JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 2:59 min. • August 7th, 2025
Napełnij mikropipetę mieszaniną DNA zawierającą wektory plazmidowe przenoszące interesujący nas gen i barwnik śledzący. Zabezpiecz go w mikromanipulatorze.
Umieść blok agarozy pod mikroskopem i umieść na nim embrionalny wycinek mózgu myszy z agarozą z interneuronami korowymi.
Opuścić mikropipetę i wstrzyknąć mieszaninę DNA do obszaru progenitorowego interneuronu. Barwnik śledzący oznacza miejsce wstrzyknięcia.
Umieść kolejny blok agarozy na elektrodzie na szalce Petriego, a kolumnę agarozową na elektrodzie pokrywowej.
Przenieść plaster na blok i wyrównać elektrodę osłonową nad miejscem wstrzyknięcia.
Zastosuj krótkie impulsy elektryczne, aby tymczasowo przepuszczalnić błony komórkowe, umożliwiając plazmidom wejście do jądra.
Inkubuj plaster w pożywce, aby utrzymać żywotność komórek.
Wewnątrz jądra plazmid wyzwala ekspresję genów, wytwarza białko docelowe i moduluje funkcje progenitorowe interneuronów.
Do wstrzykiwania należy zmieszać DNA wektora ekspresyjnego i kontrolnego w stężeniu 1 mikrograma na mikrolitr dla każdego wektora i dodać szybki zielony roztwór podstawowy w rozcieńczeniu od 1 do 10. Napełnij wyciągniętą szklaną mikropipetę o średnicy wewnętrznej 0,5 milimetra i średnicy zewnętrznej 1 milimetra 10 mikrolitrami mieszaniny DNA i załaduj mikropipetę do pneumatycznego wtryskiwacza pompy pico. Umieść większy blok agarozy pod mikroskopem stereoskopowym i umieść plasterek do wstrzyknięcia na kawałek agarozy.
Następnie wstrzyknij od 25 do 50 nanolitrów objętości do wybranego obszaru wypukłości przyśrodkowego zwoju lub ogonowego wycinka. Natychmiast po wstrzyknięciu należy umieścić mały blok agarozy na elektrodzie szalki Petriego i za pomocą płaskiej mikroszpatułki przymocować kolumnę agarozową do ruchomej elektrody osłonowej.
Przenieś wstrzyknięty plasterek wraz z membraną podtrzymującą na blok agarozy i umieść górną elektrodę z kolumną agarozy na wybranym obszarze plasterka. Następnie galwanizuj obszar dwoma 5-milisekundowymi impulsami o napięciu 125 woltów, w odstępie 500 milisekund. Po elektroporacji umieść plaster wraz z membraną podtrzymującą z powrotem w naczyniu do przechowywania i włóż szalkę z powrotem do inkubatora kultur tkankowych.