Name: Efektywne pozyskiwanie ludzkich prekursorów serca i kardiomiocytów z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z indukcją małych cząsteczek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Poznaj metodę indukcji kardioblastów z ludzkich komórek macierzystych ES za pomocą nikotynamidu. Protokół umożliwia efektywne uzyskiwanie prekursorów serca i funkcjonalnych kardiomiocytów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

XHP otrzymał wsparcie z grantów National Institute of Health (NIH) przyznanych przez National Institute on Aging (NIHK01AG024496) oraz The Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NIHR21HD056530).

1. Przygotowanie roztworów i pożywek
<ol>
	<li>Roztwór do powlekania żelatyną: 0,1% (w/v) żelatyny w ddH2O, autoklawowany i przechowywany w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Roztwory do powlekania Matrigelem. Roztwór stokowy: powolne rozmrażanie Matrigelu (10 ml) w temperaturze 4°C przez noc, dodanie 10 ml schłodzonego do temperatury lodu DMEM lub DMEM/F12, dokładne wymieszanie i rozdzielenie na aliquoty po 1 ml/probówkę pod sterylnym dygestorium do hodowli tkankowych, przechowywanie w temperaturze -20°C. Roztwór roboczy: powolne rozmrażanie aliquoty 1 ml Matrigelu w temperaturze 4°C przez 1-2 godziny, przeniesienie do 14 ml schłodzonego DMEM lub DMEM/F12 i dokładne wymieszanie pod sterylnym dygestorium do hodowli tkankowych bezpośrednio przed powlekaniem.</li>
	<li>Roztwór do powlekania ludzką lamininą: rozcieńczenie 1 ml roztworu ludzkiej lamininy (0,5 mg/ml w buforze Tris NaCl, przechowywanym w temperaturze -80°C, powolne rozmrażanie w temperaturze 4°C przez 1-2 godziny) schłodzonym do temperatury lodu DMEM lub DMEM/F12 do uzyskania 12,5 ml roztworu roboczego (40 μg/ml) pod sterylnym dygestorium do hodowli tkankowych bezpośrednio przed powlekaniem.</li>
	<li>Roztwory stokowe czynników wzrostu (50-100X): rozpuszczenie czynnika wzrostu w stężeniu 10 μg/ml w sterylnym buforze (0,5% BSA, 1,0 mM DTT, 10% glicerolu, 1XPBS) i przechowywanie w aliquotach 50-10 μl/probówkę w temperaturze -80°C.</li>
	<li>Pożywka HESC: DMEM/F12 lub KO-DMEM (80%), zamiennik surowicy KO (20%), L-alanylo-L-glutamina lub L-glutamina (2 mM), nieessentialne aminokwasy MEM (MNAA, 1X) oraz β-merkaptoetanol (10 μM), przefiltrowana i przechowywana w temperaturze 4°C, suplementowana bFGF w stężeniu 20 ng/ml przed użyciem. Alternatywnie, po zastąpieniu „zamiennika surowicy KO” składnikami zdefiniowanymi: DMEM/F12 lub KO-DMEM (10%), L-alanylo-L-glutamina lub L-glutamina (2 mM), MNAA (1X), niezbędne aminokwasy MEM (MEAA, 1X) oraz β-merkaptoetanol (10 μM), przefiltrowana i przechowywana w temperaturze 4°C, suplementowana przed użyciem bFGF (20 ng/ml), ludzką insuliną (20 μg/ml), kwasem askorbinowym (50 μg/ml), ludzką aktywiną A (50 ng/ml), ludzką albuminą/Albumaxem (10 mg/ml) oraz ludzką transferryną (8 μg/ml).</li>
	<li>Pożywka do różnicowania kardiologicznego HESC: DMEM/F12 (90%), zdefiniowane FBS (10%) oraz L-alanylo-L-glutamina lub L-glutamina (2 mM).</li>
	<li>Pożywka zawierająca nikotynamid (NAM): dodanie NAM do pożywki HESC lub pożywki do różnicowania kardiologicznego HESC do końcowego stężenia 10 mM, przefiltrowanie, przechowywanie w temperaturze 4°C i zużycie w ciągu 2 tygodni od przygotowania.</li>
</ol>
2. Powlekanie płytek
<ol>
	<li>Powlekanie płytek żelatyną: do płytek 6-dołkowych dodać 2,5 ml/dołek roztworu żelatyny i inkubować przez noc w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37°C.</li>
	<li>Powlekanie płytek lamininą: schłodzić płytki powleczone żelatyną i usunąć żelatynę, następnie do schłodzonych, żelatynizowanych płytek 6-dołkowych dodać 2,5 ml/dołek roboczego roztworu do powlekania Matrigel lub ludzką lamininą i inkubować przez noc w temperaturze 4°C.</li>
</ol>
3. Pasażowanie i wysiewanie niezróżnicowanych hESC w warunkach zdefiniowanych
<ol>
	<li>Pozostaw kolonie hESC do wzrostu przez 5-7 dni, a następnie przenieś płytkę z hodowlą hESC pod mikroskop stereowy (podgrzej stoлик mikroskopu do 37°C) wewnątrz sterylnego komina laminarnego.</li>
	<li>Wybierz kolonie hESC do rozdzielenia. Pod względem morfologicznym kolonie te powinny zawierać &gt; 75% niezróżnicowanych hESC (małe, zwarte komórki), zazwyczaj lekko nieprzezroczyste (bez białych skupisk komórek, bez przezroczystych komórek zróżnicowanych) z wyraźną krawędzią widoczną pod mikroskopem stereowym. Starannie obrysuj wybrane kolonie i usuń otaczającą je warstwę zróżnicowanych fibroblastów oraz wszelkie zróżnicowane części kolonii (jeśli występują), używając krawędzi sterylnej końcówki pipety P2 lub wyciągniętej kapilary szklanej.</li>
	<li>Usuń starą pożywkę zawierającą pływające, odspojone komórki zróżnicowane poprzez aspirację. Przemyj raz pożywką hESC (bez bFGF). Dodaj 3 ml/dołek świeżej pożywki hESC zawierającej 20 ng/ml bFGF.</li>
	<li>Podziel niezróżnicowane kolonie hESC na małe fragmenty i odspój je za pomocą sterylnej końcówki pipety lub wyciągniętej kapilary szklanej.</li>
	<li>Zbierz pożywkę zawierającą odspojone fragmenty kolonii do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Przemyj płytkę raz, używając 1 ml/dołek pożywki hESC zawierającej 20 ng/ml bFGF, i połącz z pozostałym materiałem.</li>
	<li>Odsuń aspiracją roztwór Matrigelu lub lamininy ludzkiej z nowo przygotowanych, pokrytych płyt. Przenieś 4 ml/dołek pożywki hESC zawierającej fragmenty kolonii do płytki 6-dołkowej. Ostrożnie przenieś płytkę do inkubatora, unikając wstrząsania, i pozostaw fragmenty kolonii do przylegnięcia na noc w wilgotnym inkubatorze przy 37°C i atmosferze 5% CO2.</li>
</ol>
4. Indukcja kardiogenna hESC w zdefiniowanym systemie hodowlanym z nikotynamidem
<ol>
	<li>W 3. dniu po wysianiu usunąć większość starej pożywki z każdej studzienki płytki, pozostawiając ilość wystarczającą do zanurzenia kolonii hESC (nigdy nie dopuszczać do wyschnięcia hESC). Zastąpić ją 4 ml/well świeżej pożywki hESC zawierającej 20 ng/ml bFGF oraz 10 mM nikotynamidu (NAM).</li>
	<li>Wymieniać starą pożywkę na świeżą pożywkę hESC zawierającą 20 ng/ml bFGF i 10 mM NAM co drugi dzień, pozwalając na wzrost kolonii hESC indukowanych w kierunku kardiogenicznym do 8–10. dnia. Po wystawieniu na działanie NAM wszystkie komórki w kolonii przejdą zmiany morfologiczne w duże komórki zróżnicowane, które będą nadal się mnożyć. Kolonie zwiększą swój rozmiar, a w 8–10. dniu komórki zaczną spiętrzać się w niektórych obszarach kolonii.</li>
</ol>
5. Kontynuacja różnicowania kardiomiocytów w hodowli zawiesinowej
<ol>
	<li>Przenieś płytkę z hodowlą hESC pod sterylny dygestorium do mikroskopu stereoskopowego (wstępnie podgrzej stół mikroskopu do 37°C). Starannie obrysuj kolonie i usuń warstwę fibroblastów otaczającą kolonię (zróżnicowane komórki, które wywędrowały z kolonii), używając krawędzi sterylnego tipsa P2 lub wyciągniętej kapilary szklanej.</li>
	<li>Usuń starą pożywkę zawierającą pływające, oderwane komórki fibroblastów poprzez aspirację. Przepłucz raz pożywką hESC (bez bFGF). Dodaj 3 ml/studzienkę świeżej pożywki hESC (bez bFGF).</li>
	<li>Podziel kolonie hESC indukowane w kierunku kardiomiocytów na małe fragmenty i oddziel je za pomocą sterylnego tipsa lub wyciągniętej kapilary szklanej.</li>
	<li>Zbierz pożywkę zawierającą oderwane fragmenty kolonii do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Przepłucz płytkę raz, używając 1 ml/studzienkę pożywki hESC (bez bFGF), i połącz z pozostałym materiałem.</li>
	<li>Przenieś a laikwoty po 4 ml/studzienkę bezserumowej pożywki hESC zawierającej fragmenty kolonii na płytkę 6-dołkową o ultraniskim stopniu przylegania (ultralow attachment plate) i inkubuj w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37°C przez 4-5 dni, aby umożliwić formowanie się pływających skupisk komórkowych (kardioblastów).</li>
</ol>
6. Dojrzewanie fenotypu bijących kardiomiocytów w hodowli adhezyjnej
<ol>
	<li>Połączyć pożywki zawierające pływające kardioblasty w probówce stożkowej o pojemności 50 ml. Wirować przy 1400 rpm przez 5 min. Odessać jak najwięcej starej pożywki i dodać taką samą objętość świeżej pożywki do różnicowania kardiologicznego hESC zawierającej 10 mM NAM.</li>
	<li>Wymieszać pływające kardioblasty poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie nanieść po 4 ml/dołek na płytki 6-dołkowe. Przenieść płytki do inkubatora z wilgotnym powietrzem w temperaturze 37°C, aby umożliwić przyleganie kardioblastów przez noc.</li>
	<li>Wymieniać pożywkę do różnicowania kardiologicznego hESC zawierającą 10 mM NAM co drugi dzień.</li>
	<li>W 8. dniu zastąpić pożywkę pożywką do różnicowania kardiologicznego hESC bez NAM i kontynuować wymianę pożywki do różnicowania kardiologicznego hESC co drugi dzień. Bijące kardiomiocyty zaczną pojawiać się po około 1-2 tygodniach ciągłej hodowli po odstawieniu NAM; ich liczba będzie z czasem wzrastać, a komórki mogą zachować silne i rytmiczne skurcze przez ponad 3 miesiące.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki:
Nikotynamid (NAM) w odpowiednim stężeniu indukuje przejście ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESCs) utrzymywanych w zdefiniowanym systemie hodowlanym ze stanu pluripotencji wyłącznie w kierunku fenotypu kardiomezodermalnego (Ryc. 2B). Po wystawieniu niezróżnicowanych hESCs na NAM, wszystkie komórki w kolonii przechodzą zmiany morfologiczne w duże zróżnicowane komórki, które wykazują obniżoną ekspresję Oct-4 i zaczynają ekspresować specyficzny dla serca czynnik transkrypcyjny (Csx) Nkx2.5 oraz α-aktyninę, co jest zgodne z fenotypem kardiomezodermy (Ryc. 2B). Zróżnicowane komórki te nadal się mnożą, a kolonie zwiększają swój rozmiar. Zwiększoną intensywność Nkx2.5 obserwuje się zazwyczaj w obszarach kolonii, w których komórki zaczynają się spiętrzać (Ryc. 2B). Po odklejeniu, hESCs traktowane NAM tworzą pływające skupiska komórkowe (kardioblasty) w hodowli zawiesinowej, aby kontynuować proces różnicowania w kierunku tkanki serca. Po umożliwieniu przyczepienia się kardioblastów i kontynuowaniu traktowania NAM przez 1 tydzień, bijące kardiomiocyty zaczynają pojawiać się w ciągu około 1-2 tygodni ciągłej hodowli po wycofaniu NAM, z drastycznym wzrostem wydajności w porównaniu do spontanicznego różnicowania wieloliniowego hESCs bez traktowania w tym samym okresie czasu (Ryc. 2C). Komórki w skupiskach bijących kardiomiocytów będą wykazywać markery charakterystyczne dla kardiomiocytów, w tym Nkx2.5 i α-aktyninę (Ryc. 2C). Skurcze bijących kardiomiocytów zostały potwierdzone profilami elektrycznymi jako silne, rytmiczne, dobrze skoordynowane i zsynchronizowane, z regularnymi impulsami przypominającymi kompleksy p-QRS-T widoczne z elektrod powierzchniowych w klinicznych elektrokardiogramach (Ryc. 2C, patrz również w Video). Kardiomiocyty mogły zachować silną kurczliwość przez ponad 3 miesiące.
<img alt="Schemat różnicowania komórek pluripotencjalnych; metoda indukcji; proces rozwoju specyficzny dla danej linii komórkowej." src="/files/ftp_upload/3274/3274fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1Ogólne schematy podejścia konwencjonalnego w porównaniu z podejściem opartym na indukcji małymi cząsteczkami w celu różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w wyspecjalizowane komórki funkcjonalne. (A) Schemat konwencjonalnego podejścia wykorzystującego wieloliniowe różnicowanie ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych poprzez spontaniczną różnicowanie warstw zarodkowych. (B) Schemat kontrolowanej i wydajnej indukcji ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych wyłącznie w kierunku konkretnej, istotnej klinicznie linii komórkowej poprzez proste podanie cząsteczek sygnałowych.
<img alt="Proces różnicowania kardiogennego; barwienie Oct-4, Nkx2.5; wyniki skupisk kardiomiocytów; wykres osi czasu." src="/files/ftp_upload/3274/3274fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2. Nikotynamid indukuje bezpośrednią specyfikację linii sercowej z pluripotencji w określonych warunkach oraz progresję w kierunku bijących kardiomiocytów. (A) Schemat przedstawiający oś czasu protokołu ukierunkowanego różnicowania hESCs w kierunku kardiologicznym. (B) Po poddaniu nieróżnicujących się hESC działaniu nikotyniamidu (NAM) w zdefiniowanym systemie hodowlanym, w obrębie kolonii zaczęły pojawiać się duże różnicujące się komórki wykazujące brak ekspresji Oct-4 (czerwony), w porównaniu z kontrolnymi hESC poddanymi pozornej obróbce (DMSO). Komórki Oct-4-ujemne indukowane przez NAM zaczęły wykazywać ekspresję Nkx2.5 (zielony) oraz $\alpha$-aktyniny (czerwony), co jest zgodne z wczesną różnicą sercową. Stopniowy wzrost intensywności sygnału Nkx2.5 zazwyczaj obserwowano w obszarach kolonii, w których komórki zaczęły się spiętrzać. Wszystkie komórki są zaznaczone barwieniem ich jąder DAPI (niebieski). (C) hESC ukierunkowane na linię kardiologiczną pod wpływem NAM dały bijące kardiomiocyty z drastycznym wzrostem wydajności, co oceniono na podstawie skupisk komórkowych wykazujących rytmiczne skurcze (patrz profil elektrofizjologiczny i filmy) oraz immunoreaktywności w stosunku do Nkx2.5 (zielony) i α-aktyniny (czerwony). Przedstawiono obrazy fazokontrastowe reprezentatywnych dużych bijących skupisk kardiomiocytów oraz obrazy przy większym powiększeniu reprezentatywnych kurczących się mięśni sercowych (patrz również odpowiadające im filmy). Strzałki wskazują duże bijące skupisko kardiomiocytów wykorzystane do rejestracji elektrofizjologicznej. Profil elektrofizjologiczny bijących kardiomiocytów wykazuje regularne, zsynchronizowane, rytmiczne impulsy przypominające kompleksy p-QRS-T obserwowane w klinicznych elektrokardiogramach. Paski skali: 0,1 mm.
Filmy: Kurczące się kardiomiocyty zróżnicowane z hESC indukowanych NAM. Filmy 1 i 2 przedstawiają reprezentatywne duże, bijące skupiska kardiomiocytów około 1 i 3 miesiąca po przytwierdzeniu. Filmy 3 i 4 pokazują reprezentatywne kurczące się mięśnie serca przy większym powiększeniu. Film 5 przedstawia typowe małe, bijące skupisko kardiomiocytów, które zróżnicowało się spontanicznie z hESC bez zastosowania NAM w celu kontroli.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video1.avi">Kliknij tutaj, aby obejrzeć Wideo 1.</a> 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video2.avi">Kliknij tutaj, aby obejrzeć Wideo 2.</a> 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video3.avi">Kliknij tutaj, aby obejrzeć Wideo 3.</a> 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video4.avi">Kliknij tutaj, aby obejrzeć Wideo 4.</a> 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video5.avi">Kliknij tutaj, aby obejrzeć Wideo 5.</a>

<ol><li>Jawad, H., Ali, N. N., Lyon, A. R., Chen, Q. Z., Harding, S. E., Boccaccini, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+tissue+engineering%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue.+Eng.+Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">Myocardial tissue engineering: a review.</a> J. Tissue. Eng. Regen. Med. 1, 327-342 (2007).</li>
<li>Passier, P., van Laake, L. W., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell-based+therapy+and+lessons+from+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem-cell-based therapy and lessons from the heart.</a> Nature. 453, 322-329 (2008).</li>
<li>Zhu, W. Z., Hauch, K. D., Xu, C., Laflamme, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+and+cardiac+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Rev%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells and cardiac repair.</a> Transplant Rev. 23, 53-68 (2009).</li>
<li>Parsons, X. H., Teng, Y. D., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Important+precautions+when+deriving+patient-specific+neural+elements+from+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Important precautions when deriving patient-specific neural elements from pluripotent cells.</a> Cytotherapy. 11, 815-824 (2009).</li>
<li>J, J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. , 282-1145 (1998).</li>
<li>Aubry, L., Bugi, A., Lefort, N., Rousseau, F., Peschanski, M., Perrier, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Striatal+progenitors+derived+from+human+ES+cells+mature+into+DARPP32+neurons+in+vitro+and+in+quinolinic+acid-lesioned+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 16707-16712 (2008).</li>
<li>Roy, N. S., Cleren, C., Singh, S. K., Yang, L., Beal, M. F., Goldman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+engraftment+of+human+ES+cell-derived+dopaminergic+neurons+enriched+by+coculture+with+telomerase-immortalized+midbrain+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes.</a> Nature Medicine. 12, 1259-1268 (2006).</li>
<li>Wernig, M., Zhao, J. P., Pruszak, J., Hedlund, E., Fu, D., Soldner, F., Broccoli, V., Constantine-Paton, M., Isacson, O., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+derived+from+reprogrammed+fibroblasts+functionally+integrate+into+the+fetal+brain+and+improve+symptoms+of+rats+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Neurons derived from reprogrammed fibroblasts functionally integrate into the fetal brain and improve symptoms of rats with Parkinson's disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5856-5861 (2008).</li>
<li>Richards, M., Fong, C., Chan, W., Wong, P., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+feeders+support+prolonged+undifferentiated+growth+of+human+inner+cell+masses+and+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells.</a> Nature. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).</li>
<li>Xu, C., Inokuma, M. S., Denham, J., Golds, K., Kundu, P., Gold, J. D., Carpenter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li>
<li>Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+FGF+and+suppression+of+BMP+signaling+sustain+undifferentiated+proliferation+of+human+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells.</a> Nature Methods. 2, 185-190 (2005).</li>
<li>Parsons, X. H., Teng, Y. D., Moore, D. A., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patents+on+technologies+of+human+tissue+and+organ+regeneration+from+pluripotent+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Patents+on+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patents on technologies of human tissue and organ regeneration from pluripotent human embryonic stem cells.</a> Recent Patents on Regenerative Medicine. 1, 142-163 (2011).</li>
<li>Kehat, I., Khimovich, L., Caspi, O., Gepstein, A., Shofti, R., Arbel, G., Huber, I., Satin, J., Itskovitz-Eldor, J., Gepstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electromechanical+integration+of+cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Electromechanical integration of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1282-1289 (2004).</li>
<li>Laflamme, M. A., Chen, K. Y., Naumova, A. V., Muskheli, V., Fugate, J. A., Dupras, S. K., Reinecke, H., Xu, C., Hassanipour, M., Police, S., O'Sullivan, C., Collins, L., Chen, Y., Minami, E., Gill, E. A., Ueno, S., Yuan, C., Gold, J., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells+in+pro-survival+factors+enhance+function+of+infracted+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infracted rat hearts.</a> Nat. Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).</li>
<li>Caspi, O., Huber, I., Kehat, I., Habib, M., Arbel, G., Gepstein, A., Yankelson, L., Aronson, D., Beyar, R., Gepstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+improves+myocardial+performance+in+infarcted+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Transplantation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes improves myocardial performance in infarcted rat hearts.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 50, 1884-1893 (2007).</li>
<li>Akazawa, H., Komuro, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+transcription+factor+Csx%2FNkx2-5%3A+Its+role+in+cardiac+development+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Cardiac transcription factor Csx/Nkx2-5: Its role in cardiac development and diseases.</a> Pharmacol. Ther. 107, 252-268 (2005).</li>
<li>Leda, M., Fu, J. D., Delgado-Olguin, P., Vedantham, V., Hayashi, Y., Bruneau, B. G., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142, 375-386 (2010).</li>
<li>Efe, J. A., Hilcove, S., Kim, J., Zhou, H., Ouyang, K., Wang, G., Chen, J., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+mouse+fibroblasts+into+cardiomyocytes+using+a+direct+reprogramming+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Conversion of mouse fibroblasts into cardiomyocytes using a direct reprogramming strategy.</a> Nat. Cell. Biol. 13, 215-222 (2011).</li>
<li>Kim, K., Doi, A., Wen, B., Ng, K., Zhao, R., Cahan, P., Kim, J., Aryee, M. J., Ji, H., Ehrlich, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467, 285-290 (2010).</li>
<li>Gore, A., Li, Z., Fung, H. L., Young, J. E., Agarwal, S., Antosiewicz-Bourget, J., Canto, I., Giorgetti, A., Israel, M. A., Kiskinis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+coding+mutations+in+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Somatic coding mutations in human induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 471, 63-67 (2011).</li>
<li>Feng, Q., Lu, S. J., Klimanskaya, I., Gomes, I., Kim, D., Chung, Y., Honig, G. R., Kim, K. S., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemangioblastic+derivatives+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+exhibit+limited+expansion+and+early+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Hemangioblastic derivatives from human induced pluripotent stem cells exhibit limited expansion and early senescence.</a> Stem Cells. 28, 704-712 (2010).</li>
<li>Klimanskaya, I., Chung, Y., Becker, S., Lu, S. -J., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+from+single+blastomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Derivation of human embryonic stem cells from single blastomeres.</a> Nat. Protocols. 2, 1963-1972 (2007).</li>
<li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li>
</ol>

Autorzy deklarują konflikt interesów. XHP jest założycielem firmy Xcelthera. XHP i EYS posiadają prawa własności intelektualnej związane z hESC.

Jednym z głównych wyzwań zarówno dla badań rozwojowych, jak i translacji klinicznej było znalezienie sposobu, aby efektywnie i przewidywalnie nakierować szeroki potencjał różnicowania pluripotencjalnych ludzkich komórek macierzystych na pożądany fenotyp. Chociaż komórki te mogą różnicować się spontanicznie in vitro w komórki wszystkich trzech listków zarodkowych, przechodząc przez etap agregatów wieloliniowych, w agregatach wieloliniowych pochodzących z hESC (ciałach zarodkowych) tylko bardzo mała frakcja komórek (&lt;2%) różnicuje się spontanicznie w kardiomiocyty13-15 (Ryc. 1A). Po immunoselekcji wzbogacone populacje kardiomiocytów były w stanie pełnić funkcję biologicznych rozruszników serca, przywracając funkcję uszkodzonego mięśnia sercowego mechanicznie i elektronicznie po wstrzyknięciu do serca modeli zwierzęcych13. W modelach niedokrwiennych u gryzoni wszczepione progenitory sercowe pochodzące z hESC były w stanie przeżyć i dojrzewać do 12 tygodni, a także częściowo remuskularyzować uszkodzone serce i poprawić funkcję skurczową14,15. Jednakże niska wydajność generowania ludzkich komórek zdeterminowanych na linię sercową poprzez różnicowanie wieloliniowe komórek pluripotencjalnych oraz wysokie ryzyko tumorigeniczności po transplantacji utrudniały dalszą translację kliniczną. Opracowanie strategii pozwalających na wyłączne i przewidywalne nakierowanie szerokiego potencjału różnicowania pluripotencjalnych hESC na fenotyp sercowy jest kluczowe dla wykorzystania potencjału biologii hESC w obszarze serca. Aby osiągnąć jednolitą konwersję ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w konkretną linię, zastosowaliśmy zdefiniowany system hodowli zapewniający proliferację nieróżnicowanych hESC, aby zidentyfikować warunki dobrze kontrolowanej i wydajnej indukcji hESC wyłącznie w konkretną, istotną klinicznie linię poprzez proste podanie małych cząsteczek (Ryc 1B). Stwierdzono, że nikotynamid indukuje determinację linii sercowej bezpośrednio z pluripotencjalnych hESC w zdefiniowanej hodowli, co prowadzi do powstania bijących kardiomiocytów z wysoką wydajnością (Ryc. 2). Nkx2.5 jest ewolucyjnie konserwatywnym czynnikiem transkrypcyjnym homeoboksowym, niezbędnym do prawidłowego rozwoju serca, a mutacje w tym genie są związane z wrodzonymi wadami serca (CHD) u ludzi, które stanowią najczęstszą wadę wrodzoną16. Ekspresja Nkx2.5 jest najwcześniejszym markerem komórek prekursorowych serca u wszystkich dotychczas badanych kręgowców i jest niezbędna do prawidłowego przegrodzenia serca oraz formowania i dojrzewania układu przewodzącego16. U kręgowców początek i wzorzec wczesnej ekspresji Nkx2.5 mniej więcej pokrywają się z czasem i obszarem specyfikacji serca we wczesnej embriogenezie, a gen Nkx2.5 pozostaje eksponowany w sercu przez cały okres rozwoju16. W naszym modelu hESC NAM wydawał się wyzwalać indukcję sercową bezpośrednio z pluripotencjalnych hESC poprzez promowanie ekspresji specyficznego dla serca czynnika transkrypcyjnego Nkx2.5 w procesie, który może naśladować specyfikację kardiomezodermy z pluripotencjalnego epiblastu w ludzkiej embriogenezie serca. Przyszłe badania ujawnią genetyczne i epigenetyczne cząsteczki kontrolne w rozwoju ludzkiego serca jako alternatywy, co może utorować drogę do bezpośredniej kontroli i modulacji losu hESC za pomocą małych cząsteczek podczas wyprowadzania linii istotnych klinicznie dla terapii regeneracyjnych. Bez zastosowania NAM &lt; 2% hESC ulegnie spontanicznej różnicowaniu w bijące kardiomiocyty12-15. Dzięki zastosowaniu NAM byliśmy w stanie wygenerować &gt; 95% embrionalnych prekursorów serca i &gt; 50% bijących kardiomiocytów z hESC utrzymywanych w zdefiniowanej hodowli, w procesie, który może naśladować ludzki embrionalny rozwój serca12. Niedawno znane geny determinujące los serca zostały wykorzystane do transdyferencjacji fibroblastów mysich w postnatalne bijące kardiomiocyty z niską wydajnością wynoszącą &lt; 0,5%17, 18. Jednakże przeprogramowane komórki somatyczne były historycznie kojarzone z nieprawidłową ekspresją genów i przyspieszoną senescencją, co upośledzało ich użyteczność terapeutyczną19-21. Wreszcie, opracowany tutaj protokół ogranicza się do pluripotencjalnych hESC pochodzących z wewnętrznej masy komórkowej (ICM) lub epiblastu ludzkiego blastocysty4,5 i może nie mieć zastosowania do innych komórek pluripotencjalnych, w tym do ESC pochodzenia zwierzęcego, ESC pochodzących z wcześniejszego stadium moruli (osiem komórek)22 oraz komórek przeprogramowanych sztucznie23.

<table><tbody><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td>z obniżoną zawartością czynników wzrostu</td></tr><tr><td>Ludzka laminina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6274</td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>31053036</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-KO</td><td>Invitrogen</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>Zamiennik surowicy Knock-out</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>roztwór nieessentialnych aminokwasów MEM (MNAA, 100X)</td><td>Invitrogen</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>roztwór aminokwasów MEM (MEAA, 100X)</td><td>Invitrogen</td><td>11130050</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Albumax</td><td>Invitrogen</td><td>11020021</td><td></td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>Transferryna ludzka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8158</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki bFGF</td><td>PeproTech Inc</td><td>AF-100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Insulina ludzka</td><td>Invitrogen</td><td>12585014</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka aktywina A</td><td>PeproTech Inc</td><td>120-14E</td><td></td></tr><tr><td>Zdefiniowana surowica wołowia (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30073-03</td><td></td></tr><tr><td>płytka 6-dołkowa o ultraniskim przywieraniu</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>płytka 6-dołkowa</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr></tbody></table>

efektywne otrzymywanie prekursorów kardiologicznych i kardiomiocytów ludzkich z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukcji małocząsteczkowej

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Do tej pory brak odpowiedniego źródła ludzkich komórek serca stanowił główną przeszkodę w regeneracji ludzkiego mięśnia sercowego, zarówno poprzez transplantację komórkową, jak i inżynierię tkanki serca1-3. Kardiomiocyty ulegają terminalnemu różnicowaniu krótko po urodzeniu i tracą zdolność do proliferacji. Nie ma dowodów na to, że komórki macierzyste/progenitorowe pochodzące z innych źródeł, takich jak szpik kostny lub krew pępowinowa, są w stanie przekształcić się w kurczliwe komórki mięśnia sercowego po transplantacji do serca1-3. Potrzeba regeneracji lub naprawy uszkodzonego mięśnia sercowego nie została zaspokojona przez terapię dorosłymi komórkami macierzystymi, ani endogenną, ani poprzez dostarczanie komórek1-3. Genetycznie stabilne ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESCs) posiadają nieograniczoną zdolność do ekspansji i nieograniczoną plastyczność, stanowiąc pluripotencyjny rezerwuar dla pochodnych in vitro dużych ilości ludzkich komórek somatycznych, ograniczonych do linii wymagającej naprawy i regeneracji4,5. Ze względu na powszechność chorób sercowo-naczyniowych na całym świecie i ostry niedobór organów od dawców, istnieje ogromne zainteresowanie opracowaniem terapii opartych na hESCs jako alternatywnego podejścia. Jednakże to, jak efektywnie i przewidywalnie nakierować szeroki potencjał różnicowania pluripotencyjnych hESCs na pożądany fenotyp, stanowiło główne wyzwanie zarówno dla badań rozwojowych, jak i translacji klinicznej. Konwencjonalne podejścia opierają się na wieloliniowym skłanianiu komórek pluripotencyjnych poprzez spontaniczne różnicowanie warstw zarodkowych, co skutkuje nieefektywnym i niekontrolowanym określeniem linii, któremu często towarzyszy heterogeniczność i niestabilność fenotypowa, a co za tym idzie, wysokie ryzyko tumorigeniczności6-8 (patrz schemat na Ryc. 1A). Ponadto nieokreślone obce/zwierzęce suplementy biologiczne i/lub komórki karmne, które zazwyczaj stosowano do izolacji, ekspansji i różnicowania hESCs, mogą sprawić, że bezpośrednie zastosowanie takich specjalistycznych przeszczepów komórkowych u pacjentów będzie problematyczne9-11. Aby pokonać te przeszkody, opracowaliśmy elementy zdefiniowanego systemu hodowlanego, które są niezbędne i wystarczające do utrzymania pluripotencji epiblastu hESCs, służąc jako platforma do pochodnych de novo klinicznie odpowiednich hESCs i efektywnego, jednolitego kierowania takich hESCs w stronę klinicznie istotnych linii za pomocą małych cząsteczek12 (patrz schemat na Ryc. 1B). Po przesianiu różnorodnych małych cząsteczek i czynników wzrostu odkryliśmy, że w takich zdefiniowanych warunkach nikotynamid (NAM) był wystarczający do indukcji specyfikacji kardiomezodermy bezpośrednio z pluripotencyjnych hESCs, która następnie przekształciła się w kardioblasty, generujące ludzkie, bijące kardiomiocyty z wysoką wydajnością (Ryc. 2). Zdefiniowaliśmy warunki indukcji kardioblastów bezpośrednio z pluripotencyjnych hESCs bez pośredniego etapu wieloliniowego ciała embrionalnego, co umożliwia dobrze kontrolowane i wydajne pozyskiwanie dużych ilości ludzkich komórek serca na różnych etapach rozwojowych dla zastosowań w terapiach komórkowych.

Opracowaliśmy protokół indukcji kardioblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z użyciem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów serca oraz funkcjonalnych kardiomiocytów do regeneracji układu sercowo-naczyniowego.

Efektywne otrzymywanie prekursorów kardiologicznych i kardiomiocytów ludzkich z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukcji małocząsteczkowej

Do chwili obecnej brak odpowiedniego źródła ludzkich komórek serca stanowił główną przeszkodę w regeneracji ludzkiego mięśnia sercowego, zarówno w przypadku metod opartych na komórkach...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest bezpośrednie i wyłączne otrzymanie potomstwa kardiologicznego z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu indukcji małocząsteczkowej. Osiąga się to poprzez dodanie nikotynamidu do niezróżnicowanych ludzkich komórek ES utrzymywanych w określonych warunkach. Następnie komórki różnicujące się w kierunku kardiologicznym są odrywane w celu utworzenia kardioblastów, czyli pływających skupisk komórkowych w kulturze zawiesinowej.Po sformowaniu kardioblasty przenosi się do pożywki różnicowania kardiologicznego, w której rozwijają się dalej w bijące kardiomiocyty. Ostatecznie wyniki ocenia się za pomocą immunofluorescencji z zastosowaniem mikroskopii dekonwolucyjnej lub konfokalnej oraz za pomocą rejestracji elektrofizjologicznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na wydajną indukcję pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych wyłącznie w kierunku linii kardiologicznej poprzez proste dostarczenie małych cząsteczek.Podczas gdy w istniejących metodach różnicowania wieloliniowego jedynie niewielka frakcja komórek przyjmuje fenotyp kardiologiczny. Istnieje kilka kroków, na które należy zwrócić uwagę podczas przygotowywania roztworów stokowych. Należy pamiętać o powolnym rozmrażaniu matrigelu i ludzkiej lamininy z temperatury -80°C do 4°C przez noc; pożywki należy przechowywać w temperaturze 4°C i zawsze podgrzewać je do 37°C przed użyciem.Ponadto podczas przygotowywania pożywki dla ludzkich komórek ES niektóre suplementy dodaje się bezpośrednio przed użyciem. Należą do nich BFGF, kwas askorbinowy, aktywna insulina ludzka w A oraz transferyna. Następnie należy przygotować robocze roztwory matrigelu lub ludzkiej lamininy bezpośrednio przed powlekaniem płytek.Po przygotowaniu płytek do hodowli tkankowych pokrytych żelatyną, inkubuj je w temperaturze 37 °C w 5% CO2. Żelatynę można zastąpić roztworem roboczym Matrigelu lub lamininy. Płytki należy pokryć, inkubując je przez noc w temperaturze 4 °C.Należy rozpocząć od hodowli kolonii ludzkich komórek ES przez pięć do siedmiu dni, a następnie przygotować się do pasażowania wybranych z nich. Należy wybierać kolonie zawierające ponad 75% niezróżnicowanych ludzkich komórek ES. Zazwyczaj są one lekko mętne, z wyraźnie zarysowanymi krawędziami i zawierają piętrzące się komórki. Sygnałem rozpoczęcia różnicowania są zazwyczaj białe kolonie, natomiast kolonie zawierające głównie komórki zróżnicowane zazwyczaj wydają się przejrzyste.Nie wybieraj kolonii białych ani przeźroczystych. Podnieś płytki pod światło i za pomocą markera obrysuj na spodzie płytek lekko mętne kolonie wzdłuż ich krawędzi. Używając krawędzi sterylnego końcówki pipety P2, oddziel otaczającą warstwę fibroblastów od kolonii ludzkich komórek ES.Następnie usuń otaczające komórki fibroblastów, a także wszystkie zróżnicowane części kolonii. Teraz odessij starą pożywkę zawierającą oddzielone zróżnicowane komórki. Następnie w każdej studzience przemyj niezróżnicowane komórki raz pożywką dla ludzkich komórek ES pozbawioną BFGF, a następnie dodaj trzy mililitry świeżej pożywki dla ludzkich komórek ES zawierającej BFGF; BFGF dodaje się do świeżej pożywki bezpośrednio przed użyciem.Następnie za pomocą sterylnej końcówki pipety P2 podziel kolonie na małe fragmenty i oddziel je od płytki. Przenieś oddzielone fragmenty kolonii wraz z pożywką do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Płukanie każdego dołka wykonaj dodatkowo za pomocą 1 ml pożywki.Komórki są teraz gotowe do dalszej różnicowania przy użyciu małych cząsteczek. Należy rozpocząć od ogrzania świeżo powlekanych płytek do 37 °C. Odessać roztwór powlekający z płytek, a następnie do każdej studni dodać czteromililitrową porcję medium zawierającego fragmenty kolonii, po czym ostrożnie przenieść płytki do inkubatora, unikając ich wstrząsania.Nie należy poruszać płytek, aby umożliwić osiadanie komórek. Następnie należy usunąć większość starej pożywki, pozostawiając jej tyle, aby komórki pozostały zanurzone. Nie wolno dopuścić do wyschnięcia komórek.Wymieszać świeżą pożywkę ESL dla ludzi zawierającą podstawowy FGF i nikotynamid, a następnie wlać określoną liczbę mililitrów tej pożywki do każdego dołka. Pożywkę można przechowywać do dwóch tygodni w temperaturze 4°C, podczas gdy może być ona wykorzystywana do odświeżania hodowli komórkowej co drugi dzień w celu wzrostu kolonii. Po 8 do 10 dniach komórki ulegną zmianom morfologicznym, przekształcając się w duże, zróżnicowane komórki, które namnożyły się i ułożyły warstwowo.Następnie przejdź do hodowli w zawiesinie; aby ją rozpocząć, oddziel kolonie ESL od komórek, które uległy spontanicznej różnicowaniu i migrowały na zewnątrz, tworząc warstwę fibroblastów. Wykorzystaj wspomnianą wcześniej technikę z użyciem sterylnego końcówki pipety, a następnie odessać stare pożywkę zawierającą pływające, oddzielone komórki fibroblastów. Przemyj komórki raz pożywką HESC i zawieś je ponownie w trzech mililitrach pożywki HESC, tym razem używając sterylnej końcówki pipety P2.Pokrój kolonie na małe kawałki i oddziel je od płytki. Przenieś pożywkę z oddzielonymi koloniami do jednej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Przepłucz dołki 1 ml pożywki i dodaj płuczkę do wspólnej próbki.Następnie nanieś po 4 ml połączonych komórek do każdej studzienki sześciostudzienkowej płytki o ultra-niskim przywieraniu na okres od czterech do pięciu dni. Przechowuj płytkę w inkubatorze, aby umożliwić tworzenie się pływających skupisk komórkowych lub kardioblastów, co pozwoli na przejście kardioblastów w fenotyp bijących kardiomiocytów. Zbierz je wraz z pożywką do probówki stożkowej o pojemności 50 ml.Następnie odwiruj komórki przy 1 400 RPM przez pięć minut. Odessaj i zważ jak największą ilość starej pożywki, a następnie dodaj taką samą objętość świeżej pożywki do różnicowania kardiocytów zawierającej 10 millimolar nikotynamidu.Wymieszać unoszące się kardioblasty za pomocą pipetowania, a następnie przenieść cztery mililitry zawiesiny kardioblastów do każdego dołka sześciodołkowych płytek hodowlanych. Przenieść płytki do inkubatora z nawilżaczem w temperaturze 37 °C, aby umożliwić kardioblastom przyкрепienie się do płytek hodowlanych przez noc. Powtarzać co drugi dzień hodowli.W ósmym dniu należy wymienić pożywkę do dyferencjacji kardiologicznej zawierającą 10 mM nikotynamidu. Przejdź do stosowania pożywki do dyferencjacji kardiologicznej bez nikotynamidu, kontynuując wymianę pożywki co drugi dzień.W ciągu dwóch tygodni po odstawieniu nikotynamidu zaczną pojawiać się i zwiększać w liczbie bijące kardiomiocyty; nikotynamid okazuje się wystarczający, aby wywołać w ludzkich komórkach ES utrzymywanych w określonym systemie hodowlanym przejście z pluripotencji wyłącznie w kierunku fenotypu kardjomezodermalnego. Po wystawieniu niezróżnicowanych ludzkich komórek ES na działanie nikotynamidu wszystkie komórki w kolonii przeszły zmiany morfologiczne w duże, zróżnicowane komórki, w których obniżono ekspresję OCT four. Komórki zaczęły również wykazywać ekspresję specyficznego dla serca czynnika transkrypcyjnego NK X 2.5, a także ekspresję alfa-aktyniny.Obie charakterystyki są zgodne z fenotypem mezodermy serca. Te zróżnicowane komórki nadal mnożą się i zwiększają rozmiar w obszarach kolonii, w których doszło do ich spiętrzenia. Ekspresja NKX 2.5 stała się bardziej intensywna. Po odspojeniu ludzkie komórki ES traktowane nikotynamidem utworzyły kardioblasty w hodowli zawiesinowej.Po umożliwieniu przylegania kardioblastów, kardioblasty traktowano nikotynamidem przez jeden tydzień; od jednego do dwóch tygodni po odstawieniu nikotynamidu zaczęły pojawiać się bijące kardiomiocyty o znacznie zwiększonej wydajności. Pojawiły się one w postaci skupisk komórkowych wykazujących rytmiczne skurcze; spontaniczna różnicowanie wieloliniowe komórek, które nie zostały poddane obróbce IDE, nie wykazywało tych cech. Komórki w obrębie skupisk bijących kardiomiocytów wykazywały markery charakterystyczne dla kardiomiocytów, w tym NK X 2.5 i alfa-aktyninę.Potwierdzono za pomocą profili elektrycznych, że skurcze bijących kardiomiocytów były silne, rytmiczne, skoordynowane i dobrze zsynchronizowane; wykazywały one regularne impulsy przypominające kompleksy P-Q-R-S-T obserwowane za pomocą elektrod powierzchniowych w klinicznych elektrokardiogramach. Co więcej, kardiomiocyty mogły zachować silną zdolność do skurczu przez ponad trzy miesiące. Po opanowaniu tej techniki można ją wykorzystać do jednorodnego generowania prekursorów serca i bijących kardiomiocytów z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w ciągu około pięciu tygodni, pod warunkiem jej prawidłowego wykonania.

efficient-derivation-human-cardiac-precursors-cardiomyocytes-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Skuteczne pozyskiwanie ludzkich prekursorów komórek serca i kardiomiocytów z wielopotencjalnych ludzkich komórek macierzystych zarodkowych przy użyciu małych cząsteczek indukcyjnych

Opracowaliśmy protokół indukcji neuroblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z zastosowaniem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów neuronalnych oraz typów komórek neuronalnych rozwijającego się OUN w celu regeneracji tkanki nerwowej.

Efektywne wyprowadzanie ludzkich progenitorów neuronalnych i neuronów z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z zastosowaniem indukcji małymi cząsteczkami

Pluripotencjalne komórki macierzyste, zarówno embrionalne, jak i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS), stanowią cenne źródło ludzkich zróżnicowanych komórek, w tym kardiomiocytów. Tutaj skupimy się na indukcji komórek iPS w sercu, pokazując, jak wykorzystać je do uzyskania funkcjonalnych ludzkich kardiomiocytów za pomocą protokołu opartego na ciałach embrionalnych.

Generowanie ludzkich kardiomiocytów: protokół różnicowania od indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych bez karmienia

Artykuł opisuje szczegółową metodologię skutecznego różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w kardiomiocyty poprzez selektywne modulowanie szlaku Wnt, a następnie analizę markerów referencyjnych za pomocą cytometrii przepływowej w celu oceny jednorodności i tożsamości populacji.

Wysoka skuteczność różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów i charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej

W tym protokole zostanie zilustrowane pochodzenie komórek progenitorowych serca zarówno z mysich, jak i ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Główną strategią w tym protokole jest wzbogacenie komórek progenitorowych serca za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu fluorescencyjnych reporterów zmodyfikowanych w embrionalnych liniach komórek macierzystych.

Wyprowadzenie komórek progenitorowych serca z embrionalnych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy solidny protokół do pozyskiwania ludzkich kardiomiocytów, który łączy modulowane małymi cząsteczkami różnicowanie serca i oczyszczanie kardiomiocytów za pośrednictwem deprywacji glukozy, umożliwiając produkcję oczyszczonych kardiomiocytów dla celów modelowania chorób sercowo-naczyniowych i badań przesiewowych leków.

Otrzymywanie wysoce oczyszczonych kardiomiocytów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu różnicowania modulowanego małymi cząsteczkami i późniejszego głodu glukozy

Generowanie kardiomiocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych in vitro umożliwia dostęp do dużych ilości tkanki serca in vitro dla nauk podstawowych i zastosowań klinicznych.  Protokół ten wykorzystuje czynnik przedsionkowy Grem2 zarówno do zwiększenia liczby uzyskanych kardiomiocytów, jak i do wytworzenia kardiomiocytów o fenotypie przedsionkowym.

Różnicowanie kardiomiocytów przedsionkowych od pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą antagonisty BMP Grem2

Tutaj prezentujemy solidny, szybki i skalowalny protokół różnicowania kardiomiocytów dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). Kardiomiocyty uzyskane przy użyciu tej metody na dużą skalę mogą zapewnić wystarczającą liczbę komórek do ich skutecznego wykorzystania w modelowaniu chorób sercowo-naczyniowych u ludzi, wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych leków i potencjalnie zastosowaniach klinicznych.

Produkcja kardiomiocytów na dużą skalę z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu wysoce powtarzalnego protokołu różnicowania opartego na małych cząsteczkach

Elektrofizjologiczna charakterystyka kardiomiocytów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CMs) jest kluczowa dla modelowania chorób serca i określania odpowiedzi na leki. Protokół ten dostarcza informacji niezbędnych do dysocjacji i płytki hPSC-CM na matrycach wieloelektrodowych, pomiaru ich potencjału pola oraz metody analizy odstępów QT i RR.

Analiza elektrofizjologiczna ludzkich kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CM) przy użyciu macierzy wieloelektrodowych (MEA)

Tutaj opisujemy skalowalną metodę, wykorzystującą prostą kombinację Activiny A i nadekspresji Id1 za pośrednictwem lentiwirusa, do generowania pierwszych komórek progenitorowych serca podobnych do pola serca i kardiomiocytów komorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Generacja pierwszych sercopodobnych progenitorów serca i kardiomiocytów komorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy protokół do solidnego generowania i rozbudowy ludzkich kardiomiocytów z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pacjenta.

Wytwarzanie i ekspansja ludzkich kardiomiocytów z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pacjenta

Prezentowany tutaj jest zestaw protokołów do generowania i kriokonserwacji sferoid serca (CS) z ludzkich pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, hodowanych w wysokoprzepustowym, wielowymiarowym formacie. Ten trójwymiarowy model funkcjonuje jako solidna platforma do modelowania chorób, wysokoprzepustowych badań przesiewowych i zachowuje swoją funkcjonalność po krioprezerwacji.

Generowanie, wysokoprzepustowe badania przesiewowe i biobankowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych sferoid serca pochodzących z komórek macierzystych

Poznaj metodę indukcji kardioblastów z ludzkich komórek macierzystych ES za pomocą nikotynamidu. Protokół umożliwia efektywne uzyskiwanie prekursorów serca i funkcjonalnych kardiomiocytów.

Efektywne pozyskiwanie ludzkich prekursorów serca i kardiomiocytów z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z indukcją małych cząsteczek (Wideo) | JoVE Journal

Efektywne otrzymywanie prekursorów kardiologicznych i kardiomiocytów ludzkich z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukcji małocząsteczkowej

Przeglądaj więcej filmów