JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:04 min • June 18th, 2025
Zacznij od oprogramowania mikroskopu konfokalnego i ustaw parametry akwizycji obrazu.
Następnie weź wycinek mózgu myszy zamontowany na szklanym szkiełku. Ta sekcja jest wybarwiona przeciwciałami skierowanymi przeciwko składnikom bariery krew-mózg.
Bariera krew-mózg jest selektywnym interfejsem komórkowym między krwioobiegiem a mózgiem w celu utrzymania homeostazy.
Nałóż kroplę olejku immersyjnego o pożądanym współczynniku załamania światła na szkiełko nakrywkowe, aby zoptymalizować rozdzielczość i zminimalizować załamanie światła.
Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu i użyj lampy epifluorescencyjnej, aby uwidocznić próbkę.
Korzystając z odpowiednich filtrów, zlokalizuj jądra wybarwione DAPI i zidentyfikuj segment kapilarny do obrazowania.
Rozpocznij skanowanie na żywo i dostosuj parametry dla każdego kanału fluorescencyjnego, aby uchwycić obrazy wysokiej jakości.
Na koniec zdefiniuj punkt początkowy i końcowy akwizycji Z-stack, aby wygenerować trójwymiarowy obraz bariery krew-mózg.
W menu Akwizycja oprogramowania, które steruje mikroskopem, ustaw parametry akwizycji obrazu. Z menu rozwijanego rozmiaru obrazu wybierz wartość 1 024 na 1 024 pikseli. Zmodyfikuj rozmiar piksela na wartość z zakresu od 200 do 300 nanometrów, dostosowując wartość menu Powiększenie.
Z menu rozwijanego Szybkość akwizycji wybierz wartość 400 herców. Następnie w menu Ustawienia systemowe wybierz głębię pikseli i zmień wartość na 12-bitową. Następnie w oprogramowaniu mikroskopu, na karcie Akwizycja, włącz opcję sekwencyjnej akwizycji klatek. Ustaw grubość przekroju optycznego na wartość od 0,75 do 1 mikrometra dla każdego kanału, modyfikując wartość w menu Otworek.
Dodaj kroplę olejku immersyjnego o współczynniku załamania światła 1,52 na wierzch szkiełka nakrywkowego, z sekcją mózgu, aby dopasować współczynnik załamania szklanego szkiełka nakrywkowego i obiektywu. Następnie umieść próbkę w mikroskopie i włącz lampę epifluorescencyjną, aby uwidocznić próbkę za pomocą lornetki mikroskopowej. Następnie naciśnij przycisk, aby uruchomić tryb skanowania na żywo. Podczas skanowania dostosuj wzmocnienie i intensywność lasera dla każdego kanału, aby zmaksymalizować zakres dynamiczny obrazów i uniknąć nasycenia pikseli. Następnie ustal sekcje początkową i końcową do wykonania optycznych stosów Z, które obejmują całą objętość kapilary i użyj kroku o rozmiarze 0,45 mikrometra.
Co ważne, wszystkie ustawienia akwizycji powinny być takie same podczas sesji obrazowania.