Koherentna spektroskopia Ramana antystokesa do wizualizacji mielinizowanych neuronów w tkance mózgowej myszy

Weź chemicznie utrwalony plasterek mózgu myszy na płytce wielodołkowej.

Tkanka zawiera aksony otoczone bogatymi w lipidy osłonkami mielinowymi. Ciała komórkowe zawierają ciała Nissl złożone z szorstkiej retikulum endoplazmatycznego i rybosomów.

Inkubować w roztworze przepuszczalnym zawierającym fluorescencyjne barwienie Nissl. Roztwór przenika przez błony komórkowe, umożliwiając barwieniu wiązanie się z rybosomalnym RNA w ciałach Nissl i znakowanie ciał komórkowych.

Umieść tkankę pod mikroskopem konfokalnym ze spójnym systemem obrazowania anty-Stokesa Ramana lub CARS.

Bezpośrednio zsynchronizowana pompa i wiązki lasera Stokesa na tkankę, dostrojone do wzbudzania wiązań molekularnych w bogatej w lipidy osłonce mielinowej.

Wprowadź wiązkę lasera sondy, aby oddziaływać ze wzbudzonymi wiązaniami i wytwarzać sygnał anty-Stokesa specyficzny dla mieliny.

Fotodetektor przechwytuje sygnał w celu wygenerowania obrazu specyficznego dla mieliny.

Użyj obrazowania konfokalnego, aby uchwycić sygnały z oznakowanych nadwozi Nissla.

Nałóż obrazy konfokalne i CARS w celu wizualizacji architektury neuronalnej.

Po przygotowaniu tkanek zgodnie z opisem w manuskrypcie, wybarwić swobodnie pływające skrawki dla Nissl i pożywki z przeciwciałami w celu wizualizacji ciał komórkowych. Następnie inkubować skrawki na standardowym wytrząsarce laboratoryjnej przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Przed umieszczeniem próbek pod mikroskopem włącz i rozgrzej laser CARS przez co najmniej godzinę. Następnie wyrównaj laser CARS, nakładając się przestrzennie na pompę i wiązki laserowe Stokesa, a następnie wyreguluj opóźnienie między dwiema wiązkami lasera.

Kohler optyka kondensatora i przysłona mikroskopu do obrazowania CARS do przodu. Następnie wyreguluj zewnętrzny peryskop, aby wyśrodkować nakładające się przestrzennie dwa lasery na lustra głowicy skanującej mikroskopu. Aby uzyskać najlepszą detekcję CARS bez deskanowania, upewnij się, że kondensator jest wygładzony.

W przypadku immunofluorescencyjnego obrazowania konfokalnego i obrazowania CARS należy wyposażyć laser CARS zarówno w detektory przednie, jak i detektory nieuszkodzone epi-CARS, poprzez włączenie mikroskopu konfokalnego wyposażonego w widzialne lasery do obrazowania fluorescencyjnego. Teraz umieść skrawki w naczyniu hodowlanym z dnem szkiełka nakrywkowego i PBS, aby uniknąć wysuszenia tkanki. Użyj również szklanego ciężarka, aby utrzymać tkankę w pobliżu szkiełka nakrywkowego.

Korzystanie z graficznego interfejsu użytkownika. Ustaw parametry akwizycji obrazu dla konfokalnego obrazowania fluorescencyjnego CARS i Nissl. Umieść próbkę na stoliku mikroskopu. Skoncentruj się na próbce i uchwyć obrazy.