Obrazowanie dynamiki wapnia w komórkach rzęsatych linii bocznej larw danio pręgowanego

Weźmy sparaliżowaną transgeniczną larwę danio pręgowanego zamontowaną w komorze perfuzyjnej.

Larwa wykazuje ekspresję zlokalizowanych w błonie wskaźników wapnia w komórkach rzęsatych neuromastu, składnika systemu linii bocznej, który wykrywa ruch wody.

Komórki rzęsate składają się z wierzchołkowych wiązek włosów i podstawowych regionów presynaptycznych, które tworzą synapsy z neuronami doprowadzającymi do przekazywania sygnałów.

Pod mikroskopem konfokalnym użyj małego powiększenia, aby umieścić pipetę strumieniową płynu w pobliżu larwy.

Zwiększ powiększenie, aby zlokalizować neuromast, umieść pipetę w pobliżu niego i przełącz się na

obrazowanie fluorescencyjne.

Dostarczają impulsy płynu, aby odchylić wiązki włosów, otwierając kanały mechanotransdukcji dla napływu kationów wierzchołkowych, w tym jonów wapnia.

Słabo fluorescencyjne wskaźniki wiążą się z wapniem, powodując miejscowy wzrost fluorescencji.

Napływ kationów depolaryzuje komórkę, wyzwalając wnikanie wapnia przez kanały bramkowane napięciem w podstawowej presynapsie, gdzie wiąże się ze wskaźnikami i lokalnie zwiększa fluorescencję.

Wizualizacja wierzchołkowej i podstawowej dynamiki wapnia w czasie rzeczywistym.

W tej procedurze należy wypełnić 10 mikrolitrów buforu neuronalnego do prawidłowo uszkodzonej igły do strumienia płynu za pomocą końcówki ładującej żel. Załaduj roztwór równomiernie do końcówki bez pęcherzyków. Następnie włóż igłę do uchwytu na pipety dołączonego do zmotoryzowanego mikromanipulatora.

Umieść komorę perfuzyjną w okrągłym adapterze komory na stoliku mikroskopu. Przesuń etap zmotoryzowany tak, aby larwa znajdowała się w środku pola widzenia. Następnie obróć adapter okrągłej komory tak, aby oś AP larwy była z grubsza wyrównana z trajektorią igły strumienia płynu.

Korzystając ze światła przechodzącego i różnicowego kontrastu interferencyjnego, ustaw ostrość larwy i wyśrodkuj ją pod obiektywem 10x. Następnie podnieś obiektyw 10x. Za pomocą zmotoryzowanego mikromanipulatora sprowadź igłę strumienia płynu w dół do środka pola widzenia, tak aby była oświetlona przez przepuszczane światło i ledwo dotykała bufora neuronalnego.

Obniż obiektyw 10x, aby skupić się na larwie i potwierdzić jej lokalizację. Skoncentruj obiektyw na igle do strumienia płynu. Przesuwaj igłę do strumienia płynu za pomocą mikromanipulatora w osiach x i y, aż znajdzie się w pozycji równoległej do grzbietowej strony larwy.

Następnie skup się z powrotem na larwie. Sprowadź igłę w dół w osi z i umieść igłę wzdłuż grzbietowej strony ryby, w odległości 1 milimetra od ciała. Ostrożnie przesuń adapter okrągłej komory, aby upewnić się, że igła strumienia płynu jest wyrównana wzdłuż linii środkowej AP larwy.

Następnie przełącz się na obiektyw wodny 60x. Upewnij się, że cel jest zanurzony w buforze neuronalnym. Użyj precyzyjnego ogniskowania, aby zlokalizować neuromast. Następnie przesuń zmotoryzowany stolik, aby umieścić interesujący nas neuromaszt w środku pola widzenia.

Trzymaj końcówkę igły z płynem wzdłuż grzbietowej strony ryby. Nie dotykać końcówki igły strumienia płynu do larwy lub powierzchni komory. Ustawić igłę strumienia płynu z mikromanipulatorem tak, aby znajdowała się 100 mikrometrów od zewnętrznej krawędzi neuromastu.

Następnie skup się na końcach wierzchołkowych wiązek włosów. Dolna część igły strumienia płynu powinna być zogniskowana w tej płaszczyźnie. Ustaw zacisk wysokiego ciśnienia z trybu ręcznego na tryb zewnętrzny, aby otrzymywać dane wejściowe z oprogramowania do obrazowania. Wyzeruj ciśnienie o dużej prędkości clamp, naciskając przycisk zera i użyj pokrętła wartości zadanej, aby ustawić ciśnienie spoczynkowe lekko dodatnie. Potwierdź spoczynkową moc wyjściową szybkoobrotowego zacisku ciśnieniowego za pomocą manometru PSI podłączonego do wyjścia stopnia głównego.

Aby określić ciśnienie potrzebne do stymulacji wiązek włosów, zastosuj bodziec testowy o napięciu wyjściowym 0,125 i 0,25 V przez 200 do 500 milisekund. Dla każdego bodźca testowego zmierz odległość ugięcia końcówek wiązek włosów (kinocilia). Wybierz ciśnienie, które przesuwa wiązki na odległość około 5 mikrometrów. Upewnij się, że końcówki kinocilii pozostają ostre przez cały czas.

Aby uzyskać obrazy pojedynczej płaszczyzny, wybierz bodziec, który ma być dostarczony podczas akwizycji 80 klatek po klatce 30 po trzech sekundach. Aby zmierzyć mechanowrażliwe reakcje wapnia, skup się na podstawie wierzchołkowych wiązek włosów i rozpocznij akwizycję obrazu. Aby zmierzyć presynaptyczną odpowiedź wapnia, skup się na podstawie komórek rzęsatych i rozpocznij akwizycję obrazu.