Selekcja i izolacja kolonii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przeprogramowanych z dorosłych fibroblastów

W tym artykule wideo dorosłe ludzkie fibroblasty są przeprogramowywane do generowania pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą wektorów retrowirusowych. Po pierwsze, ludzkie fibroblasty są transdukowane za pomocą wektorów retrowirusowych kodujących czynniki transkrypcyjne. T trzy cztery, SOX dwa, KLF cztery i cmic.

Zakażone fibroblasty są hodowane na embrionalnych komórkach żywicielskich myszy przez 14 do 28 dni. Powstałe kultury barwi się przeciwciałem TRA 180 1 w celu identyfikacji kolonii przeprogramowanych komórek. Dodatnie kolonie są następnie przenoszone na płytki zawierające MEF w celu ekspansji.

Barwienie immunocytochemiczne potwierdza ekspresję markerów pluripotencji i tworzenie pluripotencjalnych linii komórek macierzystych. Następnie należy przeprowadzić dodatkowe badania w celu dokładniejszego scharakteryzowania linii. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w programowaniu komórek somatycznych i indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych hodowlach komórek macierzystych będą miały trudności, ponieważ trudno jest zidentyfikować prawidłowe kolonie IPSC.

Procedurę zademonstruje dr Sula Pollak, post-Doctor O Fellow z mojego laboratorium. Rozpocznij tę procedurę od posiewu komórek Phoenix AM FO o gęstości około siedmiu do 8 milionów komórek na 10-centymetrową płytkę w 10 mililitrach DMEM o wysokiej zawartości glukozy, umieść w inkubatorze i hoduj przez noc. Następnego dnia przygotuj mieszanki transfekcyjne składające się z 12 mikrogramów wektora kodującego T trzy cztery SOX, dwa klf, cztery cmic lub GFP gen i 35 mikrolitrów kilku genów sześć o łącznej objętości 500 mikrolitrów wolnego DMEM o wysokiej zawartości glukozy w surowicy z L-glutaminą.

Inkubować mieszaniny przez 20 minut. Następnie, aby transfekować komórki feniksa, delikatnie pipetuj kompleksy DNA do płytek zawierających komórki feniksa, które powinny być zlewające się w 70 do 80%. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza po sześciu do ośmiu godzinach.

Odessać pożywkę i zastąpić ją ośmioma mililitrami DMEM o wysokiej zawartości glukozy z antybiotykami. Następnie należy umieścić płytki z powrotem w inkubatorze na 12 godzin po inkubacji. Za pomocą pipety odessać i zebrać pożywkę zawierającą wirusa.

Następnie wymień pożywkę i powtarzaj ten proces co 12 godzin, aż podłoże zostanie zebrane cztery razy. Przechowywać podłoże w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po zebraniu całej pożywki połącz wszystkie porcje, a następnie przelej je przez górny filtr z rurką o średnicy 0,45 mikrometra do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów, aby usunąć oderwane komórki i zanieczyszczenia.

Przefiltrowane podłoże, które zawiera cząsteczki wirusa, można przechowywać w lodówce przez dwa tygodnie bez utraty aktywności zakaźnej. Zamrażanie nie jest zalecane. W dniu poprzedzającym procedurę transdukcji rozmrozić zamrożony zapas dorosłych ludzkich fibroblastów i dodać jeden razy 10 do piątej komórki na każdą studzienkę z sześciu dołków pokrytych żelatyną.

Następnego dnia w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów połącz po 3,5 mililitra z pożywki T four SOX two, klf four i cmic viral medium i dodaj poly brain do końcowego stężenia sześciu mikrogramów na litr jako kontrolę. Przygotuj jeden mililitr pożywki wirusowej GFP, trzy mililitry kultury, pożywki i poli mózgu w końcowym stężeniu sześciu mikrogramów na mililitr. Odessać pożywkę z płytki zawierającej ludzkie fibroblasty.

Następnie dodać cztery mililitry zmieszanej pożywki wirusowej lub pożywki kontrolnej, odwirować płytki w temperaturze 1600 G przez jedną godzinę w temperaturze 20 stopni Celsjusza po odwirowaniu. Inkubować płytki przez około 12 godzin. Następnie zastąp pożywkę wirusową pożywką hodowlaną fibroblastów i inkubuj przez kolejne 12 godzin.

Powtórz ten proces od infekcji do hodowli w pożywce fibroblastowej, dwa razy więcej po ostatniej infekcji. Hodowla fibroblastów w DMEM przez 48 godzin. Następnie należy sprawdzić skuteczność zakażenia transdukcji równoległych pożywką retrowirusową GFP.

Następnie zainicjować przeprogramowanie z komórek somatycznych na pluripotencjalne. Zakażone fibroblasty są hodowane w pożywce dla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych lub pożywce HES dla mysich fibroblastów embrionalnych lub MEF o gęstości około dwa razy 10 do piątej komórki na studzienkę żelatyny poddanej działaniu środka. Sześciodołkowa płytka w pożywce wzrostowej fibroblastów następnego dnia.

Podziel zakażone ludzkie fibroblasty za pomocą 0,05% trypiny EDTA i wysiew je w gęstości około 1,2 razy 10 do czwartej na dołek w pożywce wzrostowej fibroblastów. Następnego dnia. Zastąp pożywkę pożywką HES zawierającą 0,5 milimolowego maślanu sodu przez pierwsze siedem dni przeprogramowania.

Zmieniaj medium codziennie. Zastąp pożywkę pożywką HES bez maślanu sodu i kontynuuj przeprogramowywanie przez dodatkowe siedem do 21 dni. Zmieniaj podłoże codziennie każdego dnia.

Sprawdź transdukowane komórki pod kątem zmian morfologicznych. Kolonie komórek zaczną się pojawiać po około 10 dniach od przeniesienia transdukowanych fibroblastów na komórki zasilające. Kolonie zawierające przeprogramowane komórki są obecnie określane jako ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste lub ludzkie komórki IPS.

Ludzkie kolonie komórek IPS będą gotowe do wyizolowania w ciągu 14 do 28 dni po posianiu ich na komórkach zasilających MEF. Na tym etapie ludzkie kolonie komórek IPS mogą być przenoszone na płytki zawierające MEF lub pokryte matrigelem. Przeniesienie na płytki zawierające MEF wykazano na dzień przed pobraniem ludzkich kolonii komórek IPS Nasiona 24-dołkowe zawierające promieniowane promieniowaniem gamma komórki zasilające MEF w pożywce wzrostowej fibroblastów.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2 w dniu, w którym zostaną pobrane ludzkie kolonie komórek IPS. Odessać pożywkę wzrostową fibroblastów z ME F i przepłukać je PBS, aby usunąć wszelkie ślady FBS. Następnie dodaj 0,5 mililitra ludzkiej embrionalnej komórki macierzystej lub pożywki HES zawierającej 10 inhibitorów skał mikromolowych Y 2 7 6 3 2 do każdej studzienki, a następnie, za pomocą mikroskopu zamontowanego w okapie z przepływem laminarnym, zbadaj płytki przeprogramowujące pod kątem tworzenia kolonii ludzkich komórek IPS.

W razie potrzeby usuń fibroblasty otaczające kolonie ludzkich komórek IPS za pomocą igły o rozmiarze 21. Przepłukać płytki PBS i dodać świeżą pożywkę HES zawierającą TRA 180 1 przeciwciało specyficzne dla barwienia żywcem. Włóż komórki z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2.

Po 30 minutach zastąp pożywkę świeżą pożywką HES uzupełnioną 10 mikromolowym inhibitorem skał. Następnie obejrzyj kolonie pod mikroskopem fluorescencyjnym. Oznacz TRA od jednej do 81 dodatnich kolonii.

Za pomocą znacznika obiektywu za pomocą igły o rozmiarze 21. Pokrój TRA 180 1 dodatnie kolonie ludzkich komórek IPS na kilka małych kawałków. Następnie, za pomocą automatycznej pipety, przenieś fragmenty ludzkich kolonii komórek IPS do indywidualnych dołków płytki 24-dołkowej za pomocą ME Fs. Unikaj przenoszenia komórek innych niż IPS.

Umieść płytki w inkubatorze i pozwól koloniom ludzkich komórek IPS przyłączyć się na 24 do 36 godzin, zmieniaj podłoże codziennie. Ludzkie kolonie komórek IPS o prawidłowej morfologii podobnej do HE będą widoczne 48 godzin po początkowym przeniesieniu na 24-dołkową płytkę, ręcznie przechodzą ludzkie kolonie komórek IPS co sześć do ośmiu dni, przecinając je płytką igłą o rozmiarze 21. Ekspansja kultur na 12-dołkową płytkę, a następnie na sześciodołkowej płytce po ekspansji klonalnej

Ustanawiając ludzkie linie komórkowe IPS, analizuj ekspresję markerów pluripotencji TRA, jeden, 60, SSEA, cztery, T, trzy, cztery, SOX, dwa i nanog za pomocą immunochemii, gdy linie zostaną ustalone. Szczegółowa charakterystyka może obejmować badania in vitro i in vivo. Analiza różnicowania, analiza kariotypu, analiza badań metylacji wyciszania transgenów i badania ekspresji genów.

Wydajna transdukcja za pomocą pożywki zawierającej retrowirusa ma kluczowe znaczenie dla skutecznego przeprogramowania w celu określenia skuteczności transdukcji wirusa. Dorosłe ludzkie fibroblasty pochodzące od pacjenta z ataksją Friedrichsa uwidoczniono po dwóch kolejnych infekcjach pożywką retrowirusową GFP, gdy fibroblasty zostały zakażone przez prostą inkubację z pożywką wirusową, mniej niż 20% komórek jest transdukowanych. Jednak, gdy natychmiast po dodaniu pożywki retrowirusowej GFP nastąpiła intensywna transdukcja, skuteczność transdukcji znacznie wzrosła.

Tutaj ponad 80% komórek jest transdukowanych w celu przeprowadzenia wstępnej charakterystyki izolowanych ludzkich kolonii komórek IPS. Ekspresję markerów pluripotencji charakterystycznych dla ludzkich komórek ES oceniano za pomocą immunochemii, jak pokazano tutaj. Izolowane ludzkie kolonie komórek IPS były dodatnie dla markerów pluripotencji.

T trzy cztery SOX dwa nano SSEA cztery i TRA jeden 60 DNA. Ponieważ barwienie DPI z DPI pokazane na górnych panelach jest wykrywane zarówno w ludzkich koloniach komórek IPS, jak i w komórkach zasilających. Wyniki te pokazują, że ludzkie komórki IPS uzyskane za pomocą tego protokołu przeprogramowania wyrażają odpowiednie markery pluripotencji charakterystyczne dla niezróżnicowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie przeprogramować ludzkie fibroblasty w pluripotencjalne komórki macierzyste za pomocą transakcji retrowirusowej, zidentyfikować prawidłową ludzką indukcję, pluripotencjalne kolonie komórek macierzystych i przeprowadzić wstępną charakterystykę HI PC.