Wizualizacja białek i kompleksów makromolekularnych za pomocą barwienia ujemnego EM: od przygotowania siatki do akwizycji obrazu
December 22nd, 2011
Wizualizacja próbek białek za pomocą mikroskopii elektronowej (EM) stała się popularną metodą analizy strukturalnej. Jest przydatny do ilościowej analizy strukturalnej, takiej jak obliczanie rekonstrukcji 3D badanych cząsteczek, a także do jakościowego badania jakości preparatów białkowych. W tym artykule przedstawiamy szczegółowe protokoły przygotowania siatek EM, barwienia próbki oraz wizualizacji próbki w mikroskopie elektronowym. Początkujący użytkownicy mogą łatwo postępować zgodnie z tymi protokołami i wykorzystywać ujemne barwienie EM jako rutynowy test, oprócz innych testów biochemicznych, do oceny próbek białek.
Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja oczyszczonych próbek białek za pomocą mikroskopii elektronowej z ujemnym barwieniem. Osiąga się to poprzez przygotowanie najpierw siatek mikroskopii elektronowej, które będą podtrzymywać próbkę. Drugim krokiem zabiegu jest przygotowanie roztworu bejcy ujemnej.
Następnie próbka jest nakładana na siatkę mikroskopii elektronowej i barwiona ujemnie. Na koniec siatka EM jest ładowana do mikroskopu elektronowego, a obrazy są rejestrowane w odpowiednich warunkach optycznych. Konwencjonalne obrazy DEM w jasnym polu są o wysokim kontraście i ostro szczegółowe, pokazując pojedynczą makrocząsteczkę rozproszoną na pozbawionym cech charakterystycznych tle.
Mikroskopia elektronowa z barwieniem ujemnym to prosta metoda wizualizacji ulubionego białka. Może być stosowany jako rutynowy test do badania oczyszczonego białka, zarówno do analizy strukturalnej, jak i innych testów biochemicznych i biofizycznych. Tutaj pokazujemy, jak przygotować ujemnie wybarwioną próbkę do mikroskopii elektronowej.
Wizualna demonstracja tej metody jest pomocna, ponieważ niektóre kroki są trudne do nauczenia się z opisów tekstowych i rysunków. Zacznij od użycia szklanej pipety, aby umieścić pojedynczą kroplę kolodionu w dużej zlewce z wodą na powierzchni wody. W miarę rozprzestrzeniania się kolodion może wychwytywać pył z powierzchni wody.
Usuń i zastąp zakurzoną folię plastiku kolodionowego inną kroplą. Następnie umieść od 50 do 100 siatek EM jedna po drugiej na pływającej folii z tworzywa sztucznego błyszczącą stroną do dołu. Wybierz 400 siatek dla rutynowego ujemnego zabarwienia i wybierz 200 siatek siatki.
Do zbierania obrazów z parą pochylenia. Wybierz kawałek papieru niemarszczonego o powolnej chłonności, który jest nieco większy niż powierzchnia kratek. Umieść papier na kratkach i poczekaj, aż papier całkowicie się zwilży.
Papier nie powinien zbyt szybko wchłaniać wody. Używamy papieru z taniego notatnika. Siatki są teraz umieszczone między folią z tworzywa sztucznego a papierem.
Użyj kleszczy, aby umieścić papier na szalce Petriego, aby powoli wyschł na powietrzu. Unikaj szybszych metod suszenia, ponieważ mogą one prowadzić do zmarszczek. Maszyna do powlekania węglem używana w naszym laboratorium to wysokopróżniowa turbosprężarka węglowa Creston 2 0 8 C.
Wyposażony w monitor grubości folii Creston. Monitor wykorzystuje wagę kwarcową, która jest wrażliwa na osady węglowe. Jednak opisany tutaj protokół nie wymaga tego urządzenia Zacznij od naostrzenia i załadowania prętów węglowych do maszyny do powlekania węglem.
Następnie nałożyć szkiełko szkiełkowe smarem próżniowym, pozostawiając połowę oszronionego obszaru niepokrytego powłoką Po pokryciu węglowym, natłuszczone obszary szkiełka są wykorzystywane do oszacowania grubości powłoki węglowej. Umieść papier z kratkami na scenie pod słoikiem dzwonowym maszyny do powlekania węglowego. Umieść natłuszczoną szklankę.
Przesuń obok siatek. Napompuj komorę próżniową do co najmniej 10 mikroprzejazdów, w przeciwnym razie iskrzenie wygeneruje wiele dużych cząstek w siatce. Teraz zwiększaj prąd bardzo powoli.
Ostra końcówka pręta węglowego stanie się niezwykle jasna. Nie obserwuj tego gołym okiem, gdy zaczyna się powlekanie, szkiełko zmieni kolor na ciemnoszary w miarę narastania powłoki węglowej, odetnij prąd o pożądanej grubości węgla i uwzględnij przezroczystość słoika. Dokonując tej oceny, po skalibrowaniu ciemności szkiełka do grubości węgla, metoda ta jest tak samo dokładna, jak droższy monitor grubości folii.
Po zakończeniu procesu odpowietrz komorę próżniową i usuń powlekane kratki do późniejszego użycia. Cienka warstwa tworzywa sztucznego nie wpłynie na jakość negatywnie zabarwionego obrazu, ale można ją usunąć, mocząc siatki w chloroformie przez kilka godzin przed kontynuowaniem. Przygotuj świeży roztwór L-mrówczanu moczu lub użyj roztworu, który był przechowywany w ciemności przez mniej niż dwa tygodnie.
Dobry świeży roztwór ma żółty kolor, pH około czterech i jest bardzo czysty bez osadów. Zacznij od użycia dostępnego na rynku systemu do świecenia. Rozładuj kratki pokryte węglem.
Następnie dwie 20 mikrolitrowe krople wody destylowanej i 2 25 mikrolitrów krople świeżego roztworu mrówczanu pisuaru na kawałek perfilu. Używając kleszczyków antykapilarnych o odwrotnej sile, przytrzymaj rozżarzoną siatkę rozładowaną, stroną pokrytą węglem do góry. Co najważniejsze, kleszcze te nie odprowadzają cieczy z kratek.
Teraz nałóż dwa mikrolitry próbki białka na siatkę i poczekaj, aż białka zostaną wchłonięte przez siatkę. Zwykle zajmuje to 30 sekund, ale bardzo rozcieńczone próbki będą wymagały więcej czasu, co może mieć wpływ na stężenie buforu. Po zakończeniu zetrzyj próbkę białka za pomocą bibuły filtracyjnej.
Następnie umyj kratkę dwukrotnie, krótko dotykając jej powierzchni kropli wody i osuszając ją do sucha w ciągu kilku sekund. Po tym, jak woda na krótko dotknęła siatki, aby uzyskać kroplę plamy i szybko ją osuszyć. Stosując tę samą technikę, pozwól, aby siatka stykała się z drugą kroplą plamy przez 20 sekund.
Na koniec wysuszyć siatkę na powietrzu na okapie laboratoryjnym lub najlepiej w próżni przed sesją EM, sprawdzić ustawienie mikroskopu EM, ładując doskonały plik do wyrównywania, jeśli jest dostępny, powinien przywrócić go do prawie idealnego stanu. Teraz załaduj siatkę EM na pojedynczy standardowy uchwyt na próbki. Następnie włóż uchwyt do stolika.
Następnie poczekaj na zakończenie cyklu pompowania i włóż uchwyt do kolumny. Teraz rozpocznij wyszukiwanie obszaru próbki z dobrą plamą. Ręczne ustawianie ostrości przy użyciu metody minimalnego kontrastu lub za pomocą kamery CC, D i obliczanie czwórki na żywo.
Twoje spektrum mocy. Następnie ustaw głęboką ostrość zgodnie z potrzebami, zwykle na minus 1,5 mikrona. Stężenie barwnika może się różnić w zależności od siatki, więc szukaj białek o białym kontraście.
Unikaj obszarów z nierówną plamą lub dodatnią plamą, w których kontrast białkowy staje się. Wykorzystanie zarysowanego podejścia do tworzenia siatek i wizualizacji próbek barwionych ujemnie. Kilka znanych białek zostało zobrazowanych w celach demonstracyjnych.
Zwróć uwagę na ich szczegółowość i ostry kontrast. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować próbki ujemnie barwionych makrocząsteczek do obserwacji w mikroskopie elektronowym. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu około czterech godzin.
Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak rekonstrukcja 3D, aby lepiej zrozumieć struktury molekularne.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół wizualizowania oczyszczonych próbek białek za pomocą mikroskopii elektronowej kontrastu ujemnego (EM). Metoda ta jest przystępna dla początkujących użytkowników i służy jako rutynowa metoda analizy strukturalnej białek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia strukturalna
- Mikroskopia elektronowa
- Analiza białek
Tło
- Mikroskop elektronowy kontrastu ujemnego jest szeroko stosowaną techniką do wizualizowania białek.
- Umożliwia jakościową i ilościową analizę strukturalną.
- Protokoły dotyczące przygotowania próbek i wizualizowania są niezbędne do udanego zastosowania.
- Ta metoda może poprawić zrozumienie struktur białek.
Cel badania
- Dostarczyć kompleksowego przewodnika do przygotowania siatek EM i barwienia próbek.
- Przedstawić wizualizację białek za pomocą mikroskopu elektronowego kontrastu ujemnego.
- Ułatwić rutynowe stosowanie tej metody w analizie białek.
Zastosowane metody
- Przygotowanie siatek do mikroskopii elektronowej.
- Zastosowanie roztworu kontrastu ujemnego do próbek białek.
- Wizualizacja próbek w mikroskopie elektronowym.
- Rejestrowanie obrazów w optymalnych warunkach.
Główne wyniki
- Uzyskano wysokiego kontrastu obrazy białek.
- Szczegółowe protokoły zostały pomyślnie przedstawione.
- Pomocne materiały wizualne poprawiły zrozumienie złożonych kroków.
- Wyniki potwierdzają zastosowanie mikroskopu elektronowego kontrastu ujemnego w rutynowej analizie białek.
Wnioski
- Mikroskop elektronowy kontrastu ujemnego jest skuteczną metodą wizualizowania białek.
- Podane protokoły mogą być łatwo naśladowane przez początkujących użytkowników.
- Ta technika może uzupełniać inne badania biochemiczne.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Negative stain electron microscopy (EM) provides rapid, high-contrast visualization of purified proteins and macromolecular complexes, enabling early-stage assessment of sample quality and assembly state. This technique supports critical go/no-go decisions in discovery pipelines by confirming sample homogeneity and complex formation before resource-intensive downstream studies. Its accessibility and reproducibility make it a foundational tool for structural biology teams in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of protein complexes to confirm assembly and integrity.
- Supports rapid assessment of sample homogeneity, reducing ambiguity in target validation.
- Facilitates early detection of aggregation or degradation, de-risking downstream workflows.
- Provides visual evidence to support mechanistic hypotheses in target selection.
Screening & Assay Development
- Validates the quality of protein preparations prior to high-throughput screening or assay development.
- Ensures reproducibility and standardization of sample inputs for quantitative assays.
- Enables scalable preparation of validated EM grids for repeated use in screening campaigns.
- Supports reliable evaluation of compound effects on protein structure or assembly.
Translational & Preclinical Research
- Confirms structural integrity of therapeutic candidates prior to preclinical studies.
- Aligns visual data with biochemical and biophysical assays for translational continuity.
- Reduces risk of advancing structurally compromised candidates into preclinical models.
- Provides foundational data for subsequent 3D reconstruction and mechanistic studies.
Pipeline & Workflow Integration
Negative stain EM is positioned at the interface of protein purification and structural or functional characterization, bridging early discovery and preclinical research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing protein complexes and assemblies.
- Screening: Confirms sample quality and reproducibility for downstream assays.
- Analytics: Provides high-contrast images for quantitative assessment of sample homogeneity and aggregation.
- Translational Research: Ensures structural fidelity of candidates entering preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, routine assay adaptable across diverse protein targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in sample quality and target validation.
- Operational Value: Delivers rapid, reproducible, and scalable visualization workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in EM grid preparation and instrument operation.
- Needs access to electron microscopy infrastructure and staining reagents.
- Demands cross-team standardization for reproducible sample preparation and imaging.
- Adaptable to a wide range of protein sizes and complex types.
- Limited to surface visualization; not suitable for high-resolution internal structure analysis.
