Efektywne wyprowadzanie ludzkich progenitorów neuronalnych i neuronów z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z indukcją małych cząsteczek

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest uzyskanie potomstwa neuronów bezpośrednio i wyłącznie z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą indukcji małych cząsteczek. Osiąga się to poprzez dodanie kwasu rettinowego do niezróżnicowanych komórek utrzymywanych w określonych warunkach. Następnie proces różnicowania jest kontynuowany poprzez odłączenie komórek w kulturze zawiesinowej, gdzie tworzą pływające klastry komórkowe zwane neuroblastami.

Jeśli neuroblasty mogą przyczepić się do płytki hodowli tkankowej w pożywce do różnicowania nerwowego, rozwijają cechy dojrzałych neuronów. Ostatecznie immunofluorescencja i dekonwolucja lub mikroskopia konfokalna mogą być wykorzystane do pokazania wpływu leczenia kwasem rettinowym na morfologię i ekspresję markerów leczonych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. W innych technikach tylko niewielka część komórek dąży do fenotypu neuronalnego, podczas gdy nasza metoda pozwala na dobrze kontrolowaną, efektywną indukcję pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych wyłącznie w kierunku linii neuronalnej Poprzez proste dostarczanie małych cząsteczek.

Jest kilka kroków, na które należy uważać podczas naprawy roztworów podstawowych. Uważaj, aby powoli rozmrażać matrygel i ludzką lamininę od minus 80 stopni Celsjusza do czterech stopni Celsjusza przez noc, przechowuj media w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zawsze podgrzewaj podłoże do 37 stopni Celsjusza przed użyciem. Ponadto, podczas przygotowywania pożywek dla ludzi, niektóre suplementy są dodawane tuż przed ich użyciem.

Należą do nich BFGF, kwas askorbinowy, insulina ludzka aktywna w A i przenosząca. Następnie przygotuj żel matra lub roztwory robocze ludzkiej lamininy bezpośrednio przed powlekaniem płytki. Inkubować płytki w temperaturze 37 stopni SIU w 5% dwutlenku węgla Po wstępnie pokrytych żelatyną płytkach do hodowli tkankowych przygotowuje się płytki.

Żelatynę można zastąpić roztworem roboczym matrigelu lub lamininy. Pokryj te płytki, inkubując je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zacznij od pozwolenia ludzkim koloniom komórek ES na wzrost przez pięć do siedmiu dni, a następnie przygotuj się do podziału.

Niektóre z nich Wybierz kolonie z ponad 75%W zróżnicowanych ludzkich komórkach ES są one zwykle lekko nieprzezroczyste z określonymi krawędziami kolonie zawierające spiętrzone komórki. Oznaką początku różnicowania zwykle wydają się być białe kolonie zawierające głównie zróżnicowane komórki, które zwykle wydają się być czyste. Nie wybieraj białych lub przezroczystych kolonii.

Trzymaj płytki pod światło i za pomocą markera obrysuj lekko nieprzezroczyste kolonie na spodzie płytek wzdłuż konturów. Użyj krawędzi sterylnej końcówki pipety P z dwiema pipetami, aby odłączyć otaczającą warstwę fibroblastów od kolonii ludzkich komórek ES. Następnie usuń otaczające komórki fibroblastów, a także usuń wszystkie zróżnicowane części kolonii.

Teraz odessaj stare pożywki zawierające oderwane zróżnicowane komórki. Następnie w każdej studzience przemyć niezróżnicowane komórki raz ludzkim pożywką z komórek E es pozbawioną BFGF, a następnie dodać trzy mililitry świeżej ludzkiej pożywki ESL zawierającej B-F-G-F-F-G-F dodawane do świeżej pożywki bezpośrednio przed użyciem. Teraz użyj sterylnej końcówki pipety P z dwiema pipetami, aby pokroić kolonie na małe kawałki i oderwać je od płytki.

Wyciągnij oderwane kawałki kolonii w ich pożywce do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Wyciągnij dodatkowy. Mililitr płukania podłoża na studzienkę.

Komórki są teraz gotowe do dalszego różnicowania przy użyciu małych cząsteczek. Zacznij od podgrzania świeżo pokrytych talerzy do 37 stopni Celsjusza. Odessać roztwór powlekający z płytek i dodać do każdej studzienki czteromililitrową porcję pożywki zawierającej kawałki kolonii, a następnie delikatnie przenieść płytki do inkubatora, nie potrząsając nimi.

Nie naruszaj talerzy, aby mogły się wysiewać. Po wysiewie przez trzy dni należy wykonać nowe podłoża zawierające kwas ominowy. Następnie usuń większość starych nośników, pozostawiając tylko tyle nośników, aby komórki pozostały zanurzone.

Nigdy nie należy dopuścić do wyschnięcia komórek do każdej z nich. Cóż, dodaj cztery mililitry świeżej pożywki dla ludzkich komórek ES z BFGF i retinokacidem. Wymieniaj pożywkę co drugi dzień i pozwól na wzrost kolonii ludzkich komórek ES traktowanych kwasem rettinowym.

Po siedmiu lub ośmiu dniach komórki ulegną zmianom morfologicznym w duże, zróżnicowane komórki. Następnie przystąp do wykonywania hodowli komórek zawiesinowych, aby uzyskać hodowlę zawiesiny, zacznij od odłączenia kolonii ESL od komórek, które spontanicznie się różnicowały i migrowały, tworząc warstwę fibroblastów. Użyj wyżej wymienionej techniki ze sterylną końcówką pipety, a następnie odessaj stare podłoże zawierające pływające oderwane komórki fibroblastów.

Umyj ogniwa raz pożywką HESC i ponownie zawieś je w trzech mililitrach pożywki HESC. Teraz za pomocą sterylnej końcówki do pipet P z dwiema pipetami. Pokrój kolonie na małe kawałki i oderwij je od talerza.

Przeciągnij pożywkę z oderwanymi koloniami do pojedynczej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Przepłucz studzienki jednym mililitrem pożywki i dodaj płukanie do basenu. Następnie podnieś cztery mililitry połączonych komórek do każdej studzienki sześciodołkowej płytki o bardzo niskim przyłączeniu przez cztery do pięciu dni, trzymaj płytkę w inkubatorze.

W tym czasie utworzą się pływające klastry komórkowe lub neuroblast, aby dalej rozwijać neuroblast do bardziej dojrzałego fenotypu neuronalnego. Wyciągnij zawierające je podłoże do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Następnie odwirować komórki z prędkością 1 400 obr./min przez pięć minut.

Aspirować, zważyć jak najwięcej starych pożywek i dodać równą ilość świeżych pożywek NSC zawierających VEGF N NT three i BDNF. Wymieszać komórki z zawiesiną przez pipetowanie, a następnie podzielić cztery mililitry zawiesiny na dołek do sześciu. Cóż, płytki do hodowli tkankowych przenoszą płytki do inkubatora z wilgotnością 37 stopni Celsjusza.

Neuroblast przyczepi się do płytek hodowlanych na noc w celu przeprowadzenia hodowli 3D w Matrigel lub ludzkiego laminatu do zawiesiny neuroblastów. A matryca 3D będzie polimeryzować w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wymieniaj nośniki co drugi dzień.

W ciągu dwóch tygodni pojawią się rozległe sieci komórek nerwowych zawierających neuryty i komórek barwnikowych, które staną się wystarczające do wywołania ludzkich komórek ES utrzymywanych w określonym systemie hodowli do przejścia z pluripotencji wyłącznie do fenotypu neuro-naskórkowego. Po wystawieniu niezróżnicowanych ludzkich komórek E es na działanie kwasu retinowego, wszystkie komórki w kolonii uległy zmianom morfologicznym w duże zróżnicowane komórki, które przestały wyrażać związany z pluripotencją marker OCT cztery. Komórki zaczęły również wyrażać różne markery związane z neuroektodermą, takie jak HNK jeden a, P dwa i TRKC.

Te duże, zróżnicowane komórki nadal się namnażały, a kolonie zwiększały swoją wielkość, spontanicznie wyrażając wczesny marker neuronalny beta trzy tubulinę. Bardziej dojrzała mapa markerów neuronalnych nr dwa zaczęła pojawiać się w obszarach kolonii, w których nagromadziły się komórki. Przypadkowo, wraz z pojawieniem się komórek neuroektodermalnych, specyficzny dla neuronów czynnik transkrypcyjny NER one brał udział w dopaminergicznym różnicowaniu neuronów i aktywacji genu hydroksylazy tyrozynowej translokowanego do jądra.

Po oderwaniu, ludzkie komórki ES traktowane kwasem rettinowym utworzyły neuroblast w hodowli zawiesinowej po usunięciu zasadowego FGF i po umożliwieniu neuroblastowi przyłączenia się do płytki hodowli tkankowej, rozległe sieci neurytów zawierających komórki neuronalne i komórki barwnikowe, typowe dla OUN, zaczęły pojawiać się z drastycznym wzrostem wydajności i mogły być hodowane przez trzy miesiące. Te ludzkie komórki neuronalne pochodzące z komórek ES wykazywały ekspresję tubuliny beta trzy w porównaniu ze spontanicznym różnicowaniem komórek wieloliniowych bez leczenia kwasem rettinowym i koeksprymowaną mapą drugą Po opanowaniu. Technika ta może być wykorzystana do jednorodnego generowania progenitorów neuronalnych w komórkach nerwowych z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w ciągu około czterech tygodni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Nie zapominaj, że praca z ludzkimi komórkami może być niezwykle niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak upewnienie się, że linie komórkowe są wolne od patogenów i mykoplazmy, powinny być zawsze podejmowane przed wykonaniem tej procedury.