Name: Wizualizacja białek i kompleksów makromolekularnych za pomocą barwienia ujemnego EM: od przygotowania siatki do akwizycji obrazu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji białek za pomocą ujemnego barwienia w mikroskopii elektronowej. Protokół obejmuje przygotowanie siatek EM, nakładanie próbek i akwizycję obrazów. Technika ta umożliwia rutynową analizę strukturalną makromolekuł.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace z zakresu mikroskopii elektronowej w laboratorium Cheng są częściowo finansowane z grantów NIH (1R01GM082893, 1R01GM098672, 1S10RR026814-01 oraz P50GM082250 (dla A. Frankel)), a także z grantu UCSF Program of Breakthrough Biomedical Research, Opportunity Award oraz New Technology Award.

1. Przygotowanie siatek EM do napylania węgla
<ol>
 <li>Napełnić duży szklany zlew odmierniczy wodą destylowaną.</li>
 <li>Za pomocą szklanej pipety nanieść jedną kroplę kolodionu (~20μl, 2% w octanie amylu, Electron Microscopy Sciences, PA, USA) na powierzchnię wody. Kolodion rozprzestrzeni się, tworząc cienką warstwę tworzywa na granicy woda/powietrze; Uwaga: Pierwsza kropla kolodionu może posłużyć do oczyszczenia powierzchni wody z cząsteczek kurzu. Po usunięciu filmu z pierwszej kropli powierzchnia wody jest wolna od kurzu.</li>
 <li>Umieszczać pojedynczo siatki EM, siatki Gilder Cu o gęstości 400 lub 200 mesh zakupione od Ted Pella Inc. (USA), na warstwie tworzywa pływającej na powierzchni wody; Zazwyczaj umieszczamy od 50 do 100 siatek w układzie gęstego upakowania, błyszczącą stroną siatki skierowaną w dół, w stronę warstwy tworzywa (Rys. 1A). Uwaga: Siatki 200 mesh są odpowiednie do rutynowych siatek EM do barwienia negatywowego, natomiast siatki 200 mesh nadają się do zbierania obrazów par nachylenia.</li>
 <li>Wyciąć kawałek papieru o wymiarach nieco większych niż obszar, w którym siatki zostały rozmieszczone na warstwie tworzywa. Ostrożnie położyć papier na wierzchu siatki (Rys. 1B) i poczekać, aż papier stanie się całkowicie mokry (Rys. 1C). Uwaga: Różne rodzaje papieru mają różną szybkość wchłaniania wody. Ważne jest, aby papier nie chłonął wody zbyt szybko. Na przykład zwykły papier filtracyjny nie nadaje się do tego celu, ponieważ chłonie wodę zbyt szybko i tworzy wiele zmarszczek. Film węglowy wykonany ze zmarszczonego papieru nie jest płaski, a zatem nie nadaje się do zbierania obrazów par nachylenia dla 3D rekonstrukcji z losowym nachyleniem stożkowym. Należy przetestować różne rodzaje papieru, aby znaleźć odpowiedni. W naszym laboratorium stosujemy papier z notatników kupionych w lokalnym sklepie spożywczym. Czasami za odpowiedni uznawano również papier gazetowy. Inną opcją jest użycie stosunkowo grubego papieru ryżowego stosowanego w kaligrafii chińskiej/japońskiej.</li>
 <li>Szybko wykonać nacięcia w filmie z tworzywa wokół i blisko namoczonego papieru. Bezzwłocznie po tym użyć pęsety, aby podnieść papier z siatkami uwięzionymi między filmem z tworzywa a papierem. Umieścić papier w szalce Petri z siatkami skierowanymi do góry w celu wysuszenia na powietrzu (Rys. 1D); Uwaga: Ważne jest, aby pozwolić papierowi wyschnąć naturalnie. Zbyt szybkie suszenie powoduje powstanie wielu zmarszczek w papierze.</li>
</ol>
2. Powlekanie siatek karbonem
<ol>
 <li>Urządzenie do napylania węgla używane w naszym laboratorium to Cressington 208C High Vacuum Turbo Carbon Coater (Ted Pella). Nasz system jest wyposażony w monitor grubości filmu Cressington, który mierzy grubość napylonej warstwy węgla w oparciu o zasadę, że częstotliwość drgań kryształu kwarcu zmienia się pod wpływem masy filmu osadzonego na jego powierzchni. Jednak opisany tutaj protokół nie wymaga monitora grubości, ponieważ często nie jest on dostępny w każdym laboratorium.</li>
 <li>Należy zaostrzyć pręcik węglowy za pomocą ostrzałki (Ted Pella), a następnie umieścić pręciki węglowe w urządzeniu do napylania (Rys. 2A). Dwa pręciki, jeden z ostrym końcem, a drugi z płaskim, są ustawione naprzeciw siebie.</li>
 <li>Należy nanieść smar próżniowy na połowę matowego obszaru szkiełka przedmiotowego i umieścić je obok siatek (Rys. 2B). Tylko połowa matowego obszaru szkiełka powinna być pokryta smarem próżniowym. Uwaga: obszar ze smarem próżniowym nie zmieni koloru po napylaniu węgla. Kontrast między sąsiadującymi obszarami ze smarem i bez niego pozwala na oszacowanie grubości napylonego węgla.</li>
 <li>Należy położyć papier z siatkami na stole urządzenia do napylania węgla. Szkiełko przedmiotowe należy umieścić obok siatek (Rys. 2C). Uwaga: można również najpierw przenieść siatki pokryte folią plastikową na szkiełko przedmiotowe przed napylaniem, aby zapobiec odpadaniu wielu siatek z papieru.</li>
 <li>Należy odpompować komorę próżniową i poczekać, aż próżnia osiągnie poziom 10-5 Torr. Uwaga: napylanie przy niższej próżni często generuje wiele iskier, co skutkuje obecnością wielu dużych cząstek węgla na siatce.</li>
 <li>Należy bardzo powoli zwiększać natężenie prądu. Ostry koniec pręcika węglowego w miarę wzrostu natężenia prądu najpierw stanie się czerwony, a następnie biały. Nie należy patrzeć bezpośrednio na jasno świecący koniec gołym okiem. Należy przestać zwiększać natężenie prądu w momencie rozpoczęcia napylania. Szkiełko przedmiotowe zmieni kolor z białego na jasnoszary, a następnie na ciemnoszary. Ciemność szkiełek koreluje z grubością napylanej warstwy węgla. Aby zakończyć napylanie po osiągnięciu pożądanej grubości, należy wyłączyć prąd (Rys. 2D). Uwaga: 1) Po wielokrotnych procesach napylania węgla, węgiel osadzony na wewnętrznej stronie szklanego klosza może przyciemnić jego kolor. Powoduje to, że napylona warstwa węgla wydaje się grubsza, niż jest w rzeczywistości. 2) Jeden zaostrzony pręcik węglowy można wykorzystać do kilku napyleń. Ostrość końcówki stopniowo zmniejsza się po każdym procesie. Maksymalne natężenie prądu zależy od ostrości pręcika węglowego. Świeżo zaostrzony pręcik o mniejszej średnicy wymaga relatywnie niższego natężenia prądu do odparowania węgla. Późniejsze napylania mogą wymagać nieco wyższego natężenia prądu.</li>
 <li>Należy odpowietrzyć komorę próżniową i wyjąć napylone siatki do późniejszego użycia. 
 Uwaga 1. Bardziej dokładną metodą kontrolowania grubości węgla jest zastosowanie monitora grubości filmu. Można również przeprowadzić jakościową kalibrację koloru względem dokładnej grubości zmierzonej monitorem. Przydatna grubość węgla dla tej techniki wynosi od 3 do 7 nm.</li>
</ol>
Jest to prosta i łatwa metoda przygotowania dużej ilości siatek pokrytych węglem, zazwyczaj ok. 100 siatek na jedną partię. Siatki zawierają cienką warstwę plastiku, która zazwyczaj nie wpływa na jakość obrazu po barwieniu negatywowym. Jednak siatki przygotowane tą metodą nie nadają się do krio-EM. Warstwę plastiku można usunąć, mocząc siatki w chloroformie przez kilka godzin.
3. Przygotowanie roztworu formatu uranylu (0,75%) do EM z barwieniem negatywowym. Szczegółowy protokół został opisany wcześniej 5
<ol>
 <li>Odważyć 37,5mg formatu uranylu do małego zlewki;</li>
 <li>Dodać 5 ml wrzącej wody i mieszać przez 5 minut w ciemności;</li>
 <li>Dodać 10μl 5M NaOH i kontynuować mieszanie przez 5 minut;</li>
 <li>Przefiltrować roztwór za pomocą filtra strzykawkowego (Fisherbrand, 13mm syringe filter, 0.2μm, Nylon non-sterile, numer katalogowy 09-720-5) i przechowywać przefiltrowany roztwór w probówce Falcon 8ml owiniętej folią aluminiową; 
 Uwaga. Proszek formatu uranylu można nabyć od Electron Microscopy Sciences (Hatfield, PA), numer katalogowy 22451. Roztwór formatu uranylu jest światłoczuły i powinien być przechowywany z dala od bezpośredniego światła, na przykład poprzez owinięcie probówki Falcon folią aluminiową. Świeżo przygotowany roztwór ma jasną żółtą barwę (Rys. 3A). Roztwór barwiący może być przechowywany na blacie od jednego do dwóch tygodni przed wystąpieniem wytrącania. Format uranylu ma odczyn kwasowy z pH ~4. Dodanie NaOH podnosi wartość pH, jednak zbyt szybkie dodanie lub dodanie nadmiaru tej substancji może spowodować wytrącenie barwnika. Poza generowaniem kontrastu, format uranylu utrwala również próbkę białka. Ze względu na bardzo szybkie tempo utrwalania, niskie pH zazwyczaj nie wpływa na ogólne konformacje białek ani na tworzenie kompleksów białkowych 7.</li>
</ol>
4. Protokół przygotowania siatki EM do barwienia negatywnego. Protokół ten został opisany szczegółowo wcześniej 5
<ol>
 <li>Powlekanie siatki karbonem za pomocą wyładowań żarowych, z wykorzystaniem systemu PELCO easiGlow GlowDischarge (Ted Pella Inc., USA). Zastosowany prąd wynosi 15 mA, a czas wyładowań żarowych dla siatek to 30 sec. Uwaga. Siatki poddane wyładowaniom żarowym należy wykorzystać krótko po zabiegu. Często używamy siatek w czasie krótszym niż 2 godziny po wyładowaniu.</li>
 <li>Nanieście dwie krople wody destylowanej o objętości 20μl oraz dwie krople roztworu formatu uranylu o objętości 25μl na kawałek parafilmu (Rys. 3B).</li>
 <li>Przytrzymajcie siatkę po wyładowaniu żarowym za pomocą antykapilarnych pęset z siłą odpychającą, stroną powleczoną karbonem do góry. Uwaga: konieczne jest użycie pęset antykapilarnych. W przeciwnym razie próbka ciekła zostanie odessana z siatek przez siłę kapilarną między ramionami pęsety.</li>
 <li>Nanieście 2μl próbki białka na siatkę po wyładowaniu żarowym i odczekajcie 30 sec. Uwaga: czas oczekiwania oraz czas trwania wyładowań żarowych wpływają na stężenie białek zaadsorbowanych na siatce. Bardzo rozcieńczone próbki wymagają dłuższego czasu adsorpcji. Jednak przedłużona adsorpcja może zmienić stężenie buforu z powodu parowania wody. Osiągnięcie odpowiedniego rozkładu cząsteczek na siatce wymaga pewnego podejścia metodą prób i błędów.</li>
 <li>Odsączcie nadmiar próbki za pomocą papieru filtracyjnego.</li>
 <li>Dotknijcie powierzchnią siatki kropli wody, a następnie odsączcie wodę papierem filtracyjnym. Powtórzcie czynność z drugą kroplą wody.</li>
 <li>Krótko dotknijcie powierzchnią siatki pierwszej kropli barwnika. Odsączcie roztwór barwnika papierem filtracyjnym.</li>
 <li>Dotknijcie powierzchnią siatki drugiej kropli barwnika na 20 seconds. Odsączcie roztwór barwnika papierem filtracyjnym.</li>
 <li>Osuszcie siatkę w próżni. Uwaga: można również pozostawić siatki na blacie lub w dygestorium do wyschnięcia na powietrzu. Zaletą suszenia w próżni jest możliwość natychmiastowej obserwacji siatek w EM. Możliwym artefaktem powstałym w wyniku szybkiego suszenia jest nierównomierne zabarwienie.</li>
</ol>
5. Transmisyjny mikroskop elektronowy
<ol>
 <li>Mikroskop użyty w tej demonstracji to Tecnai T12 (FEI Company) wyposażony w kamerę CCD Gatan 4K x 4K.</li>
 <li>Przed włożeniem próbki należy krótko sprawdzić wyrównanie mikroskopu; uwaga: jest to konieczne tylko raz na sesję EM. W mikroskopie modelowym można wcześniej zapisać niemal idealne wyrównanie. Załadowanie takiego pliku wyrównania powinno przywrócić ustawienia mikroskopu do stanu niemal idealnego.</li>
 <li>Załaduj siatkę EM do standardowego uchwytu próbek z pojedynczym pochyleniem.</li>
 <li>Wsuń uchwyt do CompuStage mikroskopu T12. Poczekaj na zakończenie cyklu pompowania.</li>
 <li>Wsuń uchwyt do kolumny.</li>
 <li>Ustaw ostrość próbki i wybierz pożądany defokus, zazwyczaj -1.5um. Uwaga: ustawienie ostrości można przeprowadzić ręcznie metodą minimalnego kontrastu lub za pomocą kamery CCD poprzez rejestrację obrazów na żywo i obliczanie widma mocy Fouriera w czasie rzeczywistym.</li>
 <li>Zarejestruj obraz za pomocą kamery CCD;</li>
 <li>Na obrazach próbek białek barwionych negatywnie białka są często widoczne jako biały kontrast, tzn. biała gęstość na ciemniejszym tle. Należy zauważyć, że choć stężenia białek w różnych obszarach tej samej siatki są zazwyczaj bardzo zbliżone, można zaobserwować różne poziomy zabarwienia w różnych miejscach tej samej siatki. Czasami obszary mogą mieć nierównomierne zabarwienie, a nawet zabarwienie pozytywne (białko wydaje się ciemne na jasnym tle), podczas gdy inne obszary mają idealne zabarwienie. Często konieczne jest przeszukanie siatki w celu znalezienia odpowiedniego obszaru do obrazowania.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Przedstawiono przykłady typowych, wysokiej jakości obrazów próbek barwionych negatywnie: ferrytyny śledziony konia (Rysunek 4A), fragmentu Fab (Rys. 4B), archeonowego proteasomu 20S (Rys. 4C) oraz nukleosomu (Rys. 4D).
<img alt="Schemat metody transferu w środowisku wodnym, demonstrujący proces podnoszenia papieru z powłoką hydrofobową." src="/files/ftp_upload/3227/3227fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Przygotowanie siatek pokrytych węglem do EM z barwieniem negatywowym. A) Umieszczanie siatek EM jedna po drugiej w gęstym układzie na powierzchni filmu kolodionowego. B) Położenie kawałka papieru nieco większego niż obszar zajmowany przez siatki. C) Oczekiwanie do całkowitego namoczenia papieru. D) Podniesienie papieru wraz z siatkami w celu wysuszenia na powietrzu.
<img alt="Układ do osadzania próżniowego z uchwytami do próbek dla procedury warstwowania cienkich filmów; sprzęt eksperymentalny." src="/files/ftp_upload/3227/3227fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Pokrywanie siatek EM węglem. A) Przygotowanie parownika węglowego: umieszczenie dwóch prętów węglowych w aparaturze do powlekania, przy czym jeden pręt (po lewej) jest zaostrzony na końcu. Drugi pręt (po prawej) ma płaską powierzchnię i styka się z ostrzem pręta znajdującego się po przeciwnej stronie. B) Nanoszenie niewielkiej ilości smaru próżniowego na jedną stronę szkiełka przedmiotowego. Obszar wewnątrz czarnej ramki zawiera smar próżniowy. C) Przygotowanie siatek do powlekania. Szkiełka przedmiotowe służą do utrzymania papieru w pozycji. Groty strzałek wskazują obszary ze smarem próżniowym. D) Po powlekaniu kolor szkiełka pokrytego smarem próżniowym nie zmienia się. Kontrast wskazuje grubość naniesionej warstwy węgla.
<img alt="Układ chromatograficzny: próbki w probówkach, płytka TLC, waga; procedura rozdzielania rozpuszczalników." src="/files/ftp_upload/3227/3227fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Ilustracja procedury barwienia negatywowego. A) Świeżo przygotowany (po lewej) roztwór formatu uranylu jest przezroczysty i nie wykazuje obecności osadów. Po 1~2 tygodniach na dnie probówki zaczynają gromadzić się osady. B) Nanieść dwie krople (~25μl) wody destylowanej i dwie krople roztworu formatu uranylu na kawałek parafilmu. Za pomocą pęsety antykapilarnej należy chwycić siatkę EM powlekaną węglem po wyładowaniu żarowym, stroną węglową do góry. Na siatkę nanosi się kroplę próbki (~2μl). C) Po odczekaniu 30 sekund należy odsączyć nadmiar roztworu papierem filtracyjnym. D) Obrócić siatkę tak, aby strona z próbką dotknęła pierwszej kropli wody. Powtórzyć kroki C i D, aby zakończyć proces barwienia.
<img alt="Mikroskopia elektronowa nanocząsteczek, panele A-D, skala 20 nm, analiza rozkładu cząsteczek." src="/files/ftp_upload/3227/3227fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Przykłady obrazów EM próbek białek barwionych negatywnie. A) Ferrytyna zmielonej śledziony konia, B) fragment wiążący antygen (Fab), C) archeonalny proteasom 20S oraz D) nukleosom. Wszystkie obrazy zostały zarejestrowane przy tym samym powiększeniu. Pasek skali wynosi 20nm.

<ol><li>Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+advent+of+near-atomic+resolution+in+single-particle+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The advent of near-atomic resolution in single-particle electron microscopy.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 723-742 (2009).</li>
<li>Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-atomic+resolution+reconstructions+of+icosahedral+viruses+from+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 21 (2), 265-273 (2011).</li>
<li>Zhou, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+resolution+cryo+electron+microscopy+of+macromolecular+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Protein+Chem.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Atomic resolution cryo electron microscopy of macromolecular complexes.</a> Adv. Protein Chem. Struct. Biol. 82, 1-35 (2011).</li>
<li>Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of viruses.</a> Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).</li>
<li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+Staining+and+Image+Classification+-+Powerful+Tools+in+Modern+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Proced.+Online%22%5BJournal%5D)">Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy.</a> Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).</li>
<li>Rabl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+gate+opening+in+the+20S+proteasome+by+the+proteasomal+ATPases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanism of gate opening in the 20S proteasome by the proteasomal ATPases.</a> Mol. Cell. 30 (3), 360-368 (2008).</li>
<li>Zhao, F. Q., Craig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+time-resolved+changes+in+molecular+structure+by+negative+staining%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining.</a> J. Struct. Biol. 141 (1), 43-52 (2003).</li>
<li>Radermacher, M., Wagenknecht, T., Verschoor, A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+from+a+single-exposure%2C+random+conical+tilt+series+applied+to+the+50S+ribosomal+subunit+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction from a single-exposure, random conical tilt series applied to the 50S ribosomal subunit of Escherichia coli.</a> J. Microsc. 146 (Pt. 2), 113-136 (1987).</li>
<li>Zhao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+crystallization+conditions+of+human+leukotriene+C4+synthase+requiring+adjustment+of+a+particularly+large+combination+of+specific+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring adjustment of a particularly large combination of specific parameters.</a> J. Struct. Biol. 169 (3), 450-454 (2010).</li>
<li>Nishida, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+leukocyte+beta2+integrins+by+conversion+from+bent+to+extended+conformations%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Activation of leukocyte beta2 integrins by conversion from bent to extended conformations.</a> Immunity. 25 (4), 583-594 (2006).</li>
</ol>

Produkcja i wolny dostęp do tego artykułu wideo są sponsorowane przez FEI.

Elektronowa mikroskopia z barwieniem negatywowym (EM) jest potężnym narzędziem, które można wykorzystać do badania struktur 3D oczyszczonych próbek białek, na przykład przy użyciu metody losowego nachylenia stożkowego (random conical tilt) 8, która wymaga zebrania pary obrazów – jednego z preparatu nachylonego pod kątem 60° i jednego z tego samego obszaru, ale bez nachylenia – w celu obliczenia rekonstrukcji 3D kompleksów makromolekularnych. Ponadto EM z barwieniem negatywowym może mieć wiele innych zastosowań, takich jak przesiewanie dwuwymiarowych (2D) kryształów białek błonowych 9, wizualizacja kompleksów białkowych w różnych konformacjach 10 lub po prostu wizualizacja homogeniczności i/lub heterogeniczności oczyszczonych próbek białek, co pozwala na uzyskanie informacji zwrotnych w celu udoskonalenia procedur oczyszczania białek itp. Może to być niezwykle użyteczna metoda dla biochemików. W niniejszym artykule przedstawiliśmy protokoły obejmujące etapy od przygotowania siatek pokrytych węglem po pozyskiwanie obrazów próbek białek barwionych negatywowo w mikroskopie elektronowym. Jak tutaj pokazano, procedura jest dość prosta i łatwa do przeprowadzenia. W przypadku próby obliczenia rekonstrukcji 3D obserwowanej próbki metodą losowego nachylenia stożkowego konieczne jest wykonanie par obrazów z nachyleniem. Jeżeli jednak celem jest analiza pojedynczych cząsteczek (single particle analysis), wystarczy wiele obrazów bez nachylenia. W obu przypadkach wymagane jest dalsze przetwarzanie obrazów, co wykracza poza zakres niniejszego artykułu wideo.
Jak w przypadku każdej metody, protokoły mogą ulegać modyfikacjom. Formian uranylu bardzo dobrze sprawdza się jako odczynnik do barwienia negatywowego w większości przypadków. Octan uranylu to kolejny powszechnie stosowany odczynnik do barwienia negatywowego. Działa on bardzo podobnie do formianu uranylu, lecz charakteryzuje się większym rozmiarem ziarna i w wielu przypadkach niższym kontrastem niż formian uranylu. Zaletą stosowania octanu uranylu jest to, że roztwór ten zachowuje stabilność dłużej niż formian uranylu, dzięki czemu nie ma konieczności przygotowywania świeżego roztworu co jeden lub dwa tygodnie. Zarówno formian, jak i octan uranylu mają odczyn kwasowy. Naturalną obawą jest fakt, że niskie pH może wywołać zmiany w badanej próbce białka. Oba roztwory barwiące pełnią również funkcję utrwalaczy białek. Wcześniejsze badanie wykazało, że oba szybko utrwalają próbki białek 7. Szybkie utrwalanie sprawia, że niskie pH ma mniejsze znaczenie. W procesie barwienia próbka białka zostaje utrwalona, zanim niskie pH zdąży wywołać jakiekolwiek zmiany. Niemniej jednak inne odczynniki do barwienia negatywowego, takie jak molibdan amonu i kwas fosfowolframowy, mogą przynieść lepsze wyniki w barwieniu próbek, gdy niskie pH jest problematyczne 7. Zarówno molibdan amonu, jak i kwas fosfowolframowy mają pH zbliżone do obojętnego, lecz kontrast próbek białek uzyskany przy użyciu tych barwników jest zazwyczaj gorszy niż w przypadku formianu uranylu.

<table><tbody><tr><td>Kolodium</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>12620-30</td><td>30ml, 2% w octanie amylu</td></tr><tr><td>Siatki miedziane Gilder Cu</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>G400/G200</td><td>400/200 mesh</td></tr><tr><td>Naparowarka węglowa z wysoką próżnią Cressington 208C High Vaccume Turbo Carbon Coater</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>9260</td><td> </td></tr><tr><td>Dwustronnie zaostrzone pręty węglowe</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>58</td><td> </td></tr><tr><td>Formian uranylu</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16984-59-1</td><td>czystość 99.9%</td></tr><tr><td>System wyładowań GlowDischarge PELCO easiGlow</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>91000</td><td>Kupić w lokalnej aptece</td></tr><tr><td>Papier filtracyjny Whatman #1</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-805E</td><td> </td></tr></tbody></table>

wizualizacja białek i kompleksów makromolekularnych za pomocą em z barwieniem negatywowym: od przygotowania siatki do akwizycji obrazów

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Mikroskopia elektronowa (EM) pojedynczych cząsteczek, zarówno w przypadku próbek biologicznych barwionych negatywnie, jak i mrożonych w stanie uwodnionym, stała się wszechstronnym narzędziem w biologii strukturalnej 1. W ostatnich latach metoda ta odniosła wielki sukces w badaniu struktur białek i kompleksów makromolekularnych 2, 3. W porównaniu z kriomikroskopią elektronową (cryoEM), w której zamrożone i uwodnione próbki białek są zatopione w cienkiej warstwie lodu witryfikowanego 4, barwienie negatywne jest prostszą metodą przygotowania próbek, polegającą na zatopieniu białek w cienkiej warstwie wysuszonej soli ciężkiego metalu w celu zwiększenia kontrastu preparatu 5. Zwiększony kontrast w EM z barwieniem negatywnym pozwala na badanie stosunkowo małych próbek biologicznych. Poza wyznaczaniem struktury trójwymiarowej (3D) oczyszczonych białek lub kompleksów białkowych 6, metoda ta może być wykorzystywana w znacznie szerszym zakresie. Na przykład EM z barwieniem negatywnym może być łatwo użyta do wizualizacji oczyszczonych próbek białek, pozwalając uzyskać informacje takie jak homogeniczność lub heterogeniczność próbki, tworzenie kompleksów białkowych lub dużych agregatów, a także po prostu do oceny jakości preparatu białkowego.
W niniejszym artykule wideo przedstawiamy pełny protokół wykorzystania EM do obserwacji próbek białek barwionych negatywnie, począwszy od przygotowania siatek pokrytych węglem do EM z barwieniem negatywnym, aż po pozyskiwanie obrazów próbek barwionych negatywnie w mikroskopie elektronowym pracującym przy napięciu przyspieszającym 120kV. Protokoły te są rutynowo stosowane w naszym laboratorium i mogą być z łatwością wdrożone przez początkujących użytkowników.

Wizualizacja próbek białek za pomocą elektronowej mikroskopii transmisyjnej (EM) z barwieniem negatywowym stała się popularną metodą analizy strukturalnej. Jest ona przydatna zarówno do ilościowej analizy struktury, np. obliczania rekonstrukcji 3D badanych cząsteczek, jak i do jakościowej oceny czystości preparatów białkowych. W niniejszym artykule przedstawiamy szczegółowe protokoły przygotowania siatek do EM, barwienia próbki oraz wizualizacji próbki w mikroskopie elektronowym. Początkujący użytkownicy mogą z łatwością postępować zgodnie z tymi protokołami, aby wykorzystać EM z barwieniem negatywowym jako rutynową analizę, obok innych testów biochemicznych, do oceny swoich próbek białek.

Wizualizacja białek i kompleksów makromolekularnych za pomocą EM z barwieniem negatywowym: od przygotowania siatki do akwizycji obrazów

Kriomikroskopia elektronowa (EM) pojedynczych cząsteczek, stosowana zarówno w przypadku biologicznych próbek barwionych negatywnie, jak i mrożonych w stanie uwodnionym, stała się wszechstronnym narzędziem w badaniach strukturalnych...

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja oczyszczonych próbek białek za pomocą elektronowej mikroskopii z zastosowaniem barwienia negatywowego. Jest to realizowane poprzez wstępne przygotowanie siatek do mikroskopii elektronowej, które będą stanowić podłoże dla próbki. Drugim krokiem procedury jest przygotowanie roztworu do barwienia negatywowego.Następnie próbkę nanosi się na siatkę do mikroskopii elektronowej i poddaje barwieniu negatywowemu. W ostatnim kroku siatkę EM umieszcza się w mikroskopie elektronowym i rejestruje obrazy przy odpowiednich warunkach optycznych. Konwencjonalne obrazy w jasnym polu (DEM) charakteryzują się wysokim kontrastem i ostrym odwzorowaniem szczegółów, ukazując pojedyncze makrocząsteczki rozproszone na jednolitym tle.Elektronowa mikroskopia z negatywnym barwieniem jest prostą metodą wizualizacji wybranych białek. Może być stosowana jako rutynowy test do badania oczyszczonego białka, zarówno w celu analizy strukturalnej, jak i w innych testach biochemicznych i biofizycznych. W niniejszym materiale demonstrujemy, jak przygotować próbkę z negatywnym barwieniem do mikroskopii elektronowej.Wizualna demonstracja tej metody jest pomocna, ponieważ niektóre z etapów są trudne do opanowania na podstawie opisów tekstowych i rycin. Należy rozpocząć od użycia pipety szklanej do naniesienia pojedynczej kropli kolodionu na powierzchnię wody w dużym zlewce z wodą. W miarę rozprzestrzeniania się kolodionu może on wychwytywać kurz z powierzchni wody.Usunąć zakurzoną warstwę plastiku kolodionowego i zastąpić ją kolejną kroplą. Następnie umieścić po kolei od 50 do 100 siatek EM na pływającej warstwie plastiku, stroną błyszczącą skierowaną w dół. Do rutynowego barwienia negatywowego wybrać siatki o oczkowaniu 400 mesh oraz siatki o oczkowaniu 200 mesh.Do zbierania obrazów par nachylenia. Wybrać kawałek gładkiego papieru o niskiej chłonności, który jest nieco większy niż powierzchnia siatek. Położyć papier na siatkach i odczekać, aż papier stanie się całkowicie mokry.Papier nie powinien absorbować wody zbyt szybko. Używamy papieru z taniego notesu. Siatki znajdują się teraz pomiędzy folią plastikową a papierem.Za pomocą pęsety umieść papier w szalce Petriego, aby powoli wyschł na powietrzu. Unikaj szybszych metod suszenia, ponieważ mogą one prowadzić do powstawania zmarszczek. Urządzeniem do napylania węgla używanym w naszym laboratorium jest wysokopróżniowy turbo-napylacz węgla Creston 2 0 8 C.Wyposażone w monitor grubości warstwy Creston. Monitor wykorzystuje wagę kwarcową, która jest wrażliwa na osady węglowe. Jednak protokół opisany tutaj nie wymaga użycia tego urządzenia. Rozpocznij od zaostrzenia i załadowania prętów węglowych do urządzenia do napylania węgla.W kolejnym kroku należy pokryć smarem próżniowym szkiełko przedmiotowe, pozostawiając połowę obszaru matowego bez powłoki. Po napylaniu węgla obszary szkiełka pokryte smarem służą do oszacowania grubości warstwy węgla. Umieść papier z siatkami na stole pod kloszem urządzenia do napylania węgla. Ustaw wysmarowane szkiełko.Przesuń preparat obok siatek. Odpompuj komorę próżniową do wartości co najmniej 10 micro tours, w przeciwnym razie wyładowania iskrowe spowodują powstanie wielu dużych cząstek na siatce. Teraz bardzo powoli zwiększaj natężenie prądu.Ostra końcówka pręta węglowego stanie się niezwykle jasna. Nie należy obserwować jej gołym okiem w momencie rozpoczęcia procesu napylania; w miarę narastania warstwy węgla szkiełko przedmiotowe zmieni kolor na ciemnoszary. Przerwij przepływ prądu po osiągnięciu pożądanej grubości warstwy węgla, biorąc pod uwagę przezroczystość klosza. Po skalibrowaniu stopnia zaciemnienia szkiełka względem grubości warstwy węgla, metoda ta jest równie dokładna jak droższy monitor grubości filmu.Po zakończeniu procesu wypuść powietrze do komory próżniowej i wyjmij powlekane siateczki do późniejszego użycia. Cienka warstwa plastiku nie wpłynie na jakość obrazu z barwienia negatywowego, ale można ją usunąć, namaczając siateczki w chloroformie przez kilka godzin przed przystąpieniem do dalszych prac. Przygotuj świeży roztwór mrachianu uranylu lub użyj roztworu przechowywanego w ciemności przez mniej niż dwa tygodnie.Świeży roztwór dobrej jakości ma żółty kolor, pH w okolicach czterech i jest bardzo przejrzysty, bez żadnych osadów. Rozpocznij od użycia dostępnego komercyjnie systemu do glow-discharge. Przeprowadź rozładowanie siatek powlekanych węglem.Następnie nanieś dwie krople wody destylowanej o objętości 20 µl oraz dwie krople świeżego roztworu mrअधिकczanu mocznika o objętości 25 µl na kawałek folii Perfil. Używając pęsety antykapilarnej o odwróconej sile, przytrzymaj siatkę poddaną wyładowaniom żarowym stroną pokrytą węglem do góry. Kluczowe jest, aby pęsety te nie odsysały cieczy z siatek.Następnie nanieś 2 µL próbki białka na siatkę i odczekaj, aż białka zostaną wchłonięte przez siatkę. Zazwyczaj trwa to 30 s, jednak bardzo rozcieńczone próbki wymagają więcej czasu, co może wpłynąć na stężenia buforów. Po zakończeniu odsącz nadmiar próbki białka za pomocą papieru filtracyjnego.Następnie przemyj siatkę dwukrotnie, krótko dotykając jej powierzchni kroplą wody, a następnie osuszając ją poprzez odsączenie w ciągu kilku sekund. Po krótkim kontakcie wody z siatką, dotknij jej powierzchnią kroplą barwnika i szybko osusz poprzez odsączenie. Stosując tę samą technikę, pozostaw siatkę w kontakcie z drugą kroplą barwnika na 20 sekund.Na koniec wysuszyć siatkę na powietrzu w dygestorium lub najlepiej w próżni przed sesją EM; sprawdzić ustawienie mikroskopu EM, ładując plik optymalnego ustawienia, jeśli jest dostępny, co powinno przywrócić sprzęt do stanu niemal idealnego. Następnie umieścić siatkę EM w standardowym uchwycie do próbek z jednopłaszczyznowym nachyleniem. Na koniec wsunąć uchwyt do stolika mikroskopu.Następnie należy odczekać do zakończenia cyklu pompowania i włożyć uchwyt do kolumny. Teraz należy rozpocząć poszukiwanie obszaru próbki z dobrym zabarwieniem. Ustaw ostrość ręcznie, stosując metodę minimalnego kontrastu lub korzystając z kamery CC, D i obliczając obraz na żywo.Twoje widmo mocy. Następnie ustaw głębokość ostrości w zależności od potrzeb, zazwyczaj na -1,5 µm. Stężenie barwnika może różnić się w obrębie siatki, dlatego należy szukać białek o białym kontraście.Należy unikać obszarów z nierównomiernym barwieniem lub barwieniem pozytywnym, w których kontrast białek staje się czarny. W celu przygotowania siatek i wizualizacji próbek barwionych negatywnie zastosowano opisane podejście. W celach demonstracyjnych wykonano obrazowanie kilku znanych białek.Zwróć uwagę na ich szczegółowość oraz ostry kontrast. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować próbki makrocząsteczek poddanych barwieniu negatywnemu do obserwacji w mikroskopie elektronowym. Po opanowaniu techniki, jej wykonanie zajmuje około czterech godzin.Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak rekonstrukcja 3D, aby lepiej zrozumieć struktury molekularne.

visualizing-proteins-macromolecular-complexes-negative-stain-em-from

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Wizualizowanie białek i kompleksów makrocząsteczkowowych za pomocą mikroskopii elektronowej kontrastu ujemnego: od przygotowania siatki do pozyskiwania obrazu

Ten film opisuje procedurę negatywnego barwienia oczyszczonych egzosomów. Ujemnie barwione egzosomy są obrazowane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Ta technika pomaga uwidocznić morfologię egzosomów.

Barwienie ujemne oczyszczonych egzosomów: procedura wizualizacji morfologii egzosomów za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

W tym filmie demonstrujemy negatywne barwienie próbek wirusa w otoczce za pomocą kapsułki do przetwarzania w środowisku zabezpieczenia biologicznego. Ujemnie zabarwione wirusy można wizualizować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej w celu zbadania struktury i morfologii wirusa z rozdzielczością nanometrów.

Barwienie ujemne próbek wirusów na siatkach TEM za pomocą kapsułek: technika barwienia metalami ciężkimi w celu wizualizacji ultrastruktury wirusów otoczkowych

Aby zachować procesy neuronalne do analizy ultrastrukturalnej, opisujemy protokół posiewu pierwotnych neuronów na siatkach mikroskopii elektronowej, po którym następuje błyskawiczne zamrażanie, co daje próbki zawieszone w warstwie lodu szklistego. Próbki te można badać za pomocą mikroskopu krioelektronowego w celu wizualizacji struktur w skali nanometrowej.

Przygotowanie neuronów pierwotnych do wizualizacji neurytów w stanie zamrożono-uwodnionym za pomocą tomografii krioelektronowej

Ponad połowa białek to małe białka (masa cząsteczkowa &lt;200 kDa), które stanowią wyzwanie zarówno dla obrazowania mikroskopem elektronowym, jak i dla trójwymiarowych rekonstrukcji. Zoptymalizowane barwienie negatywowe to solidny i wysokoprzepustowy protokół umożliwiający uzyskanie obrazów o wysokim kontraście i stosunkowo wysokiej rozdzielczości (~1 nm) małych asymetrycznych białek lub kompleksów w różnych warunkach fizjologicznych.

Zoptymalizowane barwienie ujemne: wysokoprzepustowy protokół do badania małej i asymetrycznej struktury białka za pomocą mikroskopii elektronowej

Negatywna plama EM to potężna technika wizualizacji struktury makromolekularnej, ale różne techniki barwienia mogą dawać różne wyniki w zależności od próbki. W tym miejscu szczegółowo opisano kilka podejść do barwienia negatywnego, aby zapewnić wstępny przepływ pracy w celu rozwiązania problemu wizualizacji trudnych systemów.

Wariacje na temat metod mikroskopii elektronowej w barwieniu ujemnym: narzędzia do radzenia sobie z trudnymi systemami

Przedstawiono instrument i metody do przygotowania objętości próbek o rozmiarach nanolitrów do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Nie są wymagane żadne etapy papierowego blottingu, co pozwala uniknąć szkodliwych konsekwencji, jakie może to mieć dla białek, znacznie zmniejszając utratę próbki i umożliwiając analizę lizatu pojedynczej komórki do wizualnej proteomiki.

Zminiaturyzowane przygotowanie próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Dostarczamy protokoły i reprezentatywne dane do projektowania, montażu i charakteryzowania miceli kompleksu polielektrolitowego, nanocząstek typu rdzeń-powłoka tworzonych przez polielektrolity i hydrofilowe naładowane-nienaładowane kopolimery blokowe.

Montaż i charakterystyka miceli kompleksu polielektrolitu

Określanie struktury kompleksów makromolekularnych za pomocą cryoEM stało się rutyną dla niektórych klas białek i kompleksów. W tym miejscu podsumowano ten proces (przygotowanie próbki, badanie przesiewowe, pozyskiwanie i przetwarzanie danych), a czytelnicy są kierowani do dalszych szczegółowych zasobów i zmiennych, które mogą ulec zmianie w przypadku trudniejszych próbek.

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek: od próbki do struktury

Tutaj prezentujemy protokół do zoptymalizowanej korelacyjnej mikroskopii świetlno-elektronowej opartej na endogennym, fluorescencyjnym znakowaniu jako narzędzie do badania lokalizacji rzadkich białek w odniesieniu do ultrastruktury komórkowej. O sile tego podejścia świadczy ultrastrukturalna lokalizacja endogennego LC3 w wygłodzonych komórkach bez leczenia bafilomycyną.

Ultrastrukturalna lokalizacja endogennego LC3 za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlno-elektronowej na przekroju

Protokół krok po kroku do wytwarzania siatek powinowactwa streptawidyny jest dostępny do wykorzystania w badaniach strukturalnych trudnych próbek makromolekularnych za pomocą mikroskopii krioelektronowej.

Wytwarzanie siatki powinowactwa do streptawidyny do przygotowania próbek z mikroskopii krioelektronowej

Ten protokół przedstawia praktyczną metodę wykorzystującą Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) jako przykład rozwiązania problemu nierównomiernego rozkładu cząstek poprzez optymalizację przygotowania próbki, stanowiąc punkt odniesienia dla badaczy do efektywnego wyjaśniania struktur makromolekularnych za pomocą kriogenicznej mikroskopii elektronowej (cryo-EM).

Optymalizacja przygotowania próbek do kriogenicznej mikroskopii elektronowej

Poznaj metodę wizualizacji białek za pomocą ujemnego barwienia w mikroskopii elektronowej. Protokół obejmuje przygotowanie siatek EM, nakładanie próbek i akwizycję obrazów. Technika ta umożliwia rutynową analizę strukturalną makromolekuł.

Wizualizacja białek i kompleksów makromolekularnych za pomocą barwienia ujemnego EM: od przygotowania siatki do akwizycji obrazu (Wideo) | JoVE Journal

Wizualizacja białek i kompleksów makromolekularnych za pomocą EM z barwieniem negatywowym: od przygotowania siatki do akwizycji obrazów

Przeglądaj więcej filmów