JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 2:57 min. • June 18th, 2025
Zacznij od małego interferującego RNA, który hamuje ekspresję białka prionowego, białka związanego z neurodegeneracyjnymi chorobami prionowymi.
Dodaj kationową zawiesinę liposomową.
Ujemnie naładowane siRNA wiąże się z dodatnio naładowaną powierzchnią liposomu.
Wprowadź peptyd RVG-9r, glikoproteinę wirusa wścieklizny przyłączoną do ogona poliargininy.
Reszty argininy ułatwiają wiązanie RVG-9r-siRNA.
Wstrzyknij kompleksy liposom-siRNA-peptyd do żyły ogonowej znieczulonej myszy.
LSPC krążą w krwiobiegu i docierają do mózgu.
Peptyd RVG-9r wiąże się z nikotynowymi receptorami acetylocholiny na komórkach śródbłonka, wywołując transcytozę za pośrednictwem receptora przez barierę krew-mózg.
Wewnątrz mózgu RVG-9r wiąże się z neuronalnymi receptorami acetylocholiny, ułatwiając endocytozę LSPC i uwalnianie siRNA.
Kompleks wyciszający indukowany przez RNA wiąże się z siRNA.
Nić pasażerska dysocjuje, podczas gdy nić prowadząca wiąże się i rozszczepia mRNA PrP, zapobiegając translacji i zmniejszając ekspresję PrP.
Dodaj 20 mikrolitrów zawiesiny liposomów 4 nanomoli do 200 mikrolitrów 20-mikromolowego roztworu siRNA i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 80 mikrolitrów 500-mikromolowego zapasu peptydu celującego RVG-9r do roztworu liposomu siRNA i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
Po znieczuleniu myszy za pomocą 2 do 3% izofluoranu w tlenie, przykryj oczy myszy maścią okulistyczną i potwierdź znieczulenie, wykonując szczypanie palca u nogi. Kontynuuj tylko wtedy, gdy nie ma reakcji. Utrzymując znieczulenie, połóż mysz na plecach lub na boku, aby uzyskać dostęp do żyły ogonowej.
Przetrzyj ogon 70% etanolem, a następnie użyj strzykawki insulinowej o rozmiarze 26, aby wstrzyknąć 300 mikrolitrów LSPC lub PALETS do żyły ogonowej. Wstrzyknięcie należy rozpocząć dystalnie i poruszać się proksymalnie, jeśli żyła zapadnie się lub pęknie. Umieść mysz w czystej klatce, aż utrzyma pozycję leżącą mostka.