Name: Profilowanie transkrypcyjne pojedynczych komórek kardiomiocytów dorosłych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Poznaj metody izolacji żywych kardiomiocytów dorosłych myszy i analizy ekspresji genów na poziomie pojedynczych komórek. Techniki obejmują perfuzję kolagenazową, qPCR i mikromacierze.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy pragną podziękować C. Zambataro za pomoc techniczną podczas filmowania niniejszego protokołu. Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie Glenn Foundation for Medical Research (S.M.), The Hillblom foundation oraz National Institutes of Health w ramach grantu Nathan Shock Center (P30AG025708) oraz PO1AG025901. J.M.F. otrzymał wsparcie z funduszy T32AG000266 przyznanych Buck Institute for Research on Aging.

<ol><li>Wolska, B. M., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+for+studies+of+contraction+and+microfluorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.</a> Am. J. Physiol. 271 (3 Pt 2), H1250-H1255 (1996).</li>
<li>Shioya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+isolating+healthy+heart+cells+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models.</a> J. Physiol. Sci. 57 (6), 327-335 (2007).</li>
<li>Guo, G., Huss, M., Tong, G. Q., Wang, C., Li Sun, L., Clarke, N. D., Robson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+cell+fate+decisions+revealed+by+single-cell+gene+expression+analysis+from+zygote+to+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst.</a> Dev. Cell. 18 (4), 675-685 (2010).</li>
<li>Narsinh, K. H., Sun, N., Sanchez-Freire, V., Lee, A. S., Almeida, P., Hu, S., Jan, T., Wilson, K. D., Leong, D., Rosenberg, J., Yao, M., Robbins, R. C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptional+profiling+reveals+heterogeneity+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells.</a> J. Clin. Invest. 121 (3), 1217-1221 (2011).</li>
<li>D'haene, B., Vandesompele, J., Hellemans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+and+objective+copy+number+profiling+using+real-time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Accurate and objective copy number profiling using real-time quantitative PCR.</a> Methods. 50 (4), 262-270 (2010).</li>
<li>Cook, M. J. The Anatomy of the Laboratory Mouse. Informatics. , Academic Press. (1965).</li>
<li>Gaillard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Radiopaedia%22%5BJournal%5D)">Aorta.</a> Radiopaedia. , (2008).</li>
<li>Ståhlberg, A., Andersson, D., Aurelius, J., Faiz, M., Pekna, M., Kubista, M., Pekny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+cell+populations+with+single-cell+gene+expression+profiling%3A+correlations+and+identification+of+astrocyte+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Defining cell populations with single-cell gene expression profiling: correlations and identification of astrocyte subpopulations.</a> Nucleic Acids Res. 39 (4), e24-e24 (2011).</li>
<li>Zhong, J. F., Chen, Y., Marcus, J. S., Scherer, A., Quake, S. R., Taylor, C. R., Weiner, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+processor+for+gene+expression+profiling+of+single+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells.</a> Lab Chip. 8 (1), 68-74 (2008).</li>
<li>Bahar, R., Hartmann, C. H., Rodriguez, K. A., Denny, A. D., Busuttil, R. A., Dollé, M. E., Calder, R. B., Chisholm, G. B., Pollock, B. H., Klein, C. A., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+cell-to-cell+variation+in+gene+expression+in+ageing+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Increased cell-to-cell variation in gene expression in ageing mouse heart.</a> Nature. 441 (7096), 1011-1014 (2006).</li>
<li>Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature%2C+nurture%2C+or+chance%3A+stochastic+gene+expression+and+its+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nature, nurture, or chance: stochastic gene expression and its consequences.</a> Cell. 135 (2), 216-226 (2008).</li>
<li>Elowitz, M., Levine, A., Siggia, E., Swain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li>
</ol>

Bezpłatny dostęp do niniejszego artykułu oraz jego opracowanie są sponsorowane przez firmę Sigma-Aldrich.

Metoda ta umożliwia generowanie kardiomiocytów do szeregu badań funkcjonalnych, a także analizy ekspresji genów. Badanie pojedynczych komórek jest dynamicznie rozwijającym się obszarem analizy ekspresji genów. Zaletą badania poziomów transkrypcyjnych na poziomie pojedynczej komórki jest możliwość analizy czystej populacji komórek, co nie jest możliwe w przypadku preparatów z całych tkanek. Ponadto analiza pojedynczych komórek pozwala na badanie stochastycznej zmienności poziomów mRNA w poszczególnych komórkach w celu zdefiniowania populacji komórkowych, które wcześniej uważano za homogeniczne 8,9. Oprócz identyfikacji genów, których ekspresja może mieć charakter stochastyczny 10,11,12, metoda ta umożliwia również identyfikację rzadkich populacji komórek definiowanych przez ich profile ekspresji genów.
Choć metoda ta oferuje szereg obiecujących zastosowań w analizie ekspresji genów, stosowanie pojedynczych komórek wiąże się z pewnymi zastrzeżeniami i kwestiami do rozważenia. Głównym ograniczeniem analizy pojedynczych komórek jest zgromadzenie w eksperymencie wystarczającej liczby komórek, aby osiągnąć istotność statystyczną w odniesieniu do interesującej nas metryki, np. wariancji. W przypadkach, gdy liczba komórek wyizolowanych z badanego tkanki nie stanowi ograniczenia, można zbadać setki komórek na grupę, stosując podejścia takie jak sekwencjonowanie następnej generacji lub układy nanofluidyczne. Jednak w niektórych sytuacjach pozyskanie wystarczającej liczby komórek z danej tkanki może być utrudnione. Może to wynikać częściowo ze specyficznych, czasochłonnych procedur zbierania docelowego typu komórek. Niemniej jednak staranne planowanie i przygotowanie przed przystąpieniem do izolacji pojedynczych komórek może nadal umożliwić rygorystyczną analizę przy ograniczonym błędzie technicznym. Analizując wyniki należy wziąć pod uwagę, że mimo iż ta procedura izolacji komórek była stosowana w licznych badaniach (w tym w mikroskopii, elektrofizjologii itp.), sama izolacja może potencjalnie wpływać na ekspresję genów. Jak w przypadku każdej metody manipulującej próbkami biologicznymi, wyniki powinny zostać starannie zwalidowane, aby upewnić się, że ekspresja w pojedynczych komórkach jest reprezentatywna dla samej tkanki, a nie wynika z błędu technicznego. Metody takie jak hybrydyzacja in situ mogą okazać się użyteczne w celu weryfikacji tych wyników w nienaruszonej tkance. Na koniec kluczowe jest zapewnienie starannej kontroli jakości generowanych danych. Dane przedstawione na Rysunku 8 pokazują, że testy qPCR mogą charakteryzować się bardzo wysoką specyficznością, jak w przypadku testu #13 (A13), lub wysokim poziomem zmienności, co może prowadzić do wariancji technicznej, jak w przypadku testu #34 (A34).

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71378</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60128</td><td></td></tr><tr><td>Kwas pirogronowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4562</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>54457</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1020</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; jednopodstawny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6721</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3777</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>Proteaza, typ XIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza, typ I</td><td>Worthington Biochemical</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>1x Bufor do zawiesiny DNA (10 mM Tris, pH 8.0, 0.1 mM EDTA)</td><td>TEKnova, Inc.</td><td>PN T0221</td><td> </td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8667</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sodu</td><td>Henry Schein</td><td>Skontaktuj się z dostawcą w celu zamówienia</td><td>*musi zostać pozyskany przez lekarza weterynarii lub specjalistę ds. zwierząt laboratoryjnych</td></tr><tr><td>ExoSAP IT</td><td>Affymetrix</td><td>78201</td><td></td></tr><tr><td>CellsDirect 2x Rxn Mix</td><td>Invitrogen</td><td>11737-030</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III RT Platinum Taq Mix</td><td>Invitrogen</td><td>10928-042</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina starterów RT-STA</td><td>IDT</td><td>Własny</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>WTA2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WTA2-50rxn</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania PCR Qiaquick</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Qiacube</td><td>Qiagen</td><td>9001292</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr NanoDrop</td><td>NanoDrop</td><td>2000c</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw BioAnalyzer DNA 7500</td><td>Agilent Technologies</td><td>7500 kit</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do znakowania jednobarwnego One Color Labeling</td><td>Roche Group</td><td>5223555001</td><td></td></tr><tr><td>Matryca Mus Musculus 12x135k</td><td>Roche Group</td><td>5543797001</td><td></td></tr><tr><td>Skaner GenePix 4200A</td><td>Molecular Devices</td><td>4200A</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do pełnej amplifikacji transkryptomu TransPlex Complete (Zestaw WTA2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WTA2-50RXN</td><td> </td></tr></tbody></table>

profilowanie transkrypcyjne pojedynczych komórek kardiomiocytów dorosłej myszy

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Choć liczne badania analizowały zmiany ekspresji genów w homogenatach tkanki serca, uniemożliwia to badanie wrodzonej zmienności stochastycznej między komórkami w obrębie tkanki. Izolacja czystych populacji kardiomiocytów poprzez perfuzję serc myszy kolagenazą ułatwia generowanie mikromacierzy pojedynczych komórek do badania ekspresji całego transkryptomu lub qPCR specyficznych celów z wykorzystaniem macierzy nanofluidycznych. Opisujemy tutaj procedurę badania profili ekspresji genów w pojedynczych kardiomiocytach izolowanych z serca. Paradygmat ten pozwala na ocenę interesujących wskaźników, które nie opierają się na średniej (np. wariancji między komórkami w obrębie tkanki), co nie jest możliwe przy stosowaniu konwencjonalnych procedur dla całej tkanki w celu oceny ekspresji genów (Rycina 1). Osiągnęliśmy skuteczną amplifikację transkryptomu pojedynczej komórki, uzyskując mikrogramy dwuniciowego cDNA, co umożliwia zastosowanie mikromacierzy w odniesieniu do poszczególnych komórek. W procedurze opisujemy zastosowanie macierzy NimbleGen, które wybrano ze względu na łatwość użycia i możliwość dostosowania ich projektu. Alternatywnie, reakcja odwrotnej transkrypcji z amplifikacją specyficznego celu (RT-STA) umożliwia qPCR setek celów za pomocą nanofluidycznego PCR. Stosując dowolne z tych podejść, można badać zmienność ekspresji między komórkami, a także analizować profile ekspresji rzadkich typów komórek w obrębie tkanki. Ogólnie rzecz biorąc, podejście oparte na ekspresji genów w pojedynczych komórkach pozwala na generowanie danych, które mogą potencjalnie zidentyfikować idiosynkratyczne profile ekspresji, zazwyczaj uśredniane podczas badania ekspresji milionów komórek w typowych homogenatach otrzymywanych z całych tkanek.

Profilowanie ekspresji pojedynczych komórek umożliwia szczegółową analizę ekspresji genów w poszczególnych komórkach. Opisujemy metody izolacji kardiomiocytów oraz przygotowania otrzymanych lizatów do analizy całego transkryptomu za pomocą mikromacierzy lub qPCR specyficznych celów.

Profilowanie transkrypcyjne pojedynczych komórek kardiomiocytów dorosłej myszy

Choć liczne badania analizowały zmiany w ekspresji genów w homogenatach tkanki serca, uniemożliwia to badanie naturalnej zmienności stochastycznej...

Celami niniejszej prezentacji są: w pierwszej kolejności przedstawienie izolacji żywych kardiomiocytów dorosłej myszy, a następnie zademonstrowanie dwóch metod analizy ekspresji genów w pojedynczych komórkach. Po wycięciu serca z myszy, organ jest perfundowany roztworem trawiennym z kolagenazą w celu uzyskania pojedynczych komórek. W przypadku ilościowej PCR pojedynczych komórek, oczyszczone komórki są bezpośrednio poddawane analizom QPCR.Izolowane kardiomiocyty mogą być również wykorzystane do analizy mikromacierzy. Analiza mikromacierzy pojedynczych komórek obejmuje ekstrakcję mRNA, amplifikację całego transkryptomu za pomocą biblioteki plex, a następnie amplifikację ograniczoną i na koniec znakowanie oraz hybrydyzację z chipem mikromacierzy. Ostatnim krokiem obu procedur jest zapewnienie wysokiej jakości danych.Niniejsze procedury wykazują, że rzetelna analiza ekspresji genów jest możliwa w przypadku indywidualnie wyizolowanych kardiomiocytów dorosłych. Przewagą tej metody nad istniejącymi rozwiązaniami, takimi jak profilowanie ekspresji genów w homogenacie całej tkanki, jest fakt, że analiza ekspresji genów w pojedynczych komórkach pozwala uzyskać informacje o ekspresji w obrębie jednej komórki, a także o zmienności ekspresji między komórkami. Rozpocznij od przygotowania systemu izolacji, w tym wymaganych roztworów i buforów; przeprowadź terminalną sedację myszy poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowo (IP) 0,25 milliliters roztworu pentobarbitalu sodu i upewnij się, że mysz jest nieprzytomna i nie reaguje na bodźce bólowe.Nie należy stosować dwutlenku węgla ani zwichnięcia karku do uśmiercenia myszy przed całkowitym zatrzymaniem oddechu. Ostrożnie naciąć i otworzyć jamę klatki piersiowej wzdłuż krawędzi klatki piersiowej, aż do przepony.Następnie wykonaj cięcie w kierunku górnym i odchyl przednią część klatki piersiowej. Delikatnie wciągnij serce do wcześniej przygotowanej plastikowej pipety i wycinaj je z klatki piersiowej. Przenieś serce do lodowatego roztworu do trawienia.Płukanie buforem A przez 15 do 45 sekund w celu usunięcia krwi, wykonanie drugiego krótkiego płukania w buforze A, a następnie przeniesienie serca do szalki Petriego z buforem A i umieszczenie go pod mikroskopem sekcyjnym. Ostrożnie wyizolować aortę oraz jej odgałęzienia. Przyciąć aortę tuż poniżej ostatniego odgałęzienia.Wprowadź końcówkę kaniuli do aorty powyżej tętnic wieńcowych i przymocuj ją za pomocą szwu 4-0 lub 6-0. Rozpocznij perfuzję, używając buforu trawiennego A. Płyn wypływający zmieni kolor z czerwonego na przejrzysty w miarę wypłukiwania krwi z serca. Czas, jaki upłynie od uśmiercenia zwierzęcia do podłączenia serca do układu perfuzyjnego, ma krytyczne znaczenie.Idealnie czas ten powinien wynosić od 5 do 10 minut. Ponadto temperaturę płynu przepływającego przez zestaw do perfuzji należy utrzymać na poziomie 37 °C. Zbyt wysoka lub zbyt niska temperatura doprowadzi do zniszczenia tkanki.Po wypłukaniu krwi z serca należy przejść do etapu trawienia. Perfunduj serce buforem b przez dwie do trzech minut, aż serce zacznie tracić swój kształt i stanie się zaokrąglone. W miarę postępu perfuzji mięsień sercowy powinien stać się jaśniejszy; następnie odetnij komory i posiekaj je na mniejsze kawałki.Umieścić tkankę komory w 50 mililitrowej probówce stożkowej zawierającej 15 mililitrów ciepłego buforu do zbierania. Delikatnie wymieszać tkankę w buforze za pomocą plastikowej pipety, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych kardiomiocytów. Po jednej minucie przenieść mieszaninę do nowej probówki i odstawić do czasu uformowania się osadu.Odrzuć nadanadkrycie nazwane i resus. Zawiesić osad komórkowy w pięciu mililitrach buforu płuczącego do neutralizacji. Komórki są teraz gotowe do selekcji do analizy pojedynczych komórek.Rozcieńcz komórki na małej szalce Petriego, aby umożliwić ich indywidualną selekcję. Pod mikroskopem wybierz zdrowe, pojedyncze komórki, używając dociąganej pipety podłączonej do śluzy powietrznej. Podczas pobierania komórek należy zwrócić szczególną uwagę na unikanie kontaminacji oraz zminimalizować objętość pobieranego materiału do wartości poniżej 2 µL.Umieść poszczególne komórki na dnie oddzielnych probówek do PCR i natychmiast zamroź je na suchym lodzie. Następnie przechowuj komórki w temperaturze -80 °C. Rozpocznij od resuspensji wszystkich par starterów dla interesujących genów w stężeniu 100 µM w 1X buforze do zawiesiny DNA, po czym wymieszaj i rozcieńcz pary starterów do stężenia 20 µM. Na koniec rozcieńcz wszystkie pary starterów w jednym roztworze do końcowego stężenia 200 nM.Po przygotowaniu roztworów starterów należy niezwłocznie sporządzić master mix, wyjąć zamrożone komórki z zamrażarki i wirować je z maksymalną siłą przez 30 sekund. Następnie do każdej probówki należy dodać 9 µL master mixu i przystąpić do reakcji PCR. Po zakończeniu cykli należy wyjąć probówki z termocyklera i dodać 4 µL exos it do każdej reakcji.Następnie prowadź każdą reakcję przez 15 minut w temperaturze 37 °C, a następnie przez 15 minut w temperaturze 80 °C. Na koniec inkubuj je w temperaturze 4 °C. Następnie rozcieńcz próbki w stosunku 1:5 za pomocą buforu do zawiesiny DNA.Próbki są teraz gotowe do analizy ilościowej PCR. Wykorzystujemy ten materiał w systemie fluid IMS BIOMARK, używając macierzy ekspresji genów 48-punktowych lub 96-punktowych. Możliwe jest zastosowanie bardziej tradycyjnych formatów qPCR, takich jak płytki 96-dołkowe oraz 384-dołkowe.Format ten ogranicza jednak liczbę analiz, które można przeprowadzić z pojedynczej komórki. Proces ten wykorzystuje zestaw WTA Two firmy Sigma, który umożliwia amplifikację dwuniciowego cDNA zarówno z osadów, jak i z pojedynczych komórek. Zestaw najpierw rozbija błonę pojedynczych komórek, a następnie amplifikuje przekazy w dwóch rundach.Po wykonaniu etapu przygotowania biblioteki, dodaj jedną piątą próbki biblioteki do 70 µL master mixu do amplifikacji WTA two i amplifikuj próbki przez 25 cykli, stosując parametry zestawu. Następnie oczyść próbki za pomocą zestawu do szybkiego oczyszczania PCR Kapa i przetwórz je na urządzeniu Kapa Cube. Po zakończeniu zagęść oczyszczone próbki do 5 µL za pomocą wirówki próżniowej i użyj zestawu WTA two, aby przeprowadzić próbki przez 17 dodatkowych cykli amplifikacji, stosując te same parametry co w poprzedniej amplifikacji.Oczyść próbki w sposób opisany wcześniej i sprawdź ich jakość za pomocą spektrofotometru NanoDrop oraz zestawu Agilent Bioanalyzer DNA 7, 500. Następnie przeprowadź znakowanie 2 µg dwuniciowego cDNA z każdej amplifikowanej próbki komórkowej przy użyciu zestawu do znakowania jednym kolorem od NimbleGen. Hybrydyzuj 5 µg próbki znakowanej Cy3 z macierzą ekspresji genów NimbleGen, a po przemyciu z hybrydyzacji wysusz szkiełko w celu umożliwienia obrazowania. Do skanowania użyj urządzenia Molecular Devices GenePicks 4, 200 przy ustawieniach skalibrowanych na 100 POW i 300-350 PMT.Przeanalizuj chipy genowe, a następnie wygeneruj pliki par dla każdej macierzy za pomocą oprogramowania nimble scan firmy nimble gen i przystąp do analizy danych. Prawidłowo przeprowadzona perfuzja serca pozwoliła uzyskać wysoki odsetek zdrowych komórek serca, które zachowały swoją typową prostokątną morfologię. Gdyby perfuzja nie przebiegła pomyślnie, wiele komórek uległoby obumarciu.Komórki namnożono metodą WTA two, a następnie przetestowano jakość produktów końcowych. Próbka wykazała silną amplifikację zarówno w odczycie spektrometru nano drop spec, jak i w odczycie elektroforegramu z chipa bioanalizatora. Podsumowując, w kardiomiocytach stwierdzono silną ekspresję wielu genów.Jednak nie wszystkie testy są równie wiarygodne, co widać na tej mapie ciepła szczytowych temperatur topnienia dla podzbioru danych nano fluid at QPCR. Każdy wiersz tej mapy reprezentuje próbkę pojedynczej komórki w 43 oddzielnych testach QPCR. Niektóre testy wykazują dużą zmienność i są prawdopodobnie mniej wiarygodne niż te, które cechowały się wyższą swoistością PCR.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o konieczności pozyskania wysokiej jakości komórek na wstępie. Zapewni to odpowiednią jakość późniejszego profilowania ekspresji genów. Po opanowaniu techniki procedura izolacji pojedynczych komórek może zostać przeprowadzona w czasie krótszym niż dwie i pół godziny, a profilowanie ekspresji genów w tych komórkach może zostać ukończone w czasie poniżej dwóch dni.

single-cell-transcriptional-profiling-of-adult-mouse-cardiomyocytes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza transkrypcyjna pojedynczych komórek kardiomiocytów u dorosłych myszy

Tutaj opisujemy izolację dorosłych kardiomioktyesów myszy za pomocą systemu perfuzyjnego Langendorffa.  Powstałe komórki tolerują Ca2+, są elektrycznie uśpione i mogą być hodowane i transfekowane adeno- lub lentiwirusami w celu manipulowania ekspresją genów.  Ich funkcjonalność może być również analizowana za pomocą systemu MMSYS i technik zacisków krosowych.

Izolacja, hodowla i charakterystyka funkcjonalna kardiomioktaków dorosłych myszy

Opisujemy niezawodną metodę izolacji kardiomiocytów dorosłych myszy. Protokół ten daje spójny wynik dla hodowli funkcjonalnych dorosłych kardiomiocytów od różnych genetycznie zmodyfikowanych myszy.

Izolacja i hodowla kardiomiocytów dorosłych myszy do sygnalizacji komórkowej i przerostu serca in vitro

Ten protokół opisuje krok po kroku metodę powtarzalnej izolacji i długoterminowej hodowli kardiomiocytów dorosłych myszy o wysokiej wydajności, czystości i żywotności.

Izolacja, hodowla i transdukcja kardiomiocytów dorosłych myszy

Aby odróżnić podział komórek od zmian cyklu komórkowego w kardiomiocytach, prezentujemy protokoły wykorzystujące dwie transgeniczne linie myszy: myszy transgeniczne Myh6-H2B-mCh, do jednoznacznej identyfikacji jąder kardiomiocytów, oraz myszy CAG-eGFP-anilin, do odróżniania podziału komórek od zmian cyklu komórkowego.

Wizualizacja zmian cyklu komórkowego i oznaczanie zarodkowania w kardiomiocytach postnatalnych

Ten manuskrypt opisuje krok po kroku protokół generowania i kwantyfikacji różnych przeprogramowanych podtypów serca przy użyciu retrowirusowego dostarczania Gata4, Hand2, Mef2c i Tbx5 za pośrednictwem retrowirusa.

Ocena podtypów kardiomiocytów po przeprogramowaniu fibroblastów embrionalnych myszy za pośrednictwem czynnika transkrypcyjnego

Opisano metodę jednoczesnej izolacji miocytów i nie-miocytów zarówno z przedsionków, jak i komór serca pojedynczej dorosłej myszy. Protokół ten zapewnia stałą wydajność wysoce żywotnych miocytów serca i niemiocytów oraz szczegółowo opisuje optymalne warunki hodowli specyficzne dla komórek do fenotypowania i analizy in vitro.

Jednoczesna izolacja i hodowla miocytów przedsionkowych, miocytów komorowych i niemiocytów z serca dorosłej myszy

Tutaj opisujemy protokół izolowania wystarczającej ilości pojedynczych niekardiomiocytów o wysokiej żywotności z serca myszy po zawale mięśnia sercowego (MI). Można to wykorzystać do późniejszego sekwencjonowania pojedynczych komórek, analizy cytometrii przepływowej i pierwotnej hodowli komórek.

Przygotowanie zawiesiny komórek innych niż kardiomiocyty do sekwencjonowania jednokomórkowego RNA z serca dorosłej myszy po zawale mięśnia sercowego

Tutaj prezentujemy protokół opisujący przygotowanie jąder komórkowych. Po mikrodysekcji i enzymatycznej dysocjacji tkanki serca na pojedyncze komórki, komórki progenitorowe zamrożono, a następnie wyizolowano czyste żywe komórki, które wykorzystano do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra i testu pojedynczego jądra dla chromatyny dostępnej dla transpozazy z wysokoprzepustowymi analizami sekwencjonowania.

Izolacja jąder z komórek progenitorowych serca myszy w celu profilowania epigenomu i ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczej komórki

Pierwotne hodowle kardiomiocytów myszy są jednym z kluczowych narzędzi do badania organizacji i funkcji miofibrylarów. Poniższy protokół opisuje izolację i hodowlę pierwotnych kardiomiocytów z serca noworodków myszy. Uzyskane w ten sposób kultury kardiomiocytów mogą być następnie wykorzystane do różnych testów biomechanicznych, biochemicznych i biologicznych.

Izolacja i hodowla nowonarodzonych kardiomiocytów myszy

Pojedyncze kardiomiocyty od myszy typu dzikiego i zmutowanych mogą być izolowane z serca w celu zbadania ich kurczliwości i przejściowych stanów wapnia. Pozwala to na scharakteryzowanie udziału dysfunkcji komórkowej w dysfunkcji serca z dowolnej przyczyny.

Izolacja i analiza fizjologiczna kardiomiocytów myszy

Poznaj metody izolacji żywych kardiomiocytów dorosłych myszy i analizy ekspresji genów na poziomie pojedynczych komórek. Techniki obejmują perfuzję kolagenazową, qPCR i mikromacierze.

Profilowanie transkrypcyjne pojedynczych komórek kardiomiocytów dorosłej myszy

Przeglądaj więcej filmów