Name: Obrazowanie α receptora estrogenowego w tętniczkach szczura za pomocą cyfrowego mikroskopu immunofluorescencyjnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Poznaj metodę immunofluorescencji do wizualizacji receptora estrogenowego α w tętniczkach pialnych szczura. Technika obejmuje izolację naczyń, cięcie kriostatem i obrazowanie cyfrowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace nad tym projektem były finansowane z grantów National Institutes of Health R01-NR5339 oraz Uniformed Services University of the Health Sciences-R061LD.

1. Izolacja i przygotowanie tętnic oponowych
<ol>
	<li>Podczas znieczulenia szczura wprowadź i zabezpiecz cewnik w tętnicy, a następnie przeprowadź perfuzję 1% roztworem błękitu Evansa w 1X PBS. Naczynia oponowe dobrze barwią się błękitem Evansa, co ułatwia ich izolację.</li>
	<li>Wyjmij mózg i przechowuj w temperaturze -70°C do momentu użycia. Optymalnie mózgi nie powinny być przechowywane dłużej niż 2 miesiące.</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu stereoskopowego usuń tętniczki oponowe (średnica średnia 35-50 μm) z powierzchni mózgu. Ostrożnie odseparuj wszystkie zabarwione na niebiesko tętniczki z grzbietowej i bocznej powierzchni kory, używając pęsety z cienkimi końcówkami. Usuń nadmiar przylegającej tkanki korowej przed umieszczeniem w utrwalaczu.</li>
	<li>Utrwal pobrane tętniczki w 2% zimnej paraformaldehydzie w 0,1M PBS przez 30 min.</li>
	<li>Aby przygotować tętniczki do krojenia, wlej medium do zatapiania na dysk mrożący/adapter (ustawiony na -20°C).</li>
	<li>Umieść odcinek tętniczki płasko na adapterze i poczekaj, aż zamarznie. Mocno ustaw naczynie pionowo na dysku mrożącym kriotomu w medium do zatapiania, tak aby koniec tętnicy był skierowany w Twoją stronę. Przytrzymaj go pęsetą, aż całkowicie zamarznie.</li>
	<li>Umieść dysk mrożący z naczyniem w głowicy kriotomu i wytnij pierścienie tętniczek oponowych o grubości 8 μm.</li>
	<li>Nanieś przekroje tętniczek na szkiełka pokryte żelatyną chromowo-potasową.</li>
	<li>Przechowuj przygotowane szkiełka w pudełku w lodówce w temperaturze 4°C przez noc.</li>
</ol>
2. Barwienie immunofluorescencyjne ER-α
Dzień 1
<ol>
	<li>Wyjmij preparaty ze słodziarki; doprowadź każdy z nich do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Aby umyć preparaty, wlej 1-1,5 ml 0,1M PBS (ilość wystarczająca do pokrycia wszystkich przekrojów), pozostaw na 10 minut, zlej płyn i powtórz tę procedurę jeszcze dwukrotnie. Każda krawędź szkiełka posiada marker hydrofobowy, dzięki czemu ciecz pozostaje na powierzchni preparatu. Podczas każdego mycia ciecz jest wylewana i zastępowana świeżym 0,1 M PBS.</li>
	<li>Inkubuj preparaty w 1 ml 50mM chlorku amonu przez 30 min w temperaturze pokojowej w celu redukcji fluorescencji endogennej.</li>
	<li>Umyj preparaty w 0,1M PBS 3x10 min, zgodnie z opisem w punkcie 2.2.</li>
	<li>Zablokuj preparaty w 0,1% Triton-X 100 oraz 1% normalnego serum koziego (NGS) w PBS przez 30 min, aby zredukować wiązania nieswoiste.</li>
	<li>Inkubuj próbki z przeciwciałem pierwszorzędowym (rabbit polyclonal anti-ER-α; 1:500) w PBS + 0,1% Triton-X + 1% NGS przez noc w temperaturze 4°C.</li>
</ol>
Dzień 2
<ol start="7">
	<li>Wyjąć preparaty z lodówki i doprowadzić każdy z nich do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Przemyć preparaty w 0,1M PBS 3x10 min. zgodnie z opisem w punkcie 2.2</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałem wtórnym anty-króliczym Oregon Green 488 w 1% NGS +0,1% Triton-X100 + PBS przez 2 godziny w ciemności w temperaturze pokojowej. Od tego momentu wszystkie kolejne kroki muszą być wykonywane w ciemności.</li>
	<li>Przemyć preparaty w 0,1M PBS 3x10 min. zgodnie z opisem w punkcie 2.2</li>
	<li>Pod wyciągiem nałożyć 1 kroplę 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) wraz z medium montażowym na naczynia, a następnie przykryć próbkę szkiełkiem cover slip.</li>
	<li>Zabezpieczyć krawędzie szkiełka bezbarwnym lakierem do paznokci. Nie przesuwać preparatów aż do całkowitego wyschnięcia, co trwa około 24 godzin.</li>
</ol>
3. Cyfrowe obrazowanie fluorescencyjne
<ol>
	<li>Do obrazowania ER-α w przekroju naczynia oponowego wykorzystujemy cyfrowy mikroskop fluorescencyjny Nikon Eclipse 80i z filtrami dla 3 kolorów (niebieskiego, zielonego i czerwonego), wyposażony w kamerę cyfrową.</li>
	<li>Umieszczamy przygotowane preparaty z zabarwionymi segmentami naczyń oponowych pod mikroskopem i regulujemy ustawienia, aby zwizualizować fluorescencyjnie znakowane obszary zainteresowania. Rozpoczynamy od powiększenia x100, a następnie zwiększamy je do x600.</li>
	<li>Za pomocą kamery rejestrujemy obrazy w kanałach DAPI (niebieskim) i FITC (zielonym) dla jąder komórkowych (DAPI) oraz ER-α (Oregon Green), wykorzystując oprogramowanie Nikon Extended Depth Focus do konwersji wielu widoków segmentów naczyń w obrazy 2-D.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
Zlokalizowaliśmy receptor estrogenowy-α w naczyniach tętniczych oponopławnych przy użyciu sond fluorescencyjnych i zoptymalizowaliśmy wizualizację receptora za pomocą cyfrowej mikroskopii fluorescencyjnej. Aby wykryć obecność receptora, do obrazowania receptorów w tętnicach oponopławnych wyizolowanych z powierzchni mózgu zastosowano królika poliklonalne przeciwciało pierwszorzędowe oraz przeciwciało drugorzędowe znakowane Oregon Green 488. Użyto również barwnika jądrowego (DAPI) w celu identyfikacji jąder komórkowych i ustalenia, czy możliwe jest wykrycie receptorów znajdujących się w jądrze, ponieważ doniesiono, że ER-α występuje w cytozolu oraz w jądrze komórkowym. Dodatkowo przeprowadzono eksperymenty potwierdzające w celu walidacji specyficzności przeciwciała pierwszorzędowego oraz weryfikacji wiązania przeciwciała drugorzędowego z pierwszorzędowym.
<img src="/files/ftp_upload/3203/3203fig1.jpg" alt="Obraz mikroskopowy; struktury komórkowe z barwieniem fluorescencyjnym; schemat lokalizacji białek; badania." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Barwienie immunofluorescencyjne dla ER- α (zielony) i przeciwbarwienie DAPI (niebieski) w pierścieniu tętnicy pialnej wyizolowanym z mózgu samicy szczura. Ryc. 1A przedstawia nałożone obrazy sugerujące obecność części receptorów estrogenowych-a wewnątrzjądrowych (strzałka). Ryc. 1B i 1C to obrazy ER- α w powiększeniu, stanowiące kombinację obrazów ze stosu Z (Z-stack). Obrazy wykonano przy powiększeniu x600; pochodzą one z przekrojów pierścienia tego samego naczynia w różnych płaszczyznach. Strzałki wskazują receptor estrogenowy- α.
<img src="/files/ftp_upload/3203/3203fig2.jpg" alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej; lokalizacja białek w komórkach; lewo: niska ekspresja, prawo: wysoka ekspresja." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Barwienie immunofluorescencyjne grup kontrolnych w pierścieniu tętnicy pialnej wyizolowanej z mózgu samicy szczura. Rys. 2D przedstawia naczynie bez przeciwciała pierwszorzędowego. Rys. 2E przedstawia naczynie bez przeciwciała drugorzędowego (zwróć uwagę na wyraźną autofluorescencję wzdłuż strony śródbłonka). Obrazy wykonano przy powiększeniu x600 i pochodzą z przekroju pierścienia tego samego naczynia w różnych płaszczyznach.

<ol><li>Smiley, D. A., Khalil, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+compounds%2C+estrogen+receptors+and+vascular+cell+signaling+in+the+aging+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Estrogen compounds, estrogen receptors and vascular cell signaling in the aging blood vessels.</a> Curr. Med. Chem. 16, 1863-1887 (2009).</li>
<li>Miller, V. M., Duckles, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+actions+of+estrogens%3A+functional+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Vascular actions of estrogens: functional implications.</a> Pharmacol. Rev. 60, 210-241 (2008).</li>
<li>Duckles, S. P., Krause, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrovascular+effects+of+oestrogen%3A+multiplicity+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Parmacol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cerebrovascular effects of oestrogen: multiplicity of action.</a> Clin. Exp. Parmacol. Physiol. 34, 801-808 (2007).</li>
<li>Stirone, C., Duckles, S. P., Krause, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forms+of+estrogen+receptor-a+incerebral+blood+vessels%3A+regulation+by+estrogen%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Multiple forms of estrogen receptor-a incerebral blood vessels: regulation by estrogen.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 284, E184-E192 (2003).</li>
<li>Dan, P., Cheung, J. C., Scriven, D. R., Moore, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope-dependent+localization+of+estrogen+receptor-alpha%2C+but+not+-beta%2C+in+en+face+arterial+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Epitope-dependent localization of estrogen receptor-alpha, but not -beta, in en face arterial endothelium.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 284, 1295-1306 (2003).</li>
<li>Fritschy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+my+antibody+staining+specific%3F+How+to+deal+with+pitfalls+of+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Is my antibody staining specific? How to deal with pitfalls of immunohistochemistry.</a> Eur. J. Neurosci. 28, 2365-2370 (2008).</li>
<li>Watanabe, Y., Littleton-Kearney, M. T., Traystman, R. J., Hurn, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+restores+post-ischemic+pial+and+microvascular+dilation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+and+Circ%22%5BJournal%5D)">Estrogen restores post-ischemic pial and microvascular dilation.</a> Am. J. Physiol. Heart and Circ. 281, H155-H160 (2001).</li>
<li>Li, M., Zeynalov, E., Li, X., Miyazaki, C., Koehler, R. C., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+estrogen+on+postischemic+pial+artery+reactivity+to+ADP%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Effects of estrogen on postischemic pial artery reactivity to ADP.</a> Microcirculation. 16, 403-413 (2009).</li>
<li>Qin, X. Y., Hurn, P. D., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+restores+postischemic+sensitivity+to+thromboxane+mimetic+U46619+in+rat+pial+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb.+Blood.+Flow.+Metab%22%5BJournal%5D)">Estrogen restores postischemic sensitivity to thromboxane mimetic U46619 in rat pial artery.</a> Cereb. Blood. Flow. Metab. 25, 1041-1046 (2005).</li>
<li>Miyazaki, C., Koelher, R. C., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+HET0016+and+estrogen+on+pial+artery+vasodilatory+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22FASEBJ+Abstracts%22%5BJournal%5D)">Effects of HET0016 and estrogen on pial artery vasodilatory capacity.</a> FASEBJ Abstracts. , (2007).</li>
<li>Daneshtalab, N., Dore, J. J. E., Smeda, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troubleshooting+tissue+specificity+and+antibody+selection%3A+procedures+in+immunohistochemical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxical.+Methods%22%5BJournal%5D)">Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: procedures in immunohistochemical studies.</a> J. Pharmacol. Toxical. Methods. 61, 127-135 (2010).</li>
<li>Lorincz, A., Nusser, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+immunoreactants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Specificity of immunoreactants.</a> J. Neurosci. 28, 9083-9086 (2008).</li>
</ol>

Wyrażone opinie są opiniami autorów i nie odzwierciedlają oficjalnej polityki ani stanowiska Uniformed Services University of the Health Sciences, Departamentu Obrony lub rządu Stanów Zjednoczonych.

Wcześniej wykazaliśmy, że po przejściowym globalnym niedokrwiennym uszkodzeniu mózgu zdolność tętnic oponowych do zmiany średnicy w odpowiedzi zarówno na wazodylatatory 7, 8, jak i wazokonstryktory 9 jest znacznie obniżona u młodych szczurów po owariektomii. Przewlekłe uzupełnianie estrogenów przywraca odpowiedzi naczynioryżowe 7-9. Co więcej, opóźnione uzupełnianie estrogenów znosi korzystny wpływ estrogenów na zdolność wazodylatacyjną tętnic oponowych 10, co skłoniło nas do postawienia pytania, czy długotrwały niedobór estrogenów wpływa na gęstość ER-α w naczyniach mózgowych. Zaplanowaliśmy wykorzystanie znakowania immunofluorescencyjnego w połączeniu z western blottingiem w celu oceny zmian w ekspresji ER-α w odpowiedzi na przewlekły niedobór estrogenów. Ze względu na trudności z wizualizacją pojedynczych grup receptorów zmodyfikowaliśmy metodę, którą tutaj prezentujemy. Dlatego głównym celem niniejszego badania było przede wszystkim opracowanie stosunkowo prostej metody optymalizacji wizualizacji receptorów w arteriolach oponowych. Zgodnie z kilkoma doniesieniami 6,11,12 uznaliśmy za konieczne wprowadzenie korekt w zależności od rodzaju badanej tkanki, grubości próbki, rozmieszczenia ER-α w naczyniu, a także stopnia nieswoistego wiązania. 
Nasza metoda jest bardzo skuteczna w wizualizacji obecności ER-α w skrawkach naczyń pialnych. Jednak, jak wcześniej wskazywali inni autorzy, pomyślne zastosowanie tych metod jest w dużej mierze zależne od specyfiki i stężeń przeciwciał, lokalizacji subkomórkowej badanych białek, protokołów fiksacji i blokowania oraz sposobu obchodzenia się z tkanką 12. Przed wizualizacją naszych preparatów naczyniowych poświęciliśmy czas na dopracowanie wszystkich tych zmiennych. W niniejszej pracy podkreśliliśmy, w jaki sposób musieliśmy dostosować niektóre elementy naszego podejścia.
Naszym celem była optymalna wizualizacja ER-α w tętniczkach oplotowych, co wiązało się z kilkoma wyzwaniami. Po pierwsze, średnia średnica tętnicy oplotowej szczura wynosi od 35-50 μm, co sprawia, że ich izolacja i usuwanie z powierzchni mózgu jest dość trudne. Stwierdziliśmy, że perfuzja barwnikiem błękitem Evansa przed ubojem ułatwia preparowanie tętnic. Błękit Evansa może wpływać na fluorescencję, jednak uważamy, że korzyści z zastosowania tego barwnika przeważają nad jego niewielkimi wadami. W naszym protokole naczynia są płukane kilkukrotnie. Minimalizuje to ilość pozostałego w naczyniach barwnika i ogranicza jego potencjalny wpływ na fluorescencję. Inną napotkaną trudnością była grubość segmentów naczyń oplotowych, która utrudniała wyraźną wizualizację receptorów. Dodatkowo nie mogliśmy uzyskać szczególnie ostrych obrazów, prawdopodobnie ze względu na fakt, że ER-α były rozproszone w kilku warstwach komórkowych. Próbowaliśmy pracować na podłużnych przekrojach naczyń (podobnie jak inni), ale ze względu na mały rozmiar naczyń oplotowych trudna była manipulacja nimi oraz zapobieganie ich skręcaniu podczas montowania na szkiełkach, nawet przy użyciu mikroskopu. Ostatecznie z sukcesem zmodyfikowaliśmy naszą technikę, wykorzystując kriostat i wykonując przekroje poprzeczne naczyń w postaci pierścieni o grubości 8 μm. Pierścienie te są łatwiejsze w manipulacji, a kilka z nich można zamontować na jednym szkiełku. 
Po pozyskaniu naczyń uznaliśmy za konieczne sprawdzenie skuteczności metody polegającej na najpierw błyskawicznym zamrażaniu tkanki, a następnie utrwalaniu naczyń, zgodnie z sugestią Danseshatalb i współpracowników 11. Chociaż zaobserwowaliśmy nieznacznie mniejszą immunofluorescencję tła, odnotowaliśmy również, że receptory barwiły się mniej intensywnie, co utrudniało ich wizualizację. W związku z tym preferujemy najpierw zamrozić cały mózg i przechowywać go do czasu użycia (zazwyczaj od 1 do 2 miesięcy). Następnie wyodrębniamy naczynia w opisany sposób i utrwalamy je przed krojeniem w kriotomie, co demonstrujemy w niniejszym materiale.
Niezbędnym krokiem jest przeprowadzenie kontroli z użyciem osobno przeciwciała pierwszorzędowego i drugorzędowego, aby określić specyficzność oraz tło immunofluorescencji. Przeciwciała przeciwko receptorowi estrogenowemu-α mogą być trudne w zastosowaniu. W rzeczywistości przetestowaliśmy 3 różne przeciwciała pierwszorzędowe (1 monoklonalne i 2 poliklonalne), zanim uzyskaliśmy satysfakcjonujące wyniki barwienia receptorów. W ramach kontroli najpierw zweryfikowaliśmy specyficzność przeciwciała pierwszorzędowego poprzez pominięcie jego dodania. Rysunek 2D przedstawia naczynie bez przeciwciała pierwszorzędowego. Nie obserwuje się barwienia, a jedynie niewielki sygnał tła. Ponieważ przeciwciało pierwszorzędowe jest poliklonalne, występuje pewne rozproszone, niespecyficzne barwienie tła. Następnie dodaliśmy przeciwciało pierwszorzędowe, ale nie dodaliśmy przeciwciała drugorzędowego (Rys. 2E). Można zauważyć wyraźny margines reprezentujący autofluorescencję wzdłuż brzegów śródbłonka naczyń. Jest to zgodne z pracami Dana i współpracowników 5. Jednak ani małe punkty immunofluorescencji reprezentujące ER-α, ani ziarnisty wygląd odzwierciedlający obecność licznych receptorów nie są wykrywalne bez jednoczesnego zastosowania przeciwciała pierwszorzędowego i drugorzędowego. Odnotowaliśmy wyraźny wzorzec autofluorescencji wzdłuż marginesów śródbłonka naczyń. Te niezależne testy specyficzności przeciwciał są istotne, ponieważ potwierdzają specyficzność przeciwciała względem ER-α oraz wiązanie przeciwciała drugorzędowego z pierwszorzędowym.
Podsumowując, jak wykazali inni 4, 5, naczynia krwionośne mózgu zawierają liczne receptory podtypu ER-α. W naszych badaniach przygotowanie przekrojów o grubości 8μm z wyizolowanych tętnic oplotkowych poprawia barwienie i wizualizację receptorów. Tradycyjne metody wykorzystują mikroskopię konfokalną do badania próbek. Możliwość oglądania seryjnych przekrojów optycznych z grubych preparatów jest istotną zaletą mikroskopii konfokalnej. Jednak zakup wysokiej klasy mikroskopu konfokalnego może być bardzo kosztowny. Stwierdziliśmy, że zastosowanie oprogramowania Extended Depth (EDF) może obniżyć koszty wyposażenia. Używając mikroskopu fluorescencyjnego z funkcją EDF, uzyskaliśmy wyraźne obrazy i jesteśmy w stanie wizualizować ER-α w tętnicach oplotkowych na kilku poziomach przy użyciu stosów Z (Z-stacks). Istotną zaletą oprogramowania EDF jest to, że umożliwia ono przechwytywanie obrazów w sposób, który pozwala na efektywne stworzenie obrazu 3D z poszczególnych zdjęć. Dla laboratoriów, które nie mają dostępu do mikroskopu konfokalnego lub funduszy na jego zakup, cyfrowy mikroskop fluorescencyjny z odpowiednim oprogramowaniem może być praktyczną i mniej kosztowną opcją, w zależności od celów badacza.

<table><tbody><tr><td>BŁĘKIT EWANSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-2129</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5493</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>T353</td><td></td></tr><tr><td>Związek Tissue-Tek O.C.T</td><td>VWR international</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Normalne surowica kozia</td><td>Invitrogen</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało poliklonalne przeciwko ER-&amp;alpha;</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>H-184</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-królicze IgG Oregon green 488</td><td>Invitrogen</td><td>O-11038</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe Vectashield do fluorescencji z DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie receptorów estrogenowych $\alpha$ w tętniczkach oplątwowych szczura przy użyciu cyfrowego mikroskopu immunofluorescencyjnego

Imaging of Estrogen Receptor-&alpha; in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

Wiele efektów estrogenu na reaktywność naczyniową jest przekazywanych poprzez oddziaływanie z receptorami estrogenowymi 1, 2, 3. Chociaż istnieją dwa podtypy (receptor estrogenowy -α i β), receptor estrogenowy-α został zidentyfikowany zarówno w mięśniach gładkich, jak i w komórkach śródbłonka segmentów tętnic oponowych przy użyciu barwienia fluorescencyjnego w połączeniu z konfokalną skaningową mikroskopią laserową 4. Ponadto ER-α znajduje się w jądrach i cytoplazmie tętnic podstawy u szczura 5. Receptory są liczne i intensywnie fluorescują, jednak wyraźna wizualizacja poszczególnych grup receptorów jest utrudniona, prawdopodobnie ze względu na ich liczbę w wielu warstwach komórkowych segmentów naczyń oponowych. Dodatkowo wiele doniesień wykorzystujących techniki immunohistochemiczne w połączeniu z mikroskopią konfokalną słabo opisuje wymagania krytyczne dla powtarzalności eksperymentów 6. Celem niniejszego artykułu jest opis prostej techniki optymalizacji barwienia i wizualizacji ER-α przy użyciu przekrojów poprzecznych tętniczek oponowych pobranych z mózgów samic szczura. W pierwszej kolejności przeprowadzamy perfuzję szczurów barwnikiem błękitem Ewansa, aby łatwo zidentyfikować powierzchniowe tętnice oponowe, które izolujemy pod mikroskopem operacyjnym. Użycie kriotomatu do wycięcia przekrojów poprzecznych tętnic o grubości 8 μm pozwala na uzyskanie cienkich sekcji naczyń, dzięki czemu różne płaszczyzny naczyniowe są wyraźniej widoczne. Cięcie w poprzek naczynia, zamiast stosowania małego segmentu naczynia, daje korzyść w postaci łatwiejszego oglądu warstw śródbłonka i mięśni gładkich. Ponadto zastosowanie cyfrowego mikroskopu immunofluorescencyjnego z oprogramowaniem do rozszerzonej głębi ostrości pozwala na uzyskanie wyraźnych obrazów od dziesięciu do dwunastu różnych płaszczyzn naczyniowych i jest mniej kosztowne niż użycie konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego.

Celem niniejszego artykułu jest zaprezentowanie metody optymalizacji detekcji immunofluorescencyjnej receptora estrogenowego α (ERα) w skrawkach tętnic oponowych szczura przy użyciu cyfrowego mikroskopu immunofluorescencyjnego.

Obrazowanie receptorów estrogenowych $\alpha$ w tętniczkach oplątwowych szczura przy użyciu cyfrowego mikroskopu immunofluorescencyjnego

Wiele efektów estrogenu w zakresie reaktywności naczyniowej jest zapośredniczonych poprzez oddziaływanie z receptorami estrogenowymi 1, 2, 3. Chociaż istnieją dwa podtypy (estrogen...

Ogólnym celem tej procedury jest opis prostej techniki optymalizacji barwienia i wizualizacji receptora estrogenowego alfa z wykorzystaniem przekrojów poprzecznych tętnic powierzchownych uzyskanych z mózgów samic szczura. Osiąga się to poprzez najpierw usunięcie z powierzchni mózgu tętnic powierzchownych zabarwionych błękitem Evansa, a następnie pocięcie ich w kriosztacie na pierścienie o grubości ośmiu mikronów po sekcjonowaniu. Przekroje poprzeczne są montowane na szkiełkach i inkubowane z przeciwciałem pierwszorzędowym przeciwko receptorowi estrogenowemu alfa.Następnie przekroje inkubuje się z przeciwciałem wtórnym i barwnikiem kontrastowym, stosując medium montażowe zawierające dpi. Na koniec segmenty naczyńt sieci skórnej znakowane fluorescencyjnie poddaje się obrazowaniu, a uzyskane obrazy przekształca się w obrazy 2D za pomocą oprogramowania do rozszerzonego zakresu ostrości (extended depth focus). W rezultacie, przy użyciu mikroskopu immunofluorescencyjnego Nikon z oprogramowaniem do rozszerzonego zakresu ostrości, można uzyskać wyniki obrazujące receptor estrogenowy alfa w tętniczkach sieci skórnej.Nazywam się dr Marguerite Littleton Kearney. Dzisiaj dr Neil Farani, stażysta podoktorski w moim laboratorium, zademonstruje prostą procedurę optymalizacji wizualizacji i barwienia receptora estrogenowego alfa w próbkach skóry.Wypreparuj tętnice z mózgu szczura, który został przepłukany barwnikiem błękitnym Evansa i przechowywany w temperaturze -70 °C. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego zidentyfikuj tętnice na powierzchni mózgu i usuń je, używając pęsety z cienkimi końcami. Ostrożnie usuń wszelkie przylegające tkanki mózgowe.Umieść tętnice w małej probówce na lodzie. Utrwal tętnice w 2% zimnym formaldehydzie w 0,1 mol PBS przez 30 minut. Aby przygotować tętnice do cięcia, wlej medium do zatapiania na dysk mrożący ustawiony na -20 °C.Umieść fragment tętnicy płasko na wkładce chłodzącej i poczekaj, aż zamarznie. Po całkowitym zamrożeniu ustaw tętnicę pionowo w medium do zatapiania na dysku mrożącym kriosztatu. Upewnij się, że końcówka tętnicy jest skierowana do przodu.Przytrzymać tętnicę pęsetą, aż zostanie całkowicie zamrożona. Umieścić dysk mrożący z tętnicą w głowicy kriotomu, a następnie wyciąć pierścienie tętnicze o grubości 8 µm bezpośrednio na szkiełku przedmiotowym. Przenieść przekroje tętnic na żelatynę chromowo-potasową.Przygotuj preparaty na szkiełkach, używając dwóch pędzli do wyprostowania pierścieni tętniczych. Przechowuj przygotowane szkiełka w kasecie w lodówce w temperaturze 4 °C przez noc. Wyjmij szkiełka z lodówki i pozostaw je na blacie do osiągnięcia temperatury pokojowej.Przemyj preparaty na szkiełkach 1 do 1,5 ml 0,1 M PBS. Po 10 minutach zlej PBS i powtórz tę czynność jeszcze dwukrotnie. Po ostatnim płukaniu PBS inkubuj szkiełka w 1 ml 50 mM chlorku amonu przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Aby zredukować autofluorescencję, przemyj szkiełka 0,1 M PBS 3 razy, przez 10 minut każdego płukania, zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnie zablokuj szkiełka w roztworze PBS zawierającym 0,1% Triton X 100 oraz 1% normalnego surowicy koziej przez 30 minut, aby ograniczyć niespecyficzne wiązanie przeciwciała pierwszorzędowego.Po blokowaniu inkubuj preparaty z przeciwciałem pierwszorzędowym przeciwko ER alpha, rozcieńczonym do stężenia 1:500 w roztworze blokującym, przez noc w temperaturze 4°C. Wyjmij preparaty z lodówki i doprowadź je do temperatury pokojowej. Wypłucz niezwiązane przeciwciała pierwszorzędowe, używając od 1 do 1,5 ml 0,1% PBS, 3 razy po 10 minut.Przy każdym powtórzeniu inkubuj preparaty z Oregon Green, 4 88 wtórnym przeciwciałem antykróliczym w roztworze blokującym przez dwie godziny w ciemności w temperaturze pokojowej; po inkubacji przemyj preparaty 0,1 molarnym PBS 3 razy, przez 10 minut na każde przemycie, a następnie przenieś je pod wyciąg. Nanieś kroplę medium montażowego z dappy na preparaty, a następnie przykryj próbkę szkiełkiem cover slip. Nałóż bezbarwny lakier do paznokci, aby uszczelnić krawędzie szkiełka cover slip i poczekaj do całkowitego wyschnięcia.Wstaw przygotowane preparaty z barwionymi segmentami naczyń z łupiny pod mikroskop i dostrój urządzenie, aby zwizualizować fluorescencyjnie znakowane obszary zainteresowania. Wizualizacja barwionego ER alpha jest najtrudniejszym etapem tej procedury. Znajdź poziom przekroju naczynia z najbardziej wyraźnymi receptorami.Zacznij od powiększenia 100-krotnego, a następnie zwiększ powiększenie do 600-krotnego. Użyj kamery do wykonania obrazów w kanałach DPI i ZI odpowiednio dla jąder komórkowych oraz DR alfa, a następnie użyj oprogramowania, aby przekształcić wielokrotne widoki segmentów naczyń w obrazy 2D. Tutaj wyniki barwienia immunofluorescencyjnego dla ER alfa przedstawiono w kolorze zielonym, a przeciwbarwienie wykonano z użyciem DPI.Na niebiesko w pierścieniu tętnicy wyizolowanym z mózgu samicy szczura, nałożone na siebie obrazy sugerują obecność wewnątrzjądrowego receptora estrogenowego alfa. Dzięki zastosowaniu kombinacji obrazów Zack można uzyskać obraz skupiony na immunofluorescencji ER alfa, aby uwzględnić autofluorescencję; kontrole negatywne dla przeciwciał pierwotnych i wtórnych powinny zostać przeprowadzone. Należy zwrócić uwagę na wyraźną autofluorescencję wzdłuż strony śródbłonkowej tętnicy, która nie była inkubowana z przeciwciałem wtórnym.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo zrozumieć, jak izolować i oddzielać tętnice z powierzchni mózgu oraz jak przygotowywać przekroje poprzeczne o grubości ośmiu mikronów. Dodatkowo powinni Państwo zapoznać się z zastosowaniem estrogenowego receptora alfa znakowanego fluorescencyjnie oraz z wizualizacją receptorów przy użyciu cyfrowego mikroskopu immunofluorescencyjnego i oprogramowania Nikon extended.

imaging-estrogen-receptor-rat-pial-arterioles-using-digital

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie receptora estrogenu-α w tętniczkach oponowych szczurów za pomocą cyfrowego mikroskopu immunofluorescencyjnego

Niniejszy artykuł opisuje prosty model stymulacji angiogenezy w krezce szczura. Model ten powoduje gwałtowny wzrost pączkowania naczyń włosowatych, powierzchni naczyniowej oraz gęstości naczyń w stosunkowo krótkim czasie, w tkance umożliwiającej wizualizację en face całych sieci mikronaczyniowych aż do poziomu pojedynczej komórki.

Eksterioryzacja krezki szczura: model do badania dynamiki komórkowej zaangażowanej w angiogenezę

Funkcja komórek naczyniowych zależy od aktywności przekaźników wewnątrzkomórkowych.  Opisana jest metoda obrazowania dwufotonowego ex vivo, która umożliwia pomiar wewnątrzkomórkowych poziomów wapnia i tlenku azotu w odpowiedzi na bodźce fizjologiczne i farmakologiczne w poszczególnych komórkach śródbłonka i mięśni gładkich izolowanej aorty.

Obrazowanie dwufotonowe wewnątrzkomórkowego obchodzenia się z Ca2+ i produkcji tlenku azotu w komórkach śródbłonka i mięśni gładkich izolowanej aorty szczurzej

Tutaj prezentujemy protokół opisujący lokalizację receptorów angiotensyny II typu 1 w mózgu szczura za pomocą ilościowej, densytometrycznej autoradiografii receptorów in vitro przy użyciu analogu angiotensyny II, znakowanego jodem-125.

Protokół autoradiografii receptorów do miejscowej wizualizacji receptorów angiotensyny II

To badanie przedstawia prostą dwuwymiarową metodę angiograficzną do badania drobnych struktur naczyniowych za pomocą mieszanki do wstrzykiwania kauczuku silikonowego i systemu rentgenowskiego tkanek miękkich.

Dwuwymiarowa angiografia rentgenowska do badania drobnych struktur naczyniowych przy użyciu mieszanki iniekcyjnej z kauczuku silikonowego

Pokazujemy trzy różne techniki przygotowania tkanek do immunohistochemicznej wizualizacji mikrokrążeń siatkówki szczura, tj. kriosekcje, całe wierzchowania i hipotoniczne izolowanie sieci naczyniowej.

Kriowycinki siatkówki, całe wierzchowania i hipotoniczne izolowane preparaty naczyniowe do immunohistochemicznej wizualizacji perycytów mikronaczyniowych

Ten manuskrypt opisuje prosty protokół izolacji tętniczek od siatkówki szczura, który może być wykorzystany w badaniach elektrofizjologicznych, obrazowania wapnia i miografii ciśnieniowej.

Izolacja tętniczek siatkówki do badań fizjologii komórek ex vivo

Tutaj prezentujemy protokół barwienia immunofluorescencyjnego, aby bezpośrednio obserwować komórki śródbłonka aorty myszy. Technika ta jest przydatna podczas badania fenotypu komórkowego i molekularnego komórek śródbłonka w różnych wzorcach przepływu oraz w rozwoju miażdżycy.

Stosowanie barwienia immunofluorescencyjnego en face do bezpośredniej obserwacji komórek śródbłonka naczyń krwionośnych

Tutaj opisujemy protokół wizualizacji i analizy tętnic łuku gardłowego 3, 4 i 6 zarodków myszy za pomocą immunofluorescencji całego montażu, oczyszczania tkanek, mikroskopii konfokalnej i rekonstrukcji 3D.

Wizualizacja i analiza tętnic łukowych gardła z wykorzystaniem immunohistochemii całego montażu i rekonstrukcji 3D

Protokół przedstawia kompletny, potwierdzony, indukowany przez TNBS mysi model choroby Leśniowskiego-Crohna oraz metody wizualizacji receptorów estrogenowych za pomocą immunohistochemii przy użyciu immunofluorescencji utrwalonych formaliną odcinków jelita grubego zanurzonych w parafinie.

Wizualizacja receptorów estrogenowych w okrężnicy myszy z chorobą Leśniowskiego-Crohna wywołaną TNBS przy użyciu immunofluorescencji

Utrzymanie czystości optyki mikroskopu jest kluczowe dla uzyskania obrazowania wysokiej jakości. Kurz, odciski palców, nadmiar olejku imersyjnego lub medium montażowego na powierzchni lub wewnątrz mikroskopu powodują spadek kontrastu i rozdzielczości. Metoda DIC jest szczególnie wrażliwa na zanieczyszczenia i zarysowania powierzchni soczewek. Niniejszy protokół szczegółowo opisuje procedurę czyszczenia mikroskopu.

Właściwa pielęgnacja i czyszczenie mikroskopu

Poznaj metodę immunofluorescencji do wizualizacji receptora estrogenowego α w tętniczkach pialnych szczura. Technika obejmuje izolację naczyń, cięcie kriostatem i obrazowanie cyfrowe.

Obrazowanie receptorów estrogenowych $\alpha$ w tętniczkach oplątwowych szczura przy użyciu cyfrowego mikroskopu immunofluorescencyjnego

Przeglądaj więcej filmów