JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 2:39 min • June 17th, 2025
Weźmy szkiełko nakrywkowe z genetycznie zmodyfikowanymi neuronami pierwotnymi w komorze obrazowania wypełnionej buforem do obrazowania.
Komórki te wyrażają fluorescencyjny wskaźnik redoks oparty na białku w macierzy mitochondrialnej.
Umieść komorę pod mikroskopem fluorescencyjnym, zidentyfikuj komórki w świetle widzialnym, a następnie przełącz się na obrazowanie fluorescencyjne.
Zastosuj dwie długości fal wzbudzenia, aby stymulować wskaźnik i zmierzyć emisję fluorescencji.
Współczynnik intensywności fluorescencji przy tych długościach fal odzwierciedla stopień utlenienia mitochondriów.
Wprowadź NMDA, aby aktywować komórkowe receptory NMDA, powodując wewnątrzkomórkowy napływ wapnia.
Wzrost wyzwala mitochondrialny wychwyt wapnia, indukując produkcję ROS i utlenianie mitochondriów
.
ROS utlenia wskaźnik, zmieniając jego fluorescencję i zwiększając współczynnik sygnału.
Wprowadź środki utleniające, aby w pełni utlenić wskaźnik, maksymalizując stosunek sygnału.
Usuń bufor, a następnie wprowadź środki redukujące, aby całkowicie zredukować barwnik, minimalizując stosunek sygnału.
Użyj maksymalnych i minimalnych proporcji sygnału, aby skalibrować i określić ilościowo utlenianie mitochondrialne wywołane przez NMDA.
W przypadku obrazowania na żywo ustaw interwał poklatkowy na 30 sekund, a czas trwania na 25 minut. Następnie zamontuj komórki, umieść komorę na mikroskopie i skoncentruj komórki, jak pokazano wcześniej. Przełącz się w tryb skanowania i użyj kanału 488 nanometrów w podglądzie na żywo, aby ustawić ostrość i zlokalizować komórki do obrazowania. Opcjonalnie, aby zwiększyć liczbę rejestrowanych komórek w przebiegu, należy użyć funkcji wielopunktowej w celu zobrazowania od dwóch do trzech pól widzenia na szkiełko nakrywkowe.
Rozpocznij akwizycję poklatkową i nagraj pięć obrazów jako dwuminutowe nagranie bazowe. Dodaj 500 mikrolitrów trzykrotnego roztworu NMDA do komory, aby osiągnąć końcowe stężenie 30 mikromolów i zarejestruj dodatkowe 20 obrazów jako 10-minutową odpowiedź NMDA. Następnie dodaj 500 mikrolitrów czterokrotnego roztworu DA do komory i zapisz sześć kolejnych obrazów. Odessać bufor z komory obrazowania i zastąpić go 1 mililitrem roztworu DTT. Po nagraniu kolejnych 10 obrazów zakończ nagrywanie i zapisz serię obrazów.