Wizualizacja białek i kompleksów makromolekularnych za pomocą EM z barwieniem negatywowym: od przygotowania siatki do akwizycji obrazów
22 grudnia 2011
Wizualizacja próbek białek za pomocą elektronowej mikroskopii transmisyjnej (EM) z barwieniem negatywowym stała się popularną metodą analizy strukturalnej. Jest ona przydatna zarówno do ilościowej analizy struktury, np. obliczania rekonstrukcji 3D badanych cząsteczek, jak i do jakościowej oceny czystości preparatów białkowych. W niniejszym artykule przedstawiamy szczegółowe protokoły przygotowania siatek do EM, barwienia próbki oraz wizualizacji próbki w mikroskopie elektronowym. Początkujący użytkownicy mogą z łatwością postępować zgodnie z tymi protokołami, aby wykorzystać EM z barwieniem negatywowym jako rutynową analizę, obok innych testów biochemicznych, do oceny swoich próbek białek.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja oczyszczonych próbek białek za pomocą elektronowej mikroskopii z barwieniem negatywowym. Osiąga się to najpierw poprzez przygotowanie siatek do mikroskopii elektronowej, które będą stanowić podłoże dla próbki. Drugim krokiem procedury jest przygotowanie roztworu do barwienia negatywowego.
Następnie próbkę nanosi się na siatkę do mikroskopii elektronowej i poddaje barwieniu negatywowemu. Na koniec siatkę EM umieszcza się w mikroskopie elektronowym i rejestruje obrazy przy odpowiednich warunkach optycznych. Konwencjonalne obrazy DEM w jasnym polu charakteryzują się wysokim kontrastem i ostrym odwzorowaniem szczegółów, ukazując pojedyncze makrocząsteczki rozproszone na jednolitym tle.
Elektronowa mikroskopia z barwieniem negatywowym to prosta metoda wizualizacji wybranego białka. Może być stosowana jako rutynowa analiza w celu zbadania oczyszczonego białka, zarówno na potrzeby analizy strukturalnej, jak i innych testów biochemicznych oraz biofizycznych. W niniejszym materiale demonstrujemy, jak przygotować próbkę z barwieniem negatywowym do mikroskopii elektronowej.
Wizualna demonstracja tej metody jest pomocna, ponieważ niektóre z etapów są trudne do opanowania na podstawie opisów tekstowych i rycin. Rozpocznij od użycia szklanej pipety, aby nanieść pojedynczą kroplę kolodionu na powierzchnię wody w dużym zlewce z wodą. W miarę rozprzestrzeniania się kolodionu może on wychwytywać cząsteczki kurzu z powierzchni wody.
Usunąć zakurzoną błonę z kolodionu i zastąpić ją nową kroplą. Następnie umieszczać pojedynczo od 50 do 100 siatek EM na pływającej błonie plastikowej, stroną błyszczącą do dołu. Do rutynowego barwienia negatywowego wybrać siatki o gęstości 400 mesh oraz siatki o gęstości 200 mesh.
Do zbierania obrazów par pod różnymi kątami. Wybierz kawałek niepomiętego papieru o powolnej chłonności, który jest nieco większy niż obszar siatek. Połóż papier na siatkach i odczekaj, aż papier całkowicie nasiąknie.
Papier nie powinien wchłaniać wody zbyt szybko. Używamy papieru z taniego notatnika. Siatki znajdują się teraz pomiędzy folią plastikową a papierem.
Za pomocą pęsety umieść papier w szalce Petriego, aby powoli wyschł na powietrzu. Unikaj szybszych metod suszenia, ponieważ mogą one prowadzić do powstawania zmarszczek. Urządzenie do napylania węgla wykorzystywane w naszym laboratorium to Creston 2 0 8 C high vacuum turbo carbon coer.
Wyposażony w monitor grubości warstwy Creston. Monitor wykorzystuje wagę kwarcową, która jest czuła na osady węglowe. Jednak opisany tutaj protokół nie wymaga użycia tego urządzenia. Rozpocznij od zaostrzenia i załadowania prętów węglowych do maszyny do napylania węgla.
Następnie pokryj smarem próżniowym szkiełko przedmiotowe, pozostawiając połowę matowego obszaru niepokrytej. Po napylaniu węgla obszary posmarowane na szkiełku służą do oszacowania grubości warstwy węgla. Umieść papier z siatkami na stoliku pod kloszem maszyny do napylania węgla. Ustaw posmarowane szkiełko.
Przesuń próbkę obok siatek. Opróżnij komorę próżniową do poziomu co najmniej 10 micro tours, w przeciwnym razie iskrzenie spowoduje powstanie wielu dużych cząstek na siatce. Teraz bardzo powoli zwiększ natężenie prądu.
Ostra końcówka pręta węglowego stanie się niezwykle jasna. Nie należy obserwować jej gołym okiem w momencie rozpoczęcia nakładania powłoki; w miarę narastania warstwy węgla szkiełko przedmiotowe zmieni kolor na ciemnoszary. Należy przerwać przepływ prądu po osiągnięciu pożądanej grubości węgla, biorąc pod uwagę przezroczystość klosza. Po skalibrowaniu stopnia zaciemnienia szkiełka względem grubości węgla, metoda ta jest tak samo dokładna, jak znacznie droższy monitor grubości warstwy.
Po zakończeniu procesu odpowietrz komorę próżniową i wyjmij napylone siatki do późniejszego użycia. Cienka warstwa plastiku nie wpłynie na jakość obrazu z barwienia negatywowego, ale można ją usunąć, mocząc siatki w chloroformie przez kilka godzin przed przystąpieniem do dalszych prac. Przygotuj świeży roztwór mrannianu uranylu lub użyj roztworu, który był przechowywany w ciemności przez mniej niż dwa tygodnie.
Świeży, prawidłowy roztwór ma żółty kolor, pH wynoszące około czterech i jest bardzo przejrzysty, bez obecności osadów. Należy rozpocząć od użycia dostępnego komercyjnie systemu do glow-discharge. Przeprowadzić proces glow-discharge siatek pokrytych węglem.
Następnie nanieś dwie krople wody destylowanej o objętości 20 µL oraz dwie krople świeżego roztworu mrówczanu mocznika o objętości 25 µL na kawałek folii Parafilm. Używając pęsety antykapilarnej o odwróconym działaniu, przytrzymaj siatkę poddaną wyładowaniu żarowemu stroną powlekaną węglem do góry. Kluczowe jest, aby te pęsety nie odsysały cieczy z siatek.
Następnie nanieś 2 µL próbki białka na siatkę i odczekaj, aż białka zostaną wchłonięte przez siatkę. Zazwyczaj trwa to 30 sekund, jednak bardzo rozcieńczone próbki będą wymagały więcej czasu, co może wpłynąć na stężenia buforu. Po zakończeniu osusz próbkę białka za pomocą papieru filtrującego.
Następnie przemyj siatkę dwukrotnie, krótko dotykając jej powierzchni kropli wody, a następnie osuszając ją przez kilka sekund. Po kontakcie z wodą, dotknij siatki kroplą barwnika i szybko ją osusz. Stosując tę samą technikę, pozostaw siatkę w kontakcie z drugą kroplą barwnika przez 20 sekund.
Na koniec wysusz siatkę na powietrzu w dygestorium lub, co bardziej zalecane, w próżni przed sesją EM; sprawdź ustawienie mikroskopu EM, ładując plik z optymalnymi parametrami ustawień, jeśli jest dostępny, co powinno przywrócić go do niemal idealnego stanu. Następnie umieść siatkę EM w standardowym uchwycie do próbek z pojedynczym nachyleniem. Na koniec włóż uchwyt do stolika mikroskopu.
Następnie należy odczekać do zakończenia cyklu pompowania i wsunąć uchwyt do kolumny. Teraz należy rozpocząć poszukiwanie obszaru próbki z dobrym barwieniem. Wykonaj ustawienie ostrości ręcznie, stosując metodę minimalnego kontrastu lub korzystając z kamery CC, D i obliczając wartość live four.
Widmo mocy. Następnie ustaw głębokość ogniskowania (deep focus) według potrzeb, zazwyczaj na -1,5 µm. Stężenie barwnika może różnić się w obrębie siatki, dlatego należy poszukiwać białek o białym kontraście.
Należy unikać obszarów z nierównomiernym barwieniem lub barwieniem pozytywnym, w których kontrast białek staje się czarny. W celu przygotowania siatek i wizualizacji próbek barwionych negatywnie zastosowano opisane podejście. W celach demonstracyjnych wykonano obrazy kilku znanych białek.
Zwróć uwagę na szczegółowość i ostry kontrast. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować próbki makrocząsteczek z barwieniem negatywowym do obserwacji w mikroskopie elektronowym. Po opanowaniu tej techniki, jej wykonanie zajmuje około czterech godzin.
Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak rekonstrukcja 3D, aby lepiej zrozumieć struktury molekularne.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół wizualizacji oczyszczonych próbek białek z wykorzystaniem elektronowej mikroskopii transmisyjnej (EM) z barwieniem negatywowym. Metoda ta jest dostępna dla początkujących użytkowników i służy jako rutynowy test w analizie strukturalnej białek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia strukturalna
- Mikroskopia elektronowa
- Analiza białek
Wprowadzenie
- EM z barwieniem negatywowym jest powszechnie stosowaną techniką wizualizacji białek.
- Umożliwia ona zarówno jakościową, jak i ilościową analizę strukturalną.
- Protokoły przygotowania próbek i wizualizacji są niezbędne dla skutecznego zastosowania tej metody.
- Metoda ta może przyczynić się do lepszego zrozumienia struktur białkowych.
Cel badania
- Aby zapewnić kompleksowy przewodnik po przygotowaniu siatek do EM i barwieniu próbek.
- Aby zademonstrować wizualizację białek przy użyciu EM z barwieniem negatywowym.
- Aby ułatwić rutynowe stosowanie tej metody w analizie białek.
Zastosowane metody
- Przygotowanie siatek do mikroskopii elektronowej.
- Nakładanie roztworu do barwienia negatywowego na próbki białek.
- Wizualizacja próbek w mikroskopie elektronowym.
- Rejestracja obrazów w optymalnych warunkach.
Główne wyniki
- Uzyskano wysokokontrastowe obrazy białek.
- Pomyślnie zaprezentowano szczegółowe protokoły.
- Pomoce wizualne ułatwiły zrozumienie złożonych etapów.
- Wyniki potwierdzają zasadność stosowania EM z barwieniem negatywowym w rutynowej analizie białek.
Wnioski
- EM z barwieniem negatywnym jest skuteczną metodą wizualizacji białek.
- Przedstawione protokoły mogą być z łatwością stosowane przez początkujących użytkowników.
- Technika ta może uzupełniać inne analizy biochemiczne.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Mikroskopia elektronowa (EM) z barwieniem negatywowym zapewnia szybką, wysokokontrastową wizualizację oczyszczonych białek i kompleksów makromolekularnych, umożliwiając wczesną ocenę jakości próbki oraz stanu ich złożenia. Technika ta wspiera podejmowanie kluczowych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac w procesach badawczych poprzez potwierdzenie homogeniczności próbki i formowania się kompleksów przed rozpoczęciem czasochłonnych i kosztownych badań następczych. Jej dostępność i powtarzalność sprawiają, że jest ona podstawowym narzędziem dla zespołów biologii strukturalnej w działach badawczo-rozwojowych (R&D) branży biofarmaceutycznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach biofarmaceutycznych&D
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią wizualizację kompleksów białkowych w celu potwierdzenia ich składu i integralności.
- Wspiera szybką ocenę homogeniczności próbki, ograniczając niejednoznaczność w walidacji celu.
- Ułatwia wczesne wykrywanie agregacji lub degradacji, zmniejszając ryzyko w dalszych etapach procesu.
- Dostarcza dowodów wizualnych wspierających hipotezy mechanistyczne w procesie wyboru celu.
Przesiewy i opracowanie testów
- Weryfikuje jakość preparatów białkowych przed przesiewaniem wysokoprzepustowym lub opracowaniem analizy.
- Zapewnia powtarzalność i standaryzację materiału wejściowego dla analiz ilościowych.
- Umożliwia skalowalną preparację zwalidowanych siatek EM do wielokrotnego użycia w kampaniach przesiewowych.
- Wspiera wiarygodną ocenę wpływu związków na strukturę lub montaż białek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Potwierdza integralność strukturalną kandydatów terapeutycznych przed badaniami przedklinicznymi.
- Koreluje dane wizualne z analizami biochemicznymi i biofizycznymi w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Zmniejsza ryzyko wprowadzania kandydatów o naruszonej strukturze do modeli przedklinicznych.
- Dostarcza podstawowych danych do późniejszej rekonstrukcji 3D i badań mechanistycznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Mikroskopia elektronowa z barwieniem negatywowym znajduje się na styku oczyszczania białek i ich charakterystyki strukturalnej lub funkcjonalnej, stanowiąc pomost między wczesną fazą odkryć a badaniami przedklinicznymi.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez wizualizację kompleksów i zgrupowań białkowych.
- Przesiewanie: Potwierdza jakość i powtarzalność próbek dla dalszych analiz.
- Analityka: Zapewnia wysokokontrastowe obrazy do ilościowej oceny homogeniczności i agregacji próbek.
- Badania translacyjne: Gwarantuje wierność strukturalną kandydatów wchodzących w fazę walidacji przedklinicznej.
- Zastosowania w przedsiębiorstwach: Oferuje zestandaryzowany, rutynowy test możliwy do dostosowania do różnych celów białkowych i projektów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie jakości próbek i walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia szybkie, powtarzalne i skalowalne przepływy pracy w wizualizacji.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i zmniejsza ryzyko biologiczne na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój strukturalnie zwalidowanych kandydatów.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w przygotowywaniu siatek do EM oraz w obsłudze instrumentu.
- Wymaga dostępu do infrastruktury mikroskopii elektronowej oraz odczynników barwiących.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia powtarzalności przygotowania próbek i obrazowania.
- Możliwość zastosowania dla szerokiego zakresu wielkości białek i typów kompleksów.
- Ograniczone do wizualizacji powierzchni; nieodpowiednie do wysokorozdzielczej analizy struktury wewnętrznej.
