JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:53 min • August 7th, 2025
Weźmy znieczulone szczenię myszy z genetycznie wywołanym ubytkiem słuchu.
W tym stanie komórkom rzęsatym w uchu wewnętrznym brakuje transporterów glutaminianu, co zapobiega gromadzeniu się glutaminianu w pęcherzykach i uwalnianiu.
Zakłóca to przekazywanie sygnałów dźwiękowych do nerwu słuchowego.
Ogol mysz za lewym uchem, zdezynfekuj i nałóż maść do oczu.
Wyprostuj szyję i wykonaj nacięcie.
Cofnij tkankę tłuszczową i mięśnie, aby odsłonić kość skroniową.
Wykonaj perforację pęcherza bębenkowego, części kości skroniowej, i poszerz otwór, aby odsłonić okrągłą błonę okienną lub RWM, cienką barierę dla ucha wewnętrznego.
Nakłuć RWM i wstrzyknąć wektor wirusowy związany z adenowirusem przenoszący gen terapeutyczny.
Cząsteczki wirusa dyfundują i wnikają do komórek rzęsatych.
Wewnątrz komórek rzęsatych cząsteczki wirusa dostarczają swój materiał genetyczny do jądra, uruchamiając produkcję transportera glutaminianu.
Pozwala to na pakowanie i uwalnianie glutaminianu, przywracając sygnalizację dźwiękową do nerwu słuchowego.
Po potwierdzeniu znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi, ogol lewy obszar zauszny i zdezynfekuj skórę myszy w wieku od 10 do 12 dni po porodzie 70% etanolem i jodowidonem. Następnie zakryj oczy ochronną maścią okulistyczną i ustaw zwierzę z wyciągniętą szyją na poduszce grzewczej. Po zakończeniu przygotowania chirurgicznego naciąć tkankę podskórną małymi nożyczkami, aby odsłonić mięsień zauszny. Po cofnięciu tkanki tłuszczowej do tylnej strony nacięcia należy rozdzielić mięśnie po prawej i lewej stronie, prostopadle do nacięcia.
Aby odsłonić kość skroniową. Użyj igły o rozmiarze 25G, aby przebić pęcherz bębenkowy. Odklejanie kości kleszczami w razie potrzeby, aby rozszerzyć otwór i umożliwić dostęp do podstawnego zwoju ślimaka.
Następnie poszerz otwór na tyle, aby umożliwić wizualizację tętnicy strzemiączkowej i okrągłej błony okiennej. Delikatnie nakłuć okrągłą membranę okienną pośrodku za pomocą bokrzemianowej pipety kapilarnej. Osuszyć okrągłą membranę okienną sterylną bibułą filtracyjną. Następnie odczekaj od pięciu do dziesięciu minut, aż wypływ płynu się ustabilizuje.
Na tym etapie należy zachować ostrożność podczas trzymania i przesuwania pipety, tak aby perforacja membrany okrągłego okienka była jak najmniejsza. W zależności od zastosowania mikroskopu, pipeta może być trzymana ręcznie lub za pomocą mikromanipulatora. Jak widać tutaj, pipetę trzymamy ręcznie, ponieważ mikroskop znajduje się zbyt blisko myszy, aby umożliwić użycie mikromanipulatora.
Teraz należy pobrać od jednego do dwóch mikrolitrów wirusa do wyciągniętej szklanej pipety z końcówką o średnicy 15 mikrometrów i mikrowstrzyknąć wirusa do błony bębenkowej przez ten sam otwór, który wcześniej wykonano w okrągłej membranie okiennej.