Name: Selekcja i izolacja kolonii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przeprogramowanych z dorosłych fibroblastów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 23 s
Description: Poznaj protokół reprogramowania ludzkich fibroblastów dorosłych w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste hiPSC przy użyciu wektorów retrowirusowych. Metoda obejmuje transfekcję czynnikami transkrypcyjnymi, identyfikację kolonii za pomocą przeciwciała TRA-1-81 oraz ekspansję na komórkach podporowych MEF.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez Friedreich’s Ataxia Research Alliance oraz grant pilotażowy od Arnold Family Foundation i The Center for Stem Cells and Developmental Biology w M.D. Anderson Cancer Center.

1. Produkcja i transdukcja wirusa
<ol>
	<li>Wysiać komórki Phoenix Ampho w gęstości ~7-8x106 na płytkę 10 cm w 10 ml pożywki DMEM (DMEM high glucose, 10% FBS inaktywowanego ciepłem, 2 mM L-glutaminy, bez antybiotyków). Umieścić w inkubatorze i hodować przez noc w temperaturze 37°C, 5% CO22.</li>
	<li>Następnego dnia przeprowadź transfekcję komórek Phoenix, używając 12 μg wektora kodującego gen Oct3/4, Sox2, Klf4, c-myc lub GFP (plazmidy Addgene 17217, 17218, 17219, 17220) oraz 35 μl Fugene 6. Przygotować mieszaninę do transfekcji w 500 μl pożywki DMEM (DMEM z wysoką zawartością glukozy, 2 mM L-glutaminy, bez FBS i antybiotyków). Inkubować przez 20 min. Delikatnie nanieść kompleksy DNA pipetą na płytki 10 cm zawierające komórki Phoenix o konfluencji 70-80%.</li>
	<li>Wymień medium 6–8 h po transfekcji na medium DMEM (DMEM z wysoką zawartością glukozy, 10% FBS inaktywowanego termicznie, 2 mM L-glutaminy) zawierające penicylinę i streptomycynę.</li>
	<li>Następnie należy zebrać medium zawierające wirusa czterokrotnie w odstępach 12-godzinnych, połączyć wszystkie frakcje i przefiltrować za pomocą 0.45 μm przefiltrować w celu usunięcia oderwanych komórek i resztek komórkowych (pożywkę zawierającą cząsteczki wirusowe można przechowywać w lodówce przez 2 tygodnie bez utraty aktywności infekcyjnej, jednak mrożenie nie jest zalecane).</li>
	<li>W celu transdukcji retrowirusowej, 24 godziny przed ostatnim dniem pobierania pożywki z retrowirusami, wysiać ludzkie fibroblasty dorosłego człowieka (pasaż 10, Coriell Laboratories) z zamrożonego banku komórek. Komórki wysiać na płytki 6-dołkowe pokryte żelatyną z gęstością 1x105 liczba komórek na dołek w pożywce DMEM z wysoką zawartością glukozy, 10% FBS, 2 mM L-glutaminą, penicyliną, streptomycyną oraz nieistotnymi aminokwasami.</li>
	<li>Następnego dnia należy wymienić pożywkę DMEM na pożywkę zawierającą cząsteczki wirusowe otrzymane z komórek Phoenix. Należy dodać pożywkę z wirusem (po 1 ml pożywki dla każdego z czynników: Oct4, Sox2, Klf4 i c-myc, łącznie 4 ml), uzupełnioną o 6 μg/ml polybrene do każdego dołka płytki 6-dołkowej z kulturami fibroblastów i odwiruj przy 1600 g przez 1 h w temperaturze 20°COkoło 12 h po transdukcji należy wymienić pożywkę wirusową na pożywkę do hodowli fibroblastów. Infekcję wirusową oraz wirowanie należy przeprowadzić 3 razy w odstępach 24-godzinnych.</li>
	<li>hodować fibroblasty w medium DMEM przez 48 h po ostatniej infekcji. Sprawdzić wydajność infekcji poprzez równoległe transdukcje medium retrowirusowym wykazującym ekspresję GFP. Rycina 1 przedstawia wydajność wspomaganej odwirowaniem infekcji retrowirusowej fibroblastów ludzkich.</li>
</ol>
2. Reprogramowanie
<ol>
	<li>Przygotować płytki 6-dołkowe z warstwami pożywkowymi MEF naświetlonych promieniami γ, wysiewając komórki MEF w gęstości ~2x105 komórek na dołek w płytce 6-dołkowej potraktowanej żelatyną, w pożywce do wzrostu fibroblastów. Następnego dnia rozdzielić zainfekowane ludzkie fibroblasty przy użyciu 0,05% trypsyny/EDTA i wysiać je w gęstości ~1,2x104 na dołek w pożywce do wzrostu fibroblastów.</li>
	<li>Następnego dnia wymienić pożywkę na pożywkę hES (DMEM/F12, 20% Knockout Serum Replacement, aminokwasy nieessentialne, penicylina/streptomycyna, 2 mM L-glutaminy, 0,1 mM β-merkaptoetanolu, 20 ng/ml podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF), uzupełnioną o 0,5 mM maślanu sodu przez pierwsze 7 dni reprogramowania). Pożywkę wymieniać codziennie.</li>
	<li>Codziennie monitorować zmiany morfologiczne w transdukowanych komórkach. Kolonie komórek typu hiPS zaczną pojawiać się mniej więcej 5–10 dni po przeniesieniu transdukowanych fibroblastów na komórki pożywkowe. Kolonie hiPSC są gotowe do izolacji około 14–28 dni po wysianiu ich na warstwę pożywkową MEF.</li>
</ol>
3. Izolacja kolonii hiPSC
<ol>
	<li>Na dzień przed pobraniem kolonii hiPSC przygotuj płytki 24-dołkowe z naświetlanymi γ-promieniowaniem komórkami żYWnymi MEF (~4x104 komórek na dołek) w pożywce do wzrostu fibroblastów. Na tym etapie kolonie hiPSC można również przenieść do hodowli bez warstwy karmnej, wykorzystując Matrigel oraz pożywkę mTeSR1.</li>
	<li>Przed izolacją kolonii hiPSC przygotuj płytki z MEF, usuwając pożywkę do wzrostu fibroblastów i płucząc MEF w PBS w celu usunięcia śladów FBS. Następnie do każdego dołka dodaj 0,5 ml pożywki hES (lub pożywki mTeSR1 w przypadku dołków pokrytych Matrigelem) z dodatkiem 10 μM inhibitora ROCK Y27632 7,8.</li>
	<li>W razie potrzeby usuń fibroblasty otaczające kolonie hiPSC za pomocą igły 21G pod mikroskopem zamontowanym w komorze z laminarnym przepływem powietrza (Rysunek 2A - C). Przepłucz płytki PBS i dodaj świeżą pożywkę hES zawierającą swoiste przeciwciało StainAlive przeciwko Tra-1-81 (1:200, Stemgent). Po 30 min. zastąp pożywkę z przeciwciałem świeżą pożywką hES uzupełnioną o 10 μM inhibitora ROCK. Obejrzyj płytki pod mikroskopem fluorescencyjnym i zaznacz kolonie pozytywne pod kątem Tra-1-81 za pomocą markera zewnętrznego (Rysunek 2D).</li>
	<li>Pod mikroskopem w komorze laminarnej podziel pozytywne pod kątem Tra-1-81 kolonie hiPSC na kilka małych fragmentów, używając igły 21G, jak pokazano na Rysunkach 2E i F.</li>
	<li>Za pomocą pipety automatycznej (P200) przenieś fragmenty kolonii hiPSC do poszczególnych dołków płytki 24-dołkowej z MEF lub Matrigelem. Unikaj przenoszenia komórek innych niż hiPS. Umieść płytki w inkubatorze w temperaturze 37°C i przy 5% CO2, pozwalając koloniom hiPSC przytwierdzić się przez 24-36 h.</li>
	<li>Codziennie wymieniaj pożywkę hES lub mTeSR1 (dla kolonii hodowanych na Matrigelu). Kolonie hiPSC o prawidłowej morfologii przypominającej hES będą widoczne 48 h po pierwotnym przeniesieniu na płytkę 24-dołkową.</li>
	<li>Ręcznie pasażuj kolonie hiPSC co 6-8 dni na płytkę 12-dołkową, a następnie na płytkę 6-dołkową.</li>
	<li>Po ekspansji klonalnej i ustanowieniu linii hiPSC przeanalizuj ekspresję markerów pluripotencji TRA-1-60, SSEA-4, Oct3/4, Sox2 i Nanog za pomocą immunocytochemii, jak pokazano na Rysunku 3. Oceń integralność genomową i potencjał różnicowania uzyskanych linii za pomocą analiz kariotypu i tworzenia teratoma 6,9.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Wydajna transdukcja przy użyciu mediów zawierających retrowirusy jest kluczowa dla pomyślnego przeprogramowania. Zaleca się przeprowadzanie całej procedury transfekcji/infekcji z użyciem wirusa wykazującego ekspresję GFP podczas każdego pojedynczego eksperymentu z przeprogramowaniem, aby monitorować wydajność, jak pokazano na Rysunku 1. Miano wirusa wykazującego ekspresję GFP, wyznaczone zgodnie z opisem w 10 poprzez transdukcję ludzkich fibroblastów przy użyciu niekoncentrowanych mediów wirusowych, mieściło się zazwyczaj w zakresie 0,5 - 5 x 107 cząsteczek wirusowych na ml (vp/ml).
Fibroblasty zmieniają morfologię już 2 dni po ostatniej infekcji. Trypsynizowane ludzkie fibroblasty należy starannie policzyć przed wysianiem ich na warstwę komórek dokarmiających MEF. Zaleca się wysiewanie komórek w 3 różnych gęstościach (6x103, 1,2x104, 2,5x104 na pojedynczą studzienkę płytki 6-dołkowej), ponieważ każda linia komórkowa wykazuje inną charakterystykę wzrostu, a gęstość wysiewu jest krytyczna dla wydajności reprogramowania. Maślan sodu stosowany przez pierwsze 7 – 14 dni reprogramowania zwiększa wydajność tworzenia hiPSC około 5-krotnie. Często, zwłaszcza gdy zainfekowane fibroblasty zostały wysiane w wyższej gęstości, komórki fibroblastopodobne mogą nadmiernie rozrosnąć się w naczyniu hodowlanym i przykryć kolonie hiPSC, jak pokazano na Rysunku 2A. W takim przypadku warstwę fibroblastów można ostrożnie zdjąć i usunąć, aby odsłonić kolonie hiPSC (Rysunek 2B). Następnie kolonie hiPSC należy przepłukać medium hES i zabarwić przeciwciałem Tra-1-81. W zależności od komórek fibroblastów, około 20 – 40% kolonii wykazujących morfologię typu iPSC nie barwi się przeciwciałem Tra-1-81. Zidentyfikowane kolonie hiPSC można przenieść z płytki w ciągu kolejnych 12 – 24 h. Przedłużona inkubacja doprowadzi do szybkiej różnicowania hiPSC. Kolonie można pasażować ręcznie na komórki dokarmiające MEF lub płytki powlekane Matrigelem. Po ekspansji ustalone klony hiPSC powinny zostać przebadane za pomocą immunocytochemii (ICC) pod kątem ekspresji markerów pluripotencji, jak przedstawiono na Rysunku 3. Dodatkowo szczegółowa charakterystyka molekularna wygenerowanych linii komórek iPSC powinna obejmować: analizy ekspresji genów pluripotencji za pomocą RT-PCR, wykazanie demetylacji DNA w promotorach genów pluripotencji oraz analizy wyciszania transgenów 9.
 
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna hodowlanych komórek; obrazy przedstawiają morfologię komórek i analizę ekspresji GFP." src="/files/ftp_upload/3416/3416fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Efektywność transdukcji wirusowej określona przy użyciu retrowirusa wykazującego ekspresję GFP. (A, B) Ludzkie fibroblasty dorosłych pochodzące od pacjenta z ataksją Friedreicha (GM03665, Coriell Repository) zobrazowano po dwóch następujących po sobie infekcjach medium retrowirusowym GFP. (C, D) Ludzkie fibroblasty zainfekowano tą samą partią medium retrowirusowego GFP, a następnie poddano wirowaniu komórek bezpośrednio na płytkach 6-dołkowych przez 1h przy 1600g. Obrazy zarejestrowano 48h po infekcji.
<img alt="Kultury komórkowe pod mikroskopem; sześć obrazów przedstawiających morfologię i fluorescencję, skala od 20-100μm." src="/files/ftp_upload/3416/3416fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Identyfikacja i izolacja kolonii hiPSC. (A) Obraz w kontraście fazowym płytki zawierającej hiPSC otoczone fibroblastami. Komórki były hodowane przez 21 dni na pożywce hES. (B, C) Ta sama kolonia hiPSC po usunięciu otaczającej warstwy fibroblastów. (D) Prawidłowo przeprogramowane kolonie hiPSC są identyfikowane za pomocą barwienia żywych komórek przeciwciałem do markera powierzchniowego Tra-1-81, wycinane za pomocą sterylnej igły (E, F) i przenoszone do oddzielnych studni płytki 24-dołkowej.
<img alt="Analiza immunofluorescencyjna markerów komórek macierzystych; barwienie Oct3/4, Sox, Nanog, SSEA4, Tra-1-60, DAPI." src="/files/ftp_upload/3416/3416fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Ekspresję markerów specyficznych dla pluripotencji Oct3/4, Nanog, Sox2, SSEA4 oraz Tra-1-60 w hiPSC określono za pomocą immunocytochemii.

<ol><li>Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Mali, P., Chou, B. K., Yen, J., Ye, Z., Zou, J., Dowey, S., Brodsky, R. A., Ohm, J. E., Yu, W., Baylin, S. B., Yusa, K., Bradley, A., Meyers, D. J., Mukherjee, C., Cole, P. A., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Butyrate+greatly+enhances+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+promoting+epigenetic+remodeling+and+the+expression+of+pluripotency-associated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes.</a> Stem Cells. 28, 713-720 (2011).</li>
<li>Wernig, M., Meissner, A., Foreman, R., Brambrink, T., Ku, M., Hochedlinger, K., Bernstein, B. E., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448, 318-324 (2007).</li>
<li>Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., Pyle, A. D., Tchieu, J., Sridharan, R., Clark, A. T., Plath, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).</li>
<li>Dick, E., Matsa, E., Bispham, J., Reza, M., Guglieri, M., Staniforth, A., Watson, S., Kumari, R., Lochmuller, H., Young, L., Darling, D., Denning, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+new+protocols+to+enhance+the+production+and+isolation+of+human+induced+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Two new protocols to enhance the production and isolation of human induced pluripotent stem cell lines.</a> Stem Cell Res. 6, 158-167 (2011).</li>
<li>Ku, S., Soragni, E., Campau, E., Thomas, E. A., Altun, G., Laurent, L. C., Loring, J. F., Napierala, M., Gottesfeld, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friedreich%27s+ataxia+induced+pluripotent+stem+cells+model+intergenerational+GAATTC+triplet+repeat+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Friedreich's ataxia induced pluripotent stem cells model intergenerational GAATTC triplet repeat instability.</a> Cell Stem Cell. 7, 631-637 (2010).</li>
<li>Emre, N., Vidal, J. G., Elia, J., O'Connor, E. D., Paramban, R. I., Hefferan, M. P., Navarro, R., Goldberg, D. S., Varki, N. M., Marsala, M., Carson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ROCK+inhibitor+Y-27632+improves+recovery+of+human+embryonic+stem+cells+after+fluorescence-activated+cell+sorting+with+multiple+cell+surface+markers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers.</a> PLoS One. 5, e12148-e12148 (2011).</li>
<li>Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li>
<li>Maherali, N., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).</li>
<li>Yu, J., Thomson, J. A. Induced Pluripotent Stem Cell Derivation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYu%2C+J+%22Essentials+of+Stem+Cell+Biology%22">Essentials of Stem Cell Biology</a>. Lanza, R. , Elsevier Inc. 331-337 (2009).</li>
<li>Yu, J., Hu, K., Smuga-Otto, K., Tian, S., Stewart, R., Slukvin, I. I., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li>
<li>Woltjen, K., Michael, I. P., Mohseni, P., Desai, R., Mileikovsky, M., Hamalainen, R., Cowling, R., Wang, W., Liu, P., Gertsenstein, M., Kaji, K., Sung, H. K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+transposition+reprograms+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 458, 766-770 (2009).</li>
<li>Zhou, W., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+gene+delivery+can+reprogram+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).</li>
<li>Warren, L., Manos, P. D., Ahfeldt, T., Loh, Y. H., Li, H., Lau, F., Ebina, W., Mandal, P. K., Smith, Z. D., Meissner, A., Daley, G. Q., Brack, A. S., Collins, J. J., Cowan, C., Schlaeger, T. M., Rossi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+reprogramming+to+pluripotency+and+directed+differentiation+of+human+cells+with+synthetic+modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).</li>
<li>Kim, D., Kim, C. H., Moon, J. I., Chung, Y. G., Chang, M. Y., Han, B. S., Ko, S., Yang, E., Cha, K. Y., Lanza, R., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li>
<li>Han, S. S., Williams, L. A., Eggan, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+and+deconstructing+stem+cell+models+of+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Constructing and deconstructing stem cell models of neurological disease.</a> Neuron. 70, 626-644 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych informacji do ujawnienia.

Badanie chorób ludzkich, zwłaszcza neurologicznych i neurodegeneracyjnych, było szczególnie trudne ze względu na brak dostępu do odpowiednich ludzkich modeli komórkowych. Możliwość przeprogramowania łatwo dostępnych komórek somatycznych w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste oraz potencjał do ich różnicowania w różnorodne typy komórek otworzyły możliwość tworzenia modeli komórkowych chorób genetycznych. Ponadto iPSC niosą ze sobą wielką obietnicę dla przyszłości medycyny regeneracyjnej. Dlatego kluczowe jest o...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>KSR</td><td>Invitrogen</td><td>10828</td><td></td></tr><tr><td>Niezbędne aminokwasy</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Maślan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Stemgent</td><td>04-0012</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Stemgent</td><td>03-0002</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Tra-1-81</td><td>Stemgent</td><td>09-0069</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Oct3/4</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-8628</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Nanog</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4903S</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Tra-1-60</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4360</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Sox2</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3579S</td><td></td></tr><tr><td>SSEA4</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>CF1 MEFs</td><td>Globalstem</td><td>GSC-6201G</td><td></td></tr><tr><td>Marker obiektywu</td><td>Nikon Instruments</td><td>MBW10010</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel </td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05850</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Fugene 6</td><td>Roche Group</td><td>11814443001</td><td></td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>Marker obiektu</td><td>Nikon Instruments</td><td>MBW10010</td><td></td></tr></tbody></table>

wybór i izolacja kolonii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przeprogramowanych z fibroblastów dorosłych

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

W niniejszej pracy przedstawiamy protokół przeprogramowania ludzkich fibroblastów dorosłych w ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) przy użyciu wektorów retrowirusowych kodujących Oct3/4, Sox2, Klf4 i c-myc (OSKM) w obecności maślanu sodu 1-3. Metodę tę zastosowaliśmy do przeprogramowania ludzkich fibroblastów dorosłych o późnym pasażu (&gt;p10) pochodzących od pacjenta z ataksją Friedreicha (GM03665, Coriell Repository). Podejście do przeprogramowania obejmuje wysoce wydajny protokół transdukcji z wykorzystaniem powtarzalnego wirowania fibroblastów w obecności pożywek zawierających wirusa. Przeprogramowane kolonie hiPSC zidentyfikowano za pomocą immunobarwienia żywych komórek na Tra-1-81, marker powierzchniowy komórek pluripotencjalnych, oddzielono od nieprzeprogramowanych fibroblastów i poddano ręcznemu pasażowaniu 4,5. Następnie hiPSC przeniesiono na płytki z Matrigel i hodowano w warunkach bez fibroblastów pokarmowych (feeder-free), bezpośrednio z płytki do przeprogramowania. Od pierwszego pasażu kolonie hiPSC wykazują charakterystyczną morfologię przypominającą ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hES). Stosując ten protokół, ponad 70% wybranych kolonii można pomyślnie rozwinąć i ustanowić jako linie komórkowe. Ustanowione linie hiPSC wykazywały charakterystyczne markery pluripotencji, w tym markery powierzchniowe TRA-1-60 i SSEA-4, a także markery jądrowe Oct3/4, Sox2 i Nanog. 
Przedstawiony tutaj protokół został opracowany i przetestowany z użyciem fibroblastów dorosłych pobranych od pacjentów z ataksją Friedreicha oraz osób z grupy kontrolnej 6, ludzkich fibroblastów noworodkowych, a także ludzkich keratynocytów.

Przedstawiamy protokół efektywnego przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych w ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) przy użyciu wektorów retrowirusowych kodujących Oct3/4, Sox2, Klf4 i c-myc (OSKM) oraz metodę identyfikacji prawidłowo przeprogramowanych hiPSC poprzez barwienie żywych komórek przeciwciałem Tra-1-81.

Wybór i izolacja kolonii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przeprogramowanych z fibroblastów dorosłych

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół przeprogramowania ludzkich fibroblastów dorosłych w ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) przy użyciu wektorów retrowirusowych kodujących ...

W niniejszym artykule wideo przedstawiono przeprogramowanie ludzkich dojrzałych fibroblastów w celu uzyskania pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu wektorów retrowirusowych. W pierwszej kolejności fibroblasty ludzkie poddaje się transdukcji wektorami retrowirusowymi kodującymi czynniki transkrypcyjne: T three four, SOX two, KLF four oraz cmic.Zainfekowane fibroblasty hoduje się na embrionalnych komórkach żerujących myszy przez okres od 14 do 28 dni. Powstałe kultury barwi się przeciwciałem TRA 180 1 w celu zidentyfikowania kolonii przeprogramowanych komórek. Pozytywne kolonie przenosi się następnie na płytki zawierające MEF w celu ich ekspansji.Barwienie immunocytochemiczne potwierdza ekspresję markerów pluripotencji oraz ustanowienie linii pluripotencjalnych komórek macierzystych. Następnie należy przeprowadzić dodatkowe badania w celu dalszej charakterystyki tych linii. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z programowaniem komórek somatycznych i kulturami ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych napotykają trudności, ponieważ identyfikacja prawidłowych kolonii iPSC jest wymagająca.Procedurę zaprezentuje dr Sula Pollak, post-doc z mojego laboratorium. Procedurę należy rozpocząć od wysiania komórek Phoenix AM FO z gęstością około 7 do 8 milionów komórek na płytkę 10 cm w 10 ml DMEM z wysoką zawartością glukozy; następnie płytki należy umieścić w inkubatorze i hodować przez noc. Następnego dnia należy przygotować mieszaniny do transfekcji składające się z 12 µg wektora kodującego gen T34SOX, 2KLF, 4CMIC lub GFP oraz 35 µl FuGENE 6 w całkowitej objętości 500 µl bezserwatkowego DMEM z wysoką zawartością glukozy i L-glutaminą.Inkubuj mieszaniny przez 20 minut. Następnie, aby przeprowadzić transfekcję komórek phoenix, delikatnie pipetuj kompleksy DNA do płytek zawierających komórki phoenix, które powinny osiągnąć 70 do 80% konfluencji. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez sześć do ośmiu godzin.Odssać pożywkę i zastąpić ją ośmioma mililitrami DMEM z wysoką zawartością glukozy i antybiotykami. Następnie umieścić płytki w inkubatorze na 12 godzin po inkubacji. Za pomocą pipety odessać i zebrać pożywkę zawierającą wirusa.Następnie wymień pożywkę i powtarzaj ten proces co 12 godzin, aż do momentu czterokrotnego zebrania pożywki. Przechowuj pożywkę w temperaturze 4 °C. Po zebraniu całej pożywki połącz wszystkie porcje, a następnie przefiltruj ją przez filtr nakrętkowy o wielkości porów 0,45 µm do probówki stożkowej o pojemności 50 mL, aby usunąć oderwane komórki i zanieczyszczenia.Przefiltrowane medium zawierające cząsteczki wirusa można przechowywać w lodówce przez dwa tygodnie bez utraty aktywności infekcyjnej. Zamrażanie nie jest zalecane. Dzień przed procedurą transdukcji należy rozmrozić zamrożony zapas ludzkich fibroblastów dorosłego człowieka i dodać 1 × 10⁵ komórek do każdego dołka sześciodołkowych płytek pokrytych żelatyną.Następnego dnia w 50 mililitrowej probówce stożkowej połączyć po 3,5 mililitra T four SOX two, klf four oraz medium wirusowego cmic, a następnie dodać poly brain do końcowego stężenia 6 µg/L jako kontrolę. Przygotować 1 mililitr medium wirusowego GFP, 3 mililitry medium hodowlanego oraz poly brain w końcowym stężeniu 6 µg/mL. Odessać medium z płytki zawierającej ludzkie fibroblasty.Następnie dodać 4 mL mieszanego medium wirusowego lub medium kontrolnego i wirować płytki z prędkością 1600 G przez jedną godzinę w temperaturze 20 °C. Po wirowaniu inkubować płytki przez około 12 godzin. Następnie zastąpić medium wirusowe medium do hodowli fibroblastów i inkubować przez kolejne 12 godzin.Powtórz ten proces od momentu infekcji do hodowli w pożywce dla fibroblastów jeszcze dwa razy po ostatniej infekcji. Hoduj fibroblasty w DMEM przez 48 godzin. Następnie sprawdź wydajność infekcji równoległych transdukcji za pomocą pożywki retrowirusowej z GFP.Następnie należy zainicjować reprogramowanie komórek somatycznych do pluripotencjalnych. Zainfekowane fibroblasty hoduje się w medium dla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych lub medium HES. W kolejnym dniu wysiewa się embrionalne fibroblasty mysie lub MEF z gęstością około 2 × 10⁵ komórek na studzienkę w sześciostudzienkowej płytce potraktowanej żelatyną, w medium wzrostowym dla fibroblastów.Przesiąć zainfekowane ludzkie fibroblasty, używając 0,05% trypsyny EDTA, i wysiać je z gęstością około 1,2 × 10⁴ na studzienkę w pożywce do wzrostu fibroblastów. Następnego dnia wymienić pożywkę na pożywkę HES zawierającą 0,5 mM maślanu sodu przez pierwsze siedem dni reprogramowania.Wymieniaj pożywkę codziennie. Zastąp pożywkę pożywką HES bez maślanu sodu i kontynuuj reprogramowanie przez kolejne od 7 do 21 dni. Wymieniaj pożywkę każdego dnia.Sprawdź transdukowane komórki pod kątem zmian morfologicznych. Kolonie komórek zaczną pojawiać się około 10 dni po przeniesieniu transdukowanych fibroblastów na komórki wspomagające. Kolonie zawierające przeprogramowane komórki są od tego momentu nazywane ludzkimi indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi lub ludzkimi komórkami iPS.Kolonie ludzkich komórek iPS będą gotowe do izolacji od 14 do 28 dni po wysianiu ich na komórki zasilające MEF. Na tym etapie kolonie ludzkich komórek iPS można przenieść na płytki zawierające MEF lub płytki pokryte matrigelem. Przenoszenie na płytki zawierające MEF zostało zademonstrowane dzień przed pobraniem kolonii ludzkich komórek iPS. Wysiej płytki 24-dołkowe zawierające naświetlone promieniami gamma komórki zasilające MEF w pożywce do wzrostu fibroblastów.Inkubować w temperaturze 37°C przy 5% CO2 w dniu, w którym będą pobierane kolonie ludzkich komórek iPS. Odessać pożywkę do wzrostu fibroblastów z ME Fs i wypłukać je za pomocą PBS, aby usunąć wszelkie ślady FBS. Następnie dodać 0,5 ml pożywki dla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (HES) zawierającej 10 µM inhibitora ROCK Y 2 7 6 3 2 do każdej studzienki; następnie, używając mikroskopu zamontowanego w komorze z laminarnym przepływem powietrza, sprawdzić płytki do reprogramowania pod kątem tworzenia się kolonii ludzkich komórek iPS.W razie potrzeby usunąć fibroblasty otaczające kolonie ludzkich komórek IPS za pomocą igły 21G. Przepłukać płytki za pomocą PBS i dodać świeże medium HES zawierające specyficzne przeciwciało TRA 180 1 stain alive. Przenieść komórki z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 °C z 5%CO2.Po 30 minutach należy wymienić pożywkę na świeżą pożywkę HES uzupełnioną o 10 µM inhibitora ROCK. Następnie należy obejrzeć kolonie pod mikroskopem fluorescencyjnym i zaznaczyć kolonie pozytywne pod kątem TRA-1-81.Używając znacznika obiektywnego z igłą 21 G, podziel kolonie ludzkich komórek iPS TRA 180 1+ na kilka małych fragmentów. Następnie, za pomocą automatycznej pipety, przenieś fragmenty kolonii ludzkich komórek iPS do poszczególnych studni płytki 24-dołkowej z MEFami. Unikaj przenoszenia komórek innych niż iPS.Umieść płytki w inkubatorze i pozostaw kolonie ludzkich komórek iPS na 24 do 36 godzin w celu ich przytwierdzenia, zmieniając pożywkę codziennie. Kolonie ludzkich komórek iPS o prawidłowej morfologii przypominającej HE będą widoczne 48 godzin po początkowym przeniesieniu na płytkę 24-dołkową. Przesiewaj kolonie ludzkich komórek iPS ręcznie co sześć do ośmiu dni, przecinając je igłą 21G. Po ekspansji klonalnej rozszerzaj hodowle na płytkę 12-dołkową, a następnie na płytkę 6-dołkową.Po wytworzeniu ludzkich linii komórek iPS należy przeanalizować ekspresję markerów pluripotencji TRA-1-60, SSEA-4, T, 3, 4, SOX2 oraz nanog za pomocą immunocytochemii. Szczegółowa charakterystyka może obejmować analizy różnicowania in vitro i in vivo, analizę kariotypu, analizę wyciszania transgenów, badania metylacji oraz badania ekspresji genów.Wydajna transdukcja medium zawierającym retrowirusy jest kluczowa dla skutecznego przeprogramowania w celu określenia efektywności transdukcji wirusowej. Ludzkie fibroblasty dorosłych pochodzące od pacjenta z ataksją Friedreicha zostały zobrazowane po dwóch kolejnych infekcjach medium retrowirusowym GFP; gdy fibroblasty były infekowane poprzez prostą inkubację z medium wirusowym, transdukcji uległo mniej niż 20% komórek. Jednakże, gdy po dodaniu mediów retrowirusowych GFP natychmiast zastosowano odpowiednią procedurę, wydajność transdukcji gwałtownie wzrosła.Tutaj ponad 80% komórek zostało przetransdukowanych w celu przeprowadzenia wstępnej charakterystyki izolowanych kolonii ludzkich komórek iPS. Ekspresję markerów pluripotencji charakterystycznych dla ludzkich komórek ES oceniono metodą immunochemiczną, jak pokazano tutaj. Izolowane kolonie ludzkich komórek iPS były pozytywne pod kątem markerów pluripotencji.T trzy cztery SOX dwa nano SSEA cztery i TRA jeden 60 DNA. Barwienie współistniejące z DPI widoczne na górnych panelach jest wykrywalne zarówno w koloniach ludzkich komórek iPS, jak i w komórkach zasilających. Wyniki te dowodzą, że ludzkie komórki iPS uzyskane za pomocą tego protokołu reprogramowania wykazują ekspresję odpowiednich markerów pluripotencji charakterystycznych dla niezróżnicowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie przeprogramować ludzkie fibroblasty w pluripotencjalne komórki macierzyste przy użyciu transdukcji retrowirusowej, zidentyfikować prawidłowe kolonie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych oraz przeprowadzić wstępną charakterystykę hiPSC.

selecting-isolating-colonies-human-induced-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wybór i izolacja kolonii ludzkich komórek pluripotencyjnych wywodzących się z komórek iPS przeprogramowanych z dorosłych fibroblastów

Przedstawiamy protokół generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych przy użyciu dostarczania czynników ludzkich Oct4, Sox2, Nanog i Lin28 za pomocą lentiwirusów. Pluripotencjalność potwierdzono na podstawie morfologii oraz obecności markerów specyficznych dla embrionalnych komórek macierzystych (ES).

Generowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych poprzez przeprogramowanie ludzkich fibroblastów za pomocą zestawu ludzkich lentiwirusów TF firmy Stemgent

Opisano metodę generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) poprzez transdukcję retrowirusową prowadzącą do ektopowej ekspresji czynników OCT4, SOX2, KLF4 i MYC. Omówiono również praktyczny sposób identyfikacji kolonii ludzkich iPSC na podstawie ekspresji GFP.

Reprogramowanie ludzkich komórek somatycznych w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) przy użyciu wektora retrowirusowego z GFP

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty i skuteczny protokół generowania ludzkich iPSC z 3-4 ml krwi obwodowej przy użyciu pojedynczego lentiwirusowego wektora reprogramującego. Reprogramowanie łatwo dostępnych komórek krwi daje nadzieję na przyspieszenie wykorzystania technologii iPSC poprzez udostępnienie jej szerszemu gronu badaczy.

Generowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu wektora lentiwirusowego STEMCCA

Ten film demonstruje technikę izolowania indukowanych nerwowych komórek progenitorowych (iNPC) pochodzących z dorosłych ludzkich fibroblastów. Przedstawiono w nim etapy związane z izolacją kolonii iNPC i hodowlą ich w wielodołkowych dołkach płytkowych pokrytych lamininą w obecności odpowiednich pożywek hodowlanych, które ułatwiają ciągłą proliferację i ekspansję populacji iNPC.

Izolowanie indukowanych kolonii nerwowych komórek progenitorowych pochodzących z fibroblastów dorosłego człowieka

Tutaj prezentujemy naszą sprawdzoną metodę przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych na wolne od transgenów ludzkie iPSC z wirusem Sendai, która wykazuje spójne wyniki i zwiększoną efektywność.

Wydajna generacja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych z wirusem Sendai

Opisujemy protokół wyprowadzania opartych na lentiwirusach, przeprogramowanych i scharakteryzowanych, bezczynnikowo indukowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i przekształcania ich w domniemane warunki kliniczne.

Uzyskanie i charakterystyka wolnej od transgenów indukowanej przez człowieka pluripotencjalnej linii komórek macierzystych i konwersja do określonych stanów klinicznych

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych dostarcza fascynujących perspektyw dla pochodnych autologicznych przeszczepów. Jednak progresja przez stan pluripotencjalny i pracochłonne różnicowanie nadal utrudnia translację kliniczną. Tutaj opisujemy pochodzenie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednią konwersję do indukowanych nerwowych komórek progenitorowych, a następnie różnicowanie w linie nerwowe.

Wyprowadzanie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednia konwersja do ekspandowalnych nerwowych komórek progenitorowych

Ten manuskrypt przedstawia krok po kroku procedurę pozyskiwania i utrzymywania ludzkich keratynocytów z wyrwanych włosów oraz późniejszej generacji wolnych od integracji ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) za pomocą wektorów epizodycznych.

Generowanie bezintegracyjnych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu keratynocytów pochodzących z włosów

Solidne pochodzenie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPS) zostało osiągnięte dzięki zastosowaniu nieintegrującego wirusa Sendai (SeV) wektorowego przeprogramowania fibroblastów skóry. Utrzymanie komórek hiPS i ekspansja klonalna przeprowadzono przy użyciu wolnych od ksenotypów i chemicznie zdefiniowanych warunków hodowli z rekombinowaną ludzką lamininą 521 (LN-521) i podłożem Essential E8 (E8).

Bezintegracyjne wyprowadzanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu matrycy Laminin 521

Tutaj opisujemy klinicznie istotną, wysoce wydajną, bezkarmową metodę przeprogramowania ludzkich pierwotnych fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste za pomocą zmodyfikowanych mRNA kodujących czynniki przeprogramowujące i dojrzałe mimiki mikroRNA-367/302. Uwzględniono również metody oceny efektywności przeprogramowania, ekspansji klonalnych kolonii iPSC i potwierdzenia ekspresji markera pluripotencji TRA-1-60.

Oparte na RNA przeprogramowanie ludzkich pierwotnych fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste

Przeprogramowanie komórek wymaga wprowadzenia kluczowych genów, które regulują i utrzymują pluripotencjalny stan komórki. Opisany protokół umożliwia tworzenie kolonii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z ludzkich fibroblastów skóry bez metod wirusowych/integrujących, ale przy użyciu niemodyfikowanych RNA (NM-RNA) w połączeniu z czynnikami unikania odporności zmniejszającymi mechanizmy obrony komórkowej.

Izolacja dorosłych ludzkich fibroblastów skórnych ze skóry brzucha i wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu metody nieintegrującej

Poznaj protokół reprogramowania ludzkich fibroblastów dorosłych w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste hiPSC przy użyciu wektorów retrowirusowych. Metoda obejmuje transfekcję czynnikami transkrypcyjnymi, identyfikację kolonii za pomocą przeciwciała TRA-1-81 oraz ekspansję na komórkach podporowych MEF.

Selekcja i izolacja kolonii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przeprogramowanych z dorosłych fibroblastów (Wideo) | JoVE Journal

Wybór i izolacja kolonii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przeprogramowanych z fibroblastów dorosłych

Przeglądaj więcej filmów