Obrazowanie receptorów estrogenowych $\alpha$ w tętniczkach oplątwowych szczura przy użyciu cyfrowego mikroskopu immunofluorescencyjnego

Ogólnym celem tej procedury jest opis prostego sposobu optymalizacji barwienia i wizualizacji receptora estrogenowego alfa przy użyciu przekrojów poprzecznych tętnic korowych uzyskanych z mózgów samic szczura. Cel ten osiąga się poprzez najpierw usunięcie z powierzchni mózgu tętnic korowych zabarwionych błękitem Ewansa, a następnie pocięcie ich w kriosztacie na pierścienie o grubości 8 µm. Przekroje poprzeczne nanosi się na szkiełka i inkubuje z przeciwciałem pierwszorzędowym przeciwko receptorowi estrogenowemu alfa.

Następnie przekroje inkubuje się z przeciwciałem wtórnym i barwnikiem kontrastowym, używając medium montażowego zawierającego dpi. Na koniec fluorescencyjnie znakowane segmenty naczyń skórki są obrazowane i konwertowane na obrazy 2D za pomocą oprogramowania do rozszerzonego zakresu ostrości (extended depth focus). Ostatecznie, przy użyciu mikroskopu immunofluorescencyjnego Nikon z oprogramowaniem do rozszerzonego zakresu ostrości, można uzyskać wyniki obrazujące receptor estrogenowy alfa w tętniczkach skórki.

Nazywam się dr Marguerite Littleton Kearney. Dzisiaj dr Neil Farani, stażysta postdoktorski w moim laboratorium, zaprezentuje prostą procedurę mającą na celu optymalizację wizualizacji i barwienia receptora estrogenowego alfa w komórkach peel.

Wyizoluj tętnice z mózgu szczura, który został przepłukany barwnikiem błękitnym Evansa i przechowywany w temperaturze -70°C. Używając mikroskopu sekcyjnego, zidentyfikuj tętnice powierzchowne na powierzchni mózgu i usuń je za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami. Ostrożnie usuń wszelkie przylegające tkanki mózgowe.

Umieść tętnice w małej probówce na lodzie. Utrwal tętnice w 2% zimnym formaldehydzie w proszku w 0,1 mol PBS przez 30 minut. Aby przygotować tętnice do cięcia, wlej medium do zatopienia na dysk mrożący ustawiony na -20 °C.

Umieść fragment tętnicy płasko na chuggu i poczekaj, aż zamarznie. Po całkowitym zamrożeniu umieść tętnicę pionowo w medium do zatapiania na dysku mrożącym kriotomu. Upewnij się, że końcówka tętnicy jest skierowana do przodu.

Przytrzymaj tętnicę pęsetą, aż zostanie całkowicie zamrożona. Umieść dysk mrożący z tętnicą w głowicy kriostatu, a następnie wytnij pierścienie tętnicze o grubości ośmiu mikronów bezpośrednio na szkiełku. Osadź przekroje tętnicze na żelatynie chromowo-potasowej.

Wyprostuj pierścienie tętnicze na szkiełkach za pomocą dwóch pędzli. Przechowuj przygotowane szkiełka w kasecie w lodówce w temperaturze 4°C przez noc. Wyjmij szkiełka z lodówki i doprowadź je do temperatury pokojowej na blacie laboratoryjnym.

Przemyj preparaty na szkiełkach od 1 do 1,5 mililitra 0,1 M PBS. Po 10 minutach odlej PBS i powtórz tę czynność dwukrotnie. Po końcowym płukaniu w PBS inkubuj szkiełka w jednym mililitrze 50 mM chlorku amonu przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Aby zredukować autofluorescencję, przemyj szkiełka 0,1 M PBS 3 razy przez 10 minut każdego płukania, zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnie zablokuj szkiełka w roztworze PBS zawierającym 0,1% Triton X 100 oraz 1% normalnego surowicy koziej przez 30 minut, aby ograniczyć nieswoiste wiązanie przeciwciał pierwotnych.

Po blokowaniu inkubować preparaty z przeciwciałem pierwszorzędowym przeciwko ER alpha rozcieńczonym do stężenia 1:500 w roztworze blokującym przez noc w temperaturze 4°C. Wyjąć preparaty z lodówki i doprowadzić je do temperatury pokojowej. Usunąć niezwiązane przeciwciała pierwszorzędowe, płukąc preparaty 1–1,5 ml 0,1% PBS 3 razy przez 10 minut.

Przy każdym powtórzeniu inkubować preparaty z przeciwciałami wtórnymi Oregon Green 488 przeciw królikowi w roztworze blokującym przez dwie godziny w ciemności w temperaturze pokojowej; po inkubacji przemyć preparaty 0,1 M PBS trzykrotnie, po 10 minut na każde płukanie, a następnie przenieść je do dygestorium. Nanieść kroplę medium montującego zawierającego DAPI na próbki, a następnie nałożyć szkiełko nakrywkowe. Krawędzie szkiełka nakrykowego zabezpieczyć bezbarwnym lakierem do paznokci i pozostawić do całkowitego wyschnięcia.

Wprowadź przygotowane preparaty z barwionymi segmentami naczyń pod mikroskop i dostrój urządzenie, aby zwizualizować fluorescencyjnie znakowane obszary zainteresowania. Wizualizacja barwionego ER alpha jest najtrudniejszym krokiem tej procedury. Znajdź poziom przekroju naczynia z najwyraźniejszymi receptorami.

Zacznij od powiększenia 100-krotnego, a następnie zwiększ powiększenie do 600-krotnego. Użyj kamery do wykonania zdjęć w kanałach DPI i ZI odpowiednio dla jąder komórkowych oraz DR alpha, a następnie wykorzystaj oprogramowanie, aby przekształcić wielokrotne widoki segmentów naczyń w obrazy 2D. Tutaj przedstawiono wyniki barwienia immunofluorescencyjnego dla ER alpha w kolorze zielonym oraz przeciwbarwienie DPI.

Na niebiesko w pierścieniu tętnicy wyizolowanym z mózgu samicy szczura, nałożone na siebie obrazy sugerują obecność wewnątrzjądrowego receptora estrogenowego alfa. Dzięki zastosowaniu kombinacji obrazów Zack można uzyskać obraz o skupionej immunofluorescencji ER alfa; w celu uwzględnienia autofluorescencji należy przeprowadzić kontrole negatywne zarówno dla przeciwciała pierwszorzędowego, jak i drugorzędowego. Należy zwrócić uwagę na wyraźną autofluorescencję wzdłuż strony śródbłonka tętnicy, która nie była inkubowana z przeciwciałem drugorzędowym.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo wiedzieć, jak izolować i oddzielać tętniczki z powierzchni mózgu oraz jak przygotowywać przekroje poprzeczne w formie pierścieni o grubości eight micron. Ponadto powinni Państwo zapoznać się z tym, czym jest estrogen receptor alpha znakowany fluorescencyjnie oraz jak wizualizować receptory przy użyciu cyfrowego mikroskopu immunofluorescencyjnego i oprogramowania Nikon extended.