Spontaniczne obrazowanie wapnia dla dynamiki specyficznej dla przedziałów w astrocytach

Weź pokryte polimerem szkiełko nakrywkowe zawierające mieszaną kulturę neuronów i astrocytów w komorze rejestracyjnej.

Te transfekowane komórki wyrażają wrażliwe na wapń białka na błonach osocza i ER, fluoryzując po związaniu wapnia w celu śledzenia subkomórkowej dynamiki wapnia.

Dodaj pożywkę zawierającą jony wapnia i przykryj komorę, aby zapobiec parowaniu.

Umieść komorę pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Jony wapnia wiążą się z białkami wrażliwymi na wapń. Po naświetleniu niebieskim światłem wrażliwe na wapń białka na zewnętrznej błonie ER fluoryzują na zielono. Użyj tej zielonej fluorescencji, aby zlokalizować astrocyty.

Następnie naświetlić zielonym światłem. Wrażliwe na wapń białka na błonie plazmatycznej fluoryzują na czerwono. Potwierdź obecność czerwonej fluorescencji w tym samym astrocytach wykazujących zieloną fluorescencję.

Rejestruj obrazy poklatkowe wrażliwych na wapń białek na błonie plazmatycznej, a następnie wrażliwych na wapń białek na zewnętrznej błonie ER.

Przeanalizuj obrazy, aby zaobserwować specyficzną dla przedziałów spontaniczną aktywność wapnia w wybranym astrocytach.

Zamontuj szkiełko nakrywkowe zawierające komórki transfekowane Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f w komorze zapisu mikroskopu. Dodać 400 mikrolitrów pożywki do obrazowania i przykryć pokrywką komorę. Wybierz zestaw filtrów dla GCaMP6f i źródła światła. Zlokalizuj astrocyty wykazujące ekspresję OER-GCaMP6f.

Następnie wybierz zestaw filtrów i źródło światła dla RCaMP2. I potwierdź, czy Lck-RCaMP2 ulega ekspresji w tych samych astrocytach. Nagrywaj obrazy poklatkowe Lck-RCaMP2 z częstotliwością 2 Hz przez dwie minuty i zapisuj dane obrazowania.

Następnie zmień filtr z powrotem na filtr dla GCaMP6f. Nagrywaj obrazy poklatkowe OER-GCaMP6f z częstotliwością 2 Hz przez dwie minuty. Następnie zapisz dane obrazowania.