Charakterystyka elektrofizjologiczna populacji komórek wykazujących ekspresję GFP w nienaruszonej siatkówce
14 listopada 2011
Ten artykuł przedstawia zapis pojedynczych komórek z fluorescencyjnie oznaczonych populacji neuronów w nienaruszonej siatkówce myszy. Wykorzystując dwufotonowe wzbudzenie w podczerwieni, transgenetycznie znakowane komórki zostały wybrane do rejestracji patch-clamp w celu zbadania ich reakcji na światło, właściwości pola recepcyjnego i morfologii.
Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie reakcji na światło i morfologii pojedynczych neuronów w nienaruszonej siatkówce za pomocą linii myszy, która wyraża marker fluorescencyjny wyłącznie w określonych typach komórek. Osiąga się to poprzez najpierw preparację oka w celu uzyskania izolowanej siatkówki. Drugim krokiem jest umieszczenie siatkówki pod laserowym mikroskopem skaningowym i wizualizacja komórki za pomocą wzbudzenia dwoma fotonami w podczerwieni.
Następnie używa się mikropipety do uzyskania konfiguracji zacisku krosowego całej komórki do rejestrowania i napełniania barwnikiem. Ostatecznie preparat ten pozwala na rejestrację reakcji komórkowych na fotostymulację i ujawnia morfologię zarejestrowanej komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak niekierowany zapis z matrycy krosowej, jest to, że zapis może być wizualnie skierowany w stronę fluorescencyjnie znakowanej komórki bez stymulowania siatkówki światłem wzbudzającym.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach siatkówki, takie jak: jaki jest wkład danej populacji komórek w przetwarzanie informacji wizualnej? Nawet jeśli populacja komórek ma niską gęstość i nie ma żadnych wyraźnych cech morfologicznych, które mogłyby ułatwić identyfikację. Rozpocznij ten eksperyment od przystosowania myszy w ciemności przez co najmniej trzy godziny przed eksperymentem.
W międzyczasie należy przygotować roztwór zewnątrzkomórkowy zgodnie z opisem w dołączonym manuskrypcie i zbulgotać go karbogenem w temperaturze pokojowej. Następnie poświęć mysz i zarodkuj oczy za pomocą zakrzywionych nożyczek do tęczówki. Przenieś je do naczynia z roztworem zewnątrzkomórkowym.
Następnie umieść go pod mikroskopem preparacyjnym z nożyczkami sprężynowymi. Usuń rogówkę i ciało rzęskowe, otwierając bańkę oka wzdłuż aury serrata. Wyjmij soczewkę i ostrożnie oddziel siatkówkę od nabłonka barwnikowego.
Następnie przetnij nerw wzrokowy między siatkówką a nabłonkiem barwnikowym. Usuń siatkówkę z muszli ocznej. Zauważ, że wnętrze zwiniętej siatkówki jest stroną komórki zwojowej.
Na zewnątrz znajduje się strona fotoreceptorów. Następnie usuń ciało szkliste z wewnętrznej powierzchni siatkówki, delikatnie ściągając je za pomocą drewnianej wykałaczki. Następnie wykonaj krótkie nacięcia wzdłuż obwodu siatkówki, aby ułatwić spłaszczenie tkanki.
Następnie przenieś siatkówkę do komory rejestracyjnej stroną z fotoreceptorami skierowanymi w dół. Rozłóż go na szklanym dnie za pomocą cienkiej szczotki i unieruchamij nylonową ramą ze stali nierdzewnej. Umieść komorę zapisu w ciemności pod pionowym laserowym mikroskopem skaningowym.
Super połączyć preparat siatkówki w sposób ciągły z prędkością nie mniejszą niż pięć mililitrów na minutę. Po podgrzaniu do 35 stopni Celsjusza natlenionego roztworu zewnątrzkomórkowego mikroskop umieszcza się na amortyzującym stole powietrznym wewnątrz klatki Faradaya. W przypadku ekranowania elektronicznego przykryj klatkę nieprzezroczystą zasłoną, aby zachować przygotowanie i ciemność.
Światło z monitorów komputerowych odgradzamy również czerwonymi przezroczystymi foliami. Dostosuj laser na podczerwień do długości fal od 850 do 870 nanometrów lub dłuższych. Przełącz na stan zablokowany w trybie i użyj wzbudzenia dwóch fotonów, aby uwidocznić komórki wyrażające GFP.
W celu nagrania za pomocą patch clamp należy napełnić mikropipety ze szkła boro-krzemianowego roztworem wewnątrzkomórkowym zawierającym sondę fluorescencyjną, jak opisano w dołączonym manuskrypcie. Następnie włóż mikropipetę do uchwytu. Upewnij się, że elektroda referencyjna styka się z roztworem zewnątrzkomórkowym w komorze rejestracyjnej.
Następnie należy przyłożyć nacisk do docelowej mikropipety komórki eksprymującej GFP za pomocą 40-krotnego zanurzenia w wodzie Obiektywny, ciała komórek Omicron znajdują się w warstwie komórek zwojowych, a także w proksymalnej części warstwy interclear, zanim mikropipeta zetknie się z komórką docelową, aby przeniknąć przez wewnętrzną błonę ograniczającą na powierzchni siatkówki. Udana penetracja jest rozpoznawana przez roztwór wewnątrzkomórkowy, który jest wypychany z końcówki mikropipety i oderwanie wewnętrznej błony ograniczającej od leżącej poniżej tkanki siatkówki. Barwnik fluorescencyjny w roztworze wewnątrzkomórkowym może ujawnić położenie mikropipet na obrazie dwufotonowym podczas zbliżania się do pożądanej komórki.
Następnie zwolnij ciśnienie z mikropipety i uzyskaj konfigurację zacisku krosowego dla całej komórki. W obecnym trybie cęgowym użyteczne nagranie powinno dawać potencjał membrany od minus 50 do minus 55 miliwoltów i trwać co najmniej 20 minut. Następnie zaprezentuj bodźce wizualne wytworzone na monitorze komputera.
Dostosuj intensywność bodźca, wstawiając filtry o neutralnej gęstości do ścieżki wiązki i dostosuj położenie przestrzenne stymulacji do środka zarejestrowanej komórki. Następnie uruchom protokół stymulacji i zarejestruj reakcje świetlne. Użyj generatora bodźców, aby uruchomić oprogramowanie nagrywające.
Dołącz fotodiodę do ścieżki wiązki, aby rejestrować czas bodźca. Należy uważać, aby nie wyciągnąć korpusu ogniwa podczas wsuwania mikropipety. Po zakończeniu napełniania barwnikiem pozwól czynnikowi fluorescencyjnemu dyfundować do zarejestrowanej komórki przez 30 do 45 minut.
Oto przykład komórek wyrażających GFP w płaskim wierzchowcu siatkówki pod ich promotorem W przypadku hydroksylazy tyrozynowej można wyróżnić dwie populacje na podstawie jasności sygnału GFP. Komórki dopaminergiczne typu pierwszego, znajdujące się w warstwie międzyprzezroczystej, wyrażają słabą fluorescencję, jak pokazano za pomocą grotów strzałek. Na rysunku A. Komórki typu drugiego były intensywnie znakowane i mają ciała komórkowe albo w warstwie, jak pokazano strzałkami na rysunku A, albo przemieszczone w warstwie komórek zwojowych, jak pokazano na rysunku B, rysunek C pokazuje dendrytyczną stratyfikację komórek typu drugiego w warstwie trzeciej wewnętrznej warstwy splotowatej pokazanej tutaj jest przykładem morfologii komórki typu drugiego, której wstrzyknięto znacznik neurobiotyny.
Znacznik został później uwidoczniony poprzez wiązanie się ze znakowaną fluorescencyjnie streptawidyną, która jest pokazana tutaj w kolorze magenta. Oto różne wzorce reakcji komórki typu drugiego znajdującej się w warstwie komórek zwojowych na światło białe. Zastosowano bodziec przedłużony o trzy sekundy w celu lepszego rozróżnienia składowych odpowiedzi przy bodźcu, początku i przesunięciu Zgodnie z tą procedurą.
Inne metody, takie jak eksperymenty farmakologiczne, obrazowanie wapnia lub immunochemia, mogą być wykonane w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak funkcjonalna rola danego typu komórki w obwodach siatkówki.
Przegląd
Ten artykuł opisuje metodę rejestracji reakcji na światło i morfologii pojedynczych neuronów w nienaruszonej siatkówce myszy za pomocą dwufotonowej stymulacji w podczerwieni. Technika ta umożliwia ukierunkowane rejestrowanie patch-clamp z fluorescencyjnie oznakowanych komórek, co poprawia badania nad funkcją siatkówki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Elektrofizjologia
- Badania nad siatkówką
Tło
- Rozumienie reakcji neuronów w siatkówce jest kluczowe dla badań nad przetwarzaniem wzrokowym.
- Fluorescencyjne markery umożliwiają identyfikację określonych typów komórek.
- Tradycyjne metody mogą nie pozwalać na precyzyjne ukierunkowanie na komórki.
- Badanie to ma na celu poprawę dokładności rejestracji z określonych populacji neuronów.
Cel badania
- Zbadanie reakcji na światło pojedynczych neuronów w siatkówce.
- Analiza morfologii rejestrowanych neuronów.
- Poprawa zrozumienia przetwarzania informacji wzrokowych przez określone populacje komórek.
Stosowane metody
- Zsekcjonowanie oka myszy w celu odizolowania siatkówki.
- Wizualizacja komórek za pomocą dwufotonowej stymulacji w podczerwieni.
- Rejestrowanie patch-clamp w celu uzyskania odpowiedzi komórkowych.
- Wypełnianie barwnikiem w celu uwidocznienia morfologii komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej.
Główne wyniki
- Udane rejestracji reakcji na światło z ukierunkowanych, fluorescencyjnie oznakowanych neuronów.
- Szczegółowe informacje morfologiczne dotyczące struktury rejestrowanych komórek.
- Wykazane zalety ukierunkowania wzrokowego w porównaniu z tradycyjnymi metodami.
Wnioski
- Technika ta zapewnia potężne narzędzie do badania neuronów siatkówki.
- Umożliwia badaczom rozwiązanie kluczowych pytań dotyczących funkcji siatkówki i przetwarzania wzrokowego.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodologii w celu zbadania innych populacji neuronów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Targeted electrophysiological recording of specific neuronal populations in intact tissue addresses a key bottleneck in neuroscience drug discovery: linking cellular function to circuit behavior. By enabling precise access to low-abundance or morphologically indistinct cells, this method improves target validation confidence and supports mechanistic de-risking in early discovery. It provides a translational bridge for assessing how modulation of defined neuronal subtypes affects sensory processing, informing portfolio decisions in sensory disorder therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of genetically defined neuronal populations to validate therapeutic targets in sensory circuits.
- Operational Value: Reduces false-negative rates in target screening by improving access to rare or poorly characterized cell types.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative electrophysiological readouts (e.g., light-evoked currents, membrane potential shifts) for assay standardization.
- Operational Value: Supports reproducible, visually guided patch-clamp workflows compatible with automated microscopy platforms.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links cellular phenotypes to retinal output, enabling assessment of how target engagement alters visual signal processing.
- Operational Value: Facilitates longitudinal morphology-function correlation via post-recording dye filling and confocal imaging.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology by enabling hypothesis-driven interrogation of neuronal subtypes, supporting lead identification through functional screening, and informing preclinical validation via structure-function correlation.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by allowing direct measurement of neuronal light responses in genetically accessible preparations.
- Screening: Delivers reproducible, stimulus-evoked electrophysiological profiles that can be compound-tested in a targeted manner.
- Analytics: Provides quantitative dependent variables such as spike frequency, current amplitude, and kinetics for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects subcellular morphology (via dye filling) to electrophysiological phenotype, supporting biomarker alignment in disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying any GFP-defined neuronal population across retinal layers and experimental paradigms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target confidence by reducing ambiguity in cellular contribution to circuit function.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized visualization, recording, and morphologic validation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing functional data on targets otherwise inaccessible via blind electrophysiology.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of sensory therapeutics based on validated cellular mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in two-photon microscopy, electrophysiology, and retinal tissue preparation.
- Dependent on infrared laser systems, patch-clamp amplifiers, and perfusion maintenance at physiological temperature.
- Necessitates standardization across teams for staining, targeting, and stimulus delivery protocols.
- Adaptation to other model systems requires validation of promoter specificity and tissue optical properties.
- Limited by phototoxicity risks at high laser power and viability constraints of prolonged extracellular superfusion.
