Rozciąganie krótkich sekwencji DNA za pomocą osiowych pęset optycznych o stałej sile

Ogólnym celem niniejszej procedury jest manipulowanie krótkimi cząsteczkami DNA o długości 100 nanometrów przy użyciu stałych, precyzyjnie skalibrowanych sił optycznych. Osiąga się to poprzez przytwierdzenie jednego końca DNA do szkiełka podstawowego, a drugiego do polistyrenowej mikrosfery. Następnie przeprowadza się wyrównanie i kalibrację pęsety optycznej.

Następnie DNA jest odciągane od powierzchni za pomocą kombinacji sił gradientowych i sił rozpraszania działających na mikrosferę. W końcowym etapie DNA zostaje rozciągnięte poprzez uwięzienie koralika w liniowym obszarze potencjału. Protokół ten był wykorzystywany do badania właściwości mechanicznych DNA oraz kinetyki wiązania białek do DNA, a ponadto okazał się użyteczny w wyjaśnianiu znaczenia warunków brzegowych dla elastyczności krótkich konstruktów DNA.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ wyrównanie i kalibracja pęset optycznych o stałej sile są procesami trudnymi i złożonymi. Pęsety optyczne wykorzystują wiązkę z lasera o długości fali 1064 nanometr, która jest rozdzielana na dwie ortogonalnie spolaryzowane wiązki. Jedna służy do manipulowania biomolekułą, a druga do celów kalibracyjnych.

Intensywność wiązki manipulacyjnej jest kontrolowana przez akustooptyczny deflektor (AO) lub deflektor optyczny (OD). Następnie wiązki są ponownie łączone za pomocą drugiego polaryzacyjnego dzielnika wiązki. Wiązki są ostro ogniskowane na komorze z próbką za pomocą obiektywu mikroskopowego plan APO 60 x 1.4 z imersją olejową. Ten układ pęsety optycznej jest połączony z własnoręcznie zbudowanym mikroskopem w polu jasnym, który zapewnia oświetlenie z lampy halogenowej ogniskowanej na komorze z próbką przez kondensor.

Obraz w polu jasnym jest oddzielany od światła lasera za pomocą lustra dichroicznego, a następnie obrazowany na dwóch kamerach CCD. Jedna kamera CCD służy jako główny środek pozyskiwania danych i jest wyzwalana programowo, aby zapewnić precyzyjne częstotliwości próbkowania. Druga kamera CCD jest wykorzystywana do obrazowania pojedynczej, unieruchomionej mikrosfery referencyjnej, której pozycja służy jako system kontroli sprzężenia zwrotnego w celu kompensacji dryftu mikroskopu.

Próbkę wstępnie ustawia się względem obiektywu za pomocą stolika XY, a następnie można ją precyzyjnie pozycjonować za pomocą wbudowanego trójwymiarowego stolika piezoelektrycznego. Rozproszone do przodu i transmitowane światło laserowe jest zbierane przez kondensor w jasnym polu i ogniskowane na detektorze światła w celu skalibrowania rozmiaru kuleczki; należy załadować do komory próbki roztwór dyspersyjny mikrosfer polistyrenowych o średnicy 800 nanometrów rozcieńczony w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami. Pozostawić na 10 do 15 minut, a następnie delikatnie przepłukać buforem.

Aby usunąć nadmiar mikrosfer, zlokalizuj mikrosferę przypadkowo przywierającą do szkiełka podstawowego i dostosuj wysokość komory z próbką tak, aby mikrosfera znajdowała się około jednego mikrometra poniżej płaszczyzny ostrości. Aby wygenerować obraz poza ogniskową w celu zmierzenia pozornej wielkości obrazu przy użyciu LabVIEW, najpierw znajdź środek mikrosfery, korzystając z funkcji geometrycznego dopasowania wzorców. Następnie wygeneruj radialny profil intensywności mikrosfery poprzez uśrednienie wartości w zakresie 360 stopni.

W okolicach centrum każdego przekroju poprzecznego dopasowano profil radialny, który odpowiada białemu pierścieniowi na każdym z obrazów w polu jasnym, za pomocą funkcji kwadratowej. Aby znaleźć szczyt jasności, odległość między tym szczytem a centrum można wykorzystać jako miarę pozornej wielkości kuleczki. Używając skalibrowanego stolika piezoelektrycznego, stopniowo zwiększano pozycję osiową mikrosfery i rejestrowano obraz dla każdej pozycji osiowej za pomocą kamery CCD. Analizę obrazu powtórzono dla każdego kolejnego zdjęcia, aby skorelować pozorną wielkość mikrosfery z jej położeniem osiowym.

Rozdzielczość osiowa uzyskana tą metodą wynosi około 1,4 nanometrów. Aby zmapować potencjał optyczny wiązki manipulacyjnej, należy rozpocząć od kolineacji, wyrównując wiązkę manipulacyjną z wiązką kalibracyjną przy wyłączonej wiązce manipulacyjnej. Następnie należy uwięzić wolną mikrosferę w znacznie sztywniejszej pułapce utworzonej przez wiązkę kalibracyjną. W tym momencie należy włączyć wiązkę manipulacyjną.

Ponieważ jest on znacznie słabszy od wiązki kalibracyjnej, pozycja osiowa mikrosfery zostanie lekko zaburzona. Wynikową zmianę pozycji osiowej można zmierzyć na podstawie obrazów w jasnym polu z odogniskowaniem, zgodnie z wcześniejszym opisem. Przesuń ostrość osiową i powtórz czynność, a następnie nanieś przemieszczenie delta X w funkcji pozycji osiowej ogniska wiązki kalibracyjnej.

Pozycja osiowa odpowiadająca największemu przemieszczeniu mikrosfery wyznacza centrum liniowego obszaru pułapki optycznej. W celu rozciągnięcia próbki DNA zamocuj komorę zawierającą przytwierdzone do powierzchni cząsteczki DNA, a następnie, obserwując obraz w jasnym polu, ustaw ogniskową wiązki manipulacyjnej nieco powyżej nierozciągniętych mikrosfer poprzez regulację teleskopu, po czym koryguj pozycję stolika, aż do momentu schwytania jednej z mikrosfer. Wstępnie ustaw mikrosferę w centrum płaszczyzny XY pułapki optycznej, wygeneruj w programie LabVIEW serię fal prostokątnych i prześlij je do przetwornika cyfrowo-analogowego (DAC), aby wielokrotnie włączać i wyłączać wiązkę lasera.

Obserwuj mikrosferę podczas wielokrotnego włączania i wyłączania pułapki. Zwróć uwagę, czy laser nadaje preferowany kierunek ruchowi mikrosfery podczas iteracyjnego dostrajania jej pozycji w kierunkach X i y. Dzięki sterowaniu stolikiem piezoelektrycznym ruch losowy mikrosfery powinien stać się izotropowy w płaszczyźnie X-y, choć zauważalnie ograniczony w czasie działania lasera.

Następnie ustaw koralik w kierunku Z. Ponownie włączaj i wyłączaj wiązkę lasera impulsowo, tym razem jednocześnie mierząc przemieszczenie osiowe mikrosfer w czasie rzeczywistym.

Ustaw środek sceny w obszarze liniowym, który jest punktem największego przesunięcia Z podczas rozciągania rampy DNA, a intensywność lasera reguluj, przesyłając sygnał napięcia do A OD od 0 V do 0,5 V w krokach co 0,025 V. Nagraj 400 klatek przy prędkości 100 klatek na sekundę i wyciągnij z nich średnią, aby uzyskać przesunięcie osiowe. Na koniec wykreśl krzywe zależności siły od wydłużenia i dopasuj je do zmodyfikowanego modelu łańcucha typu worm-like chain.

Przedstawiono tutaj krzywe siła-wydłużenie dla sekwencji NA 2D o długości 1, 298 par zasad oraz 247 par zasad dla krótkich odcinków DNA. Konwencjonalny model łańcucha przypominającego robaka (WLC) nie wyjaśnia w pełni zależności między siłą a wydłużeniem, ponieważ w tych skalach długości należy uwzględnić efekty skończonego rozmiaru oraz wydłużenie przy zerowej sile wynikające z ograniczeń brzegowych. Pomiary siły i wydłużenia muszą być zatem dopasowane przy użyciu zmodyfikowanego modelu WLC, w którym parametrami dopasowania są efektywna długość persystencji oraz wydłużenie przy zerowej sile, co zostało opisane szczegółowo w materiałach uzupełniających.

W przypadku dużych długości konturowych D-S-D-N-A, efektywna długość persystencji jest po prostu nominalną długością persystencji wynoszącą około 50 nanometrów, a rozciągnięcie przy zerowej sile można pominąć w zmodyfikowanych dopasowaniach modelu WLC. Efektywne długości persystencji wynoszą 35 nanometrów dla DNA o długości 298 par zasad oraz 25 nanometrów dla DNA o długości 247 par zasad po jego opracowaniu. Metoda ta utorowała drogę do szeregu nanomechanicznych pomiarów DNA oraz kompleksów białkowo-DNA, w tym do badania kinetyki tworzenia i rozpadu pętli DNA pośredniczonych przez białka regulacyjne.