izolowane z ksenoprzeszczepów nowotworowych i hodowane w obecności puromycyny. Powstałe komórki oporne na puromycynę, nazywane eksperymentalnie wygenerowanymi CAF-ami (exp CAF), poddano analizie immunohistochemicznej, która wykazała, że pierwotnie obecne prawidłowe ludzkie fibroblasty piersiowe przekształcają się wewnątrz ksenoprzeszczepu nowotworowego w myofibroblasty CAF, które nabyły zdolność do promowania tumorigennezy. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak izolacja pierwotnych CAF-ów od pacjentek z rakiem piersi, jest możliwość eksperymentalnego generowania CAF-ów z ludzkich fibroblastów piersiowych poprzez współimplantację nowotworu.Ogólną procedurę modelową zademonstrują Kar, stażysta podoktorski w moim laboratorium, oraz Ahmed Kar, doktorant w tym samym laboratorium. Należy rozpocząć od jednego grama zdrowej tkanki piersi człowieka, pobranej podczas redukcyjnej plastyki piersi. Tkankę należy kilkakrotnie przemyć w PBS, a następnie umieścić w 15 centymetrowej szalce Petriego i za pomocą sterylnego ostrza do golenia posiekać na małe fragmenty o rozmiarze mniejszym niż 1,5 mm³.Następnie za pomocą żyletki przenieś fragmenty tkanki do probówki stożkowej o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml buforu do dysocjacji komórek na każde pół grama tkanki. Następnie wymieszaj na vortexu przez jedną minutę z maksymalną prędkością. Umieść probówkę na kołysce w inkubatorze w temperaturze 37 °C i pozostaw fragmenty tkanki do trawienia na 12 do 18 godzin.Następnego dnia w probówce wciąż będzie znajdować się wiele nieprzetrawionych fragmentów tkanki; należy je wymieszać w wortexie. Najpierw, po wirowaniu z maksymalną prędkością, należy postawić probówkę na blacie i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej bez mieszania. Po inkubacji, za pomocą pipety fizjologicznej o pojemności pięciu mililitrów, należy przenieść otrzymany nadsącz (SUP) wzbogacony w komórki zrębu do nowej probówki stożkowej.Następnie wiruj frakcję stromalną przez pięć minut przy 250 ×g. Po wirowaniu ponownie zawieś osad komórkowy w PBS, a następnie ponownie wiruj przez pięć minut przy 250 ×g. Następnie zawieś osad w DMEM uzupełnionym o 10% FCS i przenieś komórki do 15-centymetrowej szalki Petriego.Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide. Po ośmiu do 10 dniach komórki powinny osiągnąć konfluencję. W tym momencie komórki należy zebrać; mogą one zostać zamrożone do długoterminowego przechowywania.Aby unieśmiertelić wyizolowane pierwotne ludzkie prawidłowe fibroblasty pamięci, należy wprowadzić wektor retrowirusowy P MIG wykazujący ekspresję zarówno H turt, jak i GFP, hodować komórki przez cztery do pięciu dni, a następnie wyselekcjonować komórki GFP-dodatnie za pomocą cytometrii przepływowej. Do hodowli unieśmiertelnionych fibroblastów znakowanych GFP należy wprowadzić konstrukt retrowirusowy P babe puro kodujący gen oporności na puromycynę. Hodować komórki przez pięć do siedmiu dni w obecności puromycyny w stężeniu końcowym 1 µg/mL.W celu wyizolowania unieśmiertelnionych ludzkich fibroblastów pamięci opornych na puromycynę i znakowanych GFP. Następnie należy zbadać, czy fibroblasty produkują aktywne wirusy, które mogą prowadzić do horyzontalnego transferu genów kodujących GFP oraz oporność na puromycynę. Przez dwa dni hodować 2,5 × 10⁵ unieśmiertelnionych ludzkich fibroblastów pamięci opornych na puromycynę w sześciocentymetrowej szalce Petriego.Zebrać i przefiltrować medium warunkowane fibroblastów za pomocą filtra strzykawkowego o rozmiarze porów 0,45 micron. Następnie dodać je do komórek fibroblastów myszych w stadium 10 i pół i inkubować przez 12 godzin w obecności 5 µg/mL siarczanu białka, co zwiększa wydajność infekcji wirusowej. Po upływie 12 godzin wymienić medium na DMEM uzupełniony o 10% FCS i inkubować przez kolejne dwa dni.Badanie komórek należy przeprowadzić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. 10 i pół komórki zakażonych wirusem GFP będzie wykazywać fluorescencję GFP. Następnie należy wymienić medium, aby poddać komórki działaniu stężenia 1 µg/mL.Inkubuj z puromycyną przez pięć do siedmiu dni. Ponownie obserwuj komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby ustalić, czy komórki oporne na puromycynę utworzyły kolonie. Należy zauważyć, że horyzontalny transfer genów za pośrednictwem aktywnych wirusów wytwarzanych przez rodzielskie, oporne na puromycynę i znakowane GFP ludzkie fibroblasty gruczołu piersiowego może nadać oporność otaczającym, wrażliwym na puromycynę komórkom mysim oraz komórkom raka.Oporność na puromycynę i pozytywność GFP wewnątrz ksenograftu nowotworowego. Może to utrudniać proces izolacji wstrzykniętych, znakowanych GFP i opornych na puromycynę ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego z ksenograftu w celu eksperymentalnego wytworzenia fibroblastów związanych z rakiem do wstrzyknięcia myszy z niedoborem odporności. Należy rozpocząć od trypsynizacji i policzenia nowo przygotowanej linii komórkowej ludzkiego gruczołu piersiowego wraz z linią komórkową ludzkiego raka piersi MCF7 RAs w nowych probówkach typu microcentrifuge.Resuspend 1×10⁶ komórek raka piersi człowieka MC77R oraz 3×10⁶ GFP-znakowanych, opornych na puromycynę unieśmiertelnionych fibroblastów gruczołu piersiowego człowieka w 400 µL pożywki hodowlanej z 50% matrigelu na jedną iniekcję. Protki należy umieścić na lodzie jako kontrolę.Przygotuj również analogiczne fibroblastami gruczołu piersiowego człowieka, lecz bez komórek MCF seven RA. Następnie, używając igły o rozmiarze 27 G, wstrzyknij mieszaninę komórek podskórnie u immunodeficyjnej myszy nude, aby zbadać wewnątrznowotworową zmienność fenotypów calfs. Wyizoluj calfs oraz fibroblasty kontrolne z kilku różnych ksenoprzeszczepów nowotworowych.Następnie wszczep każdą z mieszanin w prawą i lewą stronę u każdej myszy. Pozostaw ksenoprzeszczepy guza lub fibroblastów do wzrostu przez 42 dni po iniekcji. Okres inkubacji fibroblastów w obrębie ksenoprzeszczepu guza należy zoptymalizować w zależności od fenotypu miofibroblastów nabytego przez fibroblasty rodzicielskie w guzie.Aby wyizolować fibroblasty z ciał ksetnograftów lub grup kontrolnych z uśpionej myszy, umieść co najmniej 0,5 g tkanki ksetnograftu oraz co najmniej 0,1 g tkanki ksetnograftu z fibroblastami w osobnych naczyniach. Następnie, za pomocą sterylnej żyletki, posiekaj tkankę na małe fragmenty o objętości mniejszej niż 1,5 mm³. Potem przenieś fragmenty tkanki żyletką do probówki stożkowej o pojemności 15 ml zawierającej bufor do dysocjacji komórek i wiruj w wstrząsarku wortex przez jedną minutę z maksymalną prędkością. Inkubuj zawiesinę komórkową przez trzy godziny w temperaturze 37 °C przy ciągłym, powolnym mieszaniu, a następnie odwiruj zawiesinę komórkową.Rozdzielono albo z guza, albo z przeszczepu sano z włókna szklanego przez pięć minut przy 250 ×g podczas wirowania. Osad komórkowy zawieszono ponownie w PBS i powtórzono wirowanie. Następnie otrzymany osad komórkowy zawieszono ponownie w DMEM uzupełnionym o 10% FCS, aby wyizolować kulturę rodzistych ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego opornych na purmycynę.Komórki pochodzące z guza lub fibroblasty hoduje się na płycie Petri o średnicy 15 cm w obecności 1 µg/mL puramycyny w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Pozwoli to na wyeliminowanie wszelkich zanieczyszczeń komórkami raka i/lub komórkami mysimi.Namnażaj komórki stromalne aż do uzyskania konfluencji, a następnie przechowuj je w temperaturze -80 °C w medium do mrożenia. Należy pamiętać, że otrzymane komórki oporne na purymycynę, oznaczone jako 42-dniowe komórki XP calf 1 lub kontrolne komórki fibroblast 1, są nieśmiertelne i wykazują ekspresję GFP. Fibroblasty pamięciowe człowieka zwiększają swój pronowotworowy fenotyp myofibroblastyczny wewnątrz ksenoprzeszczepu guza poprzez oddziaływanie z komórkami raka podczas progresji nowotworu. Wymieszaj 1 × 10⁶ komórek MCF7 RA oraz 3 × 10⁶ komórek 42-dniowych P calf.Zawiesić komórki w 400 µL pożywki hodowlanej z 50% Matrigel w 1,5 ml probówce typu Eppendorf. Przygotować również 3 × 10⁶ 42-dniowych fibroblastów kontrolnych w probówce, bez komórek raka, aby dodatkowo wzmocnić pronowotworowe fenotypy myofibroblastyczne komórek exp calf. Mieszaninę tych komórek wraz z komórkami CF seven RA wstrzyknąć podskórnie myszy nude. W razie potrzeby wstrzyknąć same fibroblasty kontrolne bez komórek nowotworowych w celu przygotowania grupy kontrolnej.Inkubować komórki exp calf one przez dodatkowe 200 dni w ksenoprzeszczepie nowotworowym w celu wygenerowania komórek exp C two, aby wzmocnić myofibroblastyczny fenotyp promujący rozwój nowotworu. W celu uzyskania kontroli dla komórek exp calf two należy również wygenerować komórki control fibroblasts two poprzez wstrzyknięcie komórek control fibroblasts one bez komórek raka do myszy, a następnie usunąć guzy i przenieść je do naczyń hodowlanych.Przeprowadź dyssekcję i dysocjację guza lub przeszczepu fibroblastów do postaci zawiesiny pojedynczych komórek i poddaj je hodowli. Komórki w 15 centymetrowej płytce Petri z 10% F-C-S-D-M-E-M w obecności purmycyny namnażaj aż do osiągnięcia konfluencji, następnie potraktuj trypsyną i zamroź komórki w temperaturze -80°C, stosując medium do mrożenia. Powstałe oporne na purmycynę komórki nazwano komórkami 242 day old exp calf two lub kontrolnymi komórkami fibroblastów two cells GFP labeled exp calf two i kontrolnymi komórkami fibroblastów two cells. Komórki wyizolowane z ksenoprzeszczepów guzów piersi analizowano immunohistochemicznie, jak pokazano na tym obrazie; komórki wykazują silne barwienie w kierunku markerów mezenchymalnych, w tym specyficznej dla ludzi prolylohydroksylazy kolagenu typu I, fibronektyny, S 100, A4 oraz białka powierzchniowego fibroblastów.Wyniki te wskazują na ludzkie pochodzenie oraz mezenchymalny charakter tych komórek. W przeciwieństwie do tego, cytokeratyna, będąca markerem komórek nabłonkowych, nie wybarwiła się w tych pozytywnych pod kątem GFP fibroblastach. Powyższe ustalenia sugerują, że komórki EXP C two oraz fibroblasty kontrolne two pochodzą od rodzicielskich ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego, które zostały początkowo wprowadzone do ksenograftów mysich.Co istotne, znacznie większa liczba komórek XP calf two wykazala pozytywne barwienie dla alpha SMA oraz glikoproteiny macierzy zewnątrzkomórkowej tenascyny C, które są markerami miofibroblastów, w porównaniu do kontrolnych komórek fibroblastów two. Należy zauważyć, że w komórkach exp calf two występuje wyższy odsetek miofibroblastów pozytywnych pod kątem alpha smma niż w komórkach exp calf one w 42. dniu. Dane te wykazują, że rezydentne ludzkie fibroblasty pamięci stopniowo przekształcają się w miofibroblasty calf w ksenoprzeszczepach guza podczas jego progresji po rozwoju.Model ksenoprzeszczepu guza z komplementacją utorował drogę badaczom zajmującym się mikrośrodowiskiem nowotworowym do badania procesów ewolucji prawidłowych fibroblastów w komórki nowotworowe. Tak mówią fibroblasty.

experimental-generation-carcinoma-associated-fibroblasts-cafs-from

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Eksperymentalne wytwarzanie fibroblastów związanych z rakiem (CAF) z ludzkich fibroblastów piersiowych

Fibroblasty związane z nowotworem (CAFs) wspomagają inicjację, wzrost i progresję guza poprzez sygnalizację promującą proliferację, angiogenezę i stan zapalny. W niniejszej pracy opisujemy metodę izolacji czystych populacji prawidłowych fibroblastów oraz CAFs z pobranych na świeżo tkanek mysich i ludzkich za pomocą sortowania komórek, wykorzystując PDGFRα jako marker powierzchniowy.

Izolacja fibroblastów prawidłowych i związanych z nowotworem z tkanek świeżych za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS)

Tutaj prezentujemy protokół do ko-hodowli w trzech wymiarach, który jest przydatny do badania interakcji wielokomórkowych i zależnej od macierzy zewnątrzkomórkowej modulacji zachowania komórek rakowych. W tym eksperymentalnym modelu komórki rakowe są hodowane na żelach kolagenowych osadzonych w ludzkich fibroblastach związanych z rakiem.

Trójwymiarowy model kokultury dla interakcji guz-zręb

Zachowanie fibroblastów leży u podstaw całego spektrum jednostek klinicznych, ale pozostają one słabo scharakteryzowane, głównie ze względu na ich wrodzoną heterogeniczność. Tradycyjne badania nad fibroblastami opierają się na manipulacji in vitro, maskowaniu zachowania fibroblastów in vivo. Opisujemy oparty na FACS protokół izolacji fibroblastów skóry myszy, który nie wymaga hodowli komórkowej.

Izolacja fibroblastów skórnych myszy metodą FACS

Celem tego protokołu jest stworzenie modelu 3D in vitro do badania różnicowania fibroblastów związanych z rakiem (CAF) w środowisku podobnym do masy guza, które mogą być adresowane w różnych systemach analizy, takich jak immunofluorescencja, analiza transkrypcyjna i obrazowanie żywych komórek.

Model sferoidalny 3D jako bardziej fizjologiczny system do różnicowania i inwazji fibroblastów związanych z rakiem w badaniach in vitro

Celem tej metody jest uzyskanie matryc 3D pochodzących z fibroblastów jako naturalnego rusztowania dla kolejnych testów komórkowych. Fibroblasty wysiewa się na wstępnie poddanej obróbce płytce hodowlanej i stymuluje kwasem askorbinowym w celu wytworzenia matrycy. Matryce są decellularizowane i blokowane w celu hodowli odpowiednich komórek (np. komórek śródbłonka).

System matrycowy 3D pochodzący z fibroblastów mający zastosowanie do oznaczania tworzenia rurki śródbłonka

Dostępny jest protokół jednoczesnego wstrzykiwania komórek rakowych i fibroblastów oraz monitorowania wzrostu guza w czasie. Protokół ten można wykorzystać do zrozumienia molekularnych podstaw roli fibroblastów jako regulatorów wzrostu guza.

Mysi model do badania roli fibroblastów związanych z rakiem we wzroście guza

Ten artykuł ma na celu dostarczenie protokołu izolacji i hodowli pierwotnych fibroblastów związanych z rakiem z syngenicznego mysiego modelu potrójnie ujemnego raka piersi oraz ich zastosowanie w badaniach przedklinicznych nowych nanocząstek zaprojektowanych do celowania w mikrośrodowisko guza.

Izolacja pierwotnych fibroblastów związanych z rakiem z syngenicznego mysiego modelu raka piersi w celu zbadania celowanych nanocząstek

Wielokomórkowe sferoidy guza 3D zostały przygotowane z komórkami gruczolakoraka płuc, fibroblastami i monocytami, a następnie wyizolowano fibroblasty związane z rakiem (CAF) z tych sferoidów. Izolowane CAF porównano z normalnymi fibroblastami w celu oceny zdrowia mitochondriów poprzez badanie potencjału transbłonowego mitochondriów, reaktywnych form tlenu i aktywności enzymatycznej.

Ocena zdrowia mitochondriów w fibroblastach związanych z rakiem wyizolowanych z wielokomórkowych sferoid 3D guza płuc

Protokół ten przedstawia metody hodowli, manipulowania i analizowania mysich CAF, w tym testy funkcjonalne in vitro/in vivo , transkryptomikę i analizę obliczeniową. Ponadto opisano w nim platformę internetową opracowaną w celu analizy publicznie dostępnych transkryptomów mikrowypreparowanych składników zrębu i nabłonka z kolekcji ludzkich nowotworów raka piersi.

Fibroblasty związane z rakiem z guzów sutka myszy jako narzędzia do badań molekularnych i obliczeniowych

Protokół ten zapewnia kompleksową procedurę izolacji, ekspansji i unieśmiertelnienia fibroblastów z radykalnej prostatektomii. Ponadto opisano testy opracowane w celu oceny funkcjonalnych skutków przesłuchu fibroblast-komórki nowotworowe, wykorzystujące zarówno leczenie pożywką kondycjonowaną, jak i kokulturę.

Izolacja, hodowla i charakterystyka fibroblastów związanych z rakiem prostaty

Protokół ten opisuje metodę jednoczesnej izolacji organoidów nowotworowych, fibroblastów związanych z rakem (CAF) oraz fibroblastów niezwiązanych z nowotworem (CF) u tego samego pacjenta z rakiem płaskonabłonkowym przełyku (ESCC). Wykorzystanie tych materiałów dopasowanych do pacjentów mogłoby uniknąć problemów związanych z zmiennością między pacjentami i zapewnić odpowiednią platformę eksperymentalną dla badań ESCC.

Ustanowienie organoidów nowotworowych, fibroblastów związanych z rakiem oraz odpowiedników fibroblastów u tego samego pacjenta z rakiem przełyku

Poznaj metodę wytwarzania fibroblastów związanych z rakiem (CAF) z ludzkich fibroblastów sutkowych przy użyciu modelu ksenograftu. Ta technika pozwala badać rolę mikrośrodowiska nowotworowego w progresji raka.

Doświadczalne generowanie fibroblastów towarzyszących rakowi (CAF) z ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego

Przeglądaj więcej filmów