Efektywne otrzymywanie prekursorów kardiologicznych i kardiomiocytów ludzkich z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukcji małocząsteczkowej

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest bezpośrednie i wyłączne otrzymanie potomstwa kardiologicznego z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu indukcji małocząsteczkowej. Osiąga się to poprzez dodanie nikotynamidu do niezróżnicowanych ludzkich komórek ES utrzymywanych w określonych warunkach. Następnie komórki różnicujące się w kierunku kardiologicznym są odrywane w celu utworzenia kardioblastów, czyli pływających skupisk komórkowych w kulturze zawiesinowej.

Po sformowaniu kardioblasty przenosi się do pożywki różnicowania kardiologicznego, w której rozwijają się dalej w bijące kardiomiocyty. Ostatecznie wyniki ocenia się za pomocą immunofluorescencji z zastosowaniem mikroskopii dekonwolucyjnej lub konfokalnej oraz za pomocą rejestracji elektrofizjologicznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na wydajną indukcję pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych wyłącznie w kierunku linii kardiologicznej poprzez proste dostarczenie małych cząsteczek.

Podczas gdy w istniejących metodach różnicowania wieloliniowego jedynie niewielka frakcja komórek przyjmuje fenotyp kardiologiczny. Istnieje kilka kroków, na które należy zwrócić uwagę podczas przygotowywania roztworów stokowych. Należy pamiętać o powolnym rozmrażaniu matrigelu i ludzkiej lamininy z temperatury -80°C do 4°C przez noc; pożywki należy przechowywać w temperaturze 4°C i zawsze podgrzewać je do 37°C przed użyciem.

Ponadto podczas przygotowywania pożywki dla ludzkich komórek ES niektóre suplementy dodaje się bezpośrednio przed użyciem. Należą do nich BFGF, kwas askorbinowy, aktywna insulina ludzka w A oraz transferyna. Następnie należy przygotować robocze roztwory matrigelu lub ludzkiej lamininy bezpośrednio przed powlekaniem płytek.

Po przygotowaniu płytek do hodowli tkankowych pokrytych żelatyną, inkubuj je w temperaturze 37 °C w 5% CO2. Żelatynę można zastąpić roztworem roboczym Matrigelu lub lamininy. Płytki należy pokryć, inkubując je przez noc w temperaturze 4 °C.

Należy rozpocząć od hodowli kolonii ludzkich komórek ES przez pięć do siedmiu dni, a następnie przygotować się do pasażowania wybranych z nich. Należy wybierać kolonie zawierające ponad 75% niezróżnicowanych ludzkich komórek ES. Zazwyczaj są one lekko mętne, z wyraźnie zarysowanymi krawędziami i zawierają piętrzące się komórki. Sygnałem rozpoczęcia różnicowania są zazwyczaj białe kolonie, natomiast kolonie zawierające głównie komórki zróżnicowane zazwyczaj wydają się przejrzyste.

Nie wybieraj kolonii białych ani przeźroczystych. Podnieś płytki pod światło i za pomocą markera obrysuj na spodzie płytek lekko mętne kolonie wzdłuż ich krawędzi. Używając krawędzi sterylnego końcówki pipety P2, oddziel otaczającą warstwę fibroblastów od kolonii ludzkich komórek ES.

Następnie usuń otaczające komórki fibroblastów, a także wszystkie zróżnicowane części kolonii. Teraz odessij starą pożywkę zawierającą oddzielone zróżnicowane komórki. Następnie w każdej studzience przemyj niezróżnicowane komórki raz pożywką dla ludzkich komórek ES pozbawioną BFGF, a następnie dodaj trzy mililitry świeżej pożywki dla ludzkich komórek ES zawierającej BFGF; BFGF dodaje się do świeżej pożywki bezpośrednio przed użyciem.

Następnie za pomocą sterylnej końcówki pipety P2 podziel kolonie na małe fragmenty i oddziel je od płytki. Przenieś oddzielone fragmenty kolonii wraz z pożywką do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Płukanie każdego dołka wykonaj dodatkowo za pomocą 1 ml pożywki.

Komórki są teraz gotowe do dalszej różnicowania przy użyciu małych cząsteczek. Należy rozpocząć od ogrzania świeżo powlekanych płytek do 37 °C. Odessać roztwór powlekający z płytek, a następnie do każdej studni dodać czteromililitrową porcję medium zawierającego fragmenty kolonii, po czym ostrożnie przenieść płytki do inkubatora, unikając ich wstrząsania.

Nie należy poruszać płytek, aby umożliwić osiadanie komórek. Następnie należy usunąć większość starej pożywki, pozostawiając jej tyle, aby komórki pozostały zanurzone. Nie wolno dopuścić do wyschnięcia komórek.

Wymieszać świeżą pożywkę ESL dla ludzi zawierającą podstawowy FGF i nikotynamid, a następnie wlać określoną liczbę mililitrów tej pożywki do każdego dołka. Pożywkę można przechowywać do dwóch tygodni w temperaturze 4°C, podczas gdy może być ona wykorzystywana do odświeżania hodowli komórkowej co drugi dzień w celu wzrostu kolonii. Po 8 do 10 dniach komórki ulegną zmianom morfologicznym, przekształcając się w duże, zróżnicowane komórki, które namnożyły się i ułożyły warstwowo.

Następnie przejdź do hodowli w zawiesinie; aby ją rozpocząć, oddziel kolonie ESL od komórek, które uległy spontanicznej różnicowaniu i migrowały na zewnątrz, tworząc warstwę fibroblastów. Wykorzystaj wspomnianą wcześniej technikę z użyciem sterylnego końcówki pipety, a następnie odessać stare pożywkę zawierającą pływające, oddzielone komórki fibroblastów. Przemyj komórki raz pożywką HESC i zawieś je ponownie w trzech mililitrach pożywki HESC, tym razem używając sterylnej końcówki pipety P2.

Pokrój kolonie na małe kawałki i oddziel je od płytki. Przenieś pożywkę z oddzielonymi koloniami do jednej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Przepłucz dołki 1 ml pożywki i dodaj płuczkę do wspólnej próbki.

Następnie nanieś po 4 ml połączonych komórek do każdej studzienki sześciostudzienkowej płytki o ultra-niskim przywieraniu na okres od czterech do pięciu dni. Przechowuj płytkę w inkubatorze, aby umożliwić tworzenie się pływających skupisk komórkowych lub kardioblastów, co pozwoli na przejście kardioblastów w fenotyp bijących kardiomiocytów. Zbierz je wraz z pożywką do probówki stożkowej o pojemności 50 ml.

Następnie odwiruj komórki przy 1 400 RPM przez pięć minut. Odessaj i zważ jak największą ilość starej pożywki, a następnie dodaj taką samą objętość świeżej pożywki do różnicowania kardiocytów zawierającej 10 millimolar nikotynamidu.

Wymieszać unoszące się kardioblasty za pomocą pipetowania, a następnie przenieść cztery mililitry zawiesiny kardioblastów do każdego dołka sześciodołkowych płytek hodowlanych. Przenieść płytki do inkubatora z nawilżaczem w temperaturze 37 °C, aby umożliwić kardioblastom przyкрепienie się do płytek hodowlanych przez noc. Powtarzać co drugi dzień hodowli.

W ósmym dniu należy wymienić pożywkę do dyferencjacji kardiologicznej zawierającą 10 mM nikotynamidu. Przejdź do stosowania pożywki do dyferencjacji kardiologicznej bez nikotynamidu, kontynuując wymianę pożywki co drugi dzień.

W ciągu dwóch tygodni po odstawieniu nikotynamidu zaczną pojawiać się i zwiększać w liczbie bijące kardiomiocyty; nikotynamid okazuje się wystarczający, aby wywołać w ludzkich komórkach ES utrzymywanych w określonym systemie hodowlanym przejście z pluripotencji wyłącznie w kierunku fenotypu kardjomezodermalnego. Po wystawieniu niezróżnicowanych ludzkich komórek ES na działanie nikotynamidu wszystkie komórki w kolonii przeszły zmiany morfologiczne w duże, zróżnicowane komórki, w których obniżono ekspresję OCT four. Komórki zaczęły również wykazywać ekspresję specyficznego dla serca czynnika transkrypcyjnego NK X 2.5, a także ekspresję alfa-aktyniny.

Obie charakterystyki są zgodne z fenotypem mezodermy serca. Te zróżnicowane komórki nadal mnożą się i zwiększają rozmiar w obszarach kolonii, w których doszło do ich spiętrzenia. Ekspresja NKX 2.5 stała się bardziej intensywna. Po odspojeniu ludzkie komórki ES traktowane nikotynamidem utworzyły kardioblasty w hodowli zawiesinowej.

Po umożliwieniu przylegania kardioblastów, kardioblasty traktowano nikotynamidem przez jeden tydzień; od jednego do dwóch tygodni po odstawieniu nikotynamidu zaczęły pojawiać się bijące kardiomiocyty o znacznie zwiększonej wydajności. Pojawiły się one w postaci skupisk komórkowych wykazujących rytmiczne skurcze; spontaniczna różnicowanie wieloliniowe komórek, które nie zostały poddane obróbce IDE, nie wykazywało tych cech. Komórki w obrębie skupisk bijących kardiomiocytów wykazywały markery charakterystyczne dla kardiomiocytów, w tym NK X 2.5 i alfa-aktyninę.

Potwierdzono za pomocą profili elektrycznych, że skurcze bijących kardiomiocytów były silne, rytmiczne, skoordynowane i dobrze zsynchronizowane; wykazywały one regularne impulsy przypominające kompleksy P-Q-R-S-T obserwowane za pomocą elektrod powierzchniowych w klinicznych elektrokardiogramach. Co więcej, kardiomiocyty mogły zachować silną zdolność do skurczu przez ponad trzy miesiące. Po opanowaniu tej techniki można ją wykorzystać do jednorodnego generowania prekursorów serca i bijących kardiomiocytów z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w ciągu około pięciu tygodni, pod warunkiem jej prawidłowego wykonania.