Name: Charakterystyka elektrofizjologiczna populacji komórek wykazujących ekspresję GFP w nienaruszonej siatkówce (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Poznaj metodę patch-clamp z wykorzystaniem dwufotonowej ekscytacji podczerwienią do badania odpowiedzi na światło i morfologii pojedynczych neuronów w nienaruszonej siatkówce myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (WE849/16 1/2 dla K.D. i R.W.). Jesteśmy wdzięczni Thomasowi Eulerowi (Töbingen, Niemcy) za oprogramowanie do stymulacji światłem QDS.

Poniższy opis zakłada, że eksperymentator posiada podstawową wiedzę na temat struktury siatkówki, rejestracji metodą patch-clamp oraz mikroskopii dwufotonowej. Przydatne informacje dotyczące konfiguracji i obsługi układu patch-clamp oraz systemu obrazowania dwufotonowego znajdują się w Refs [7-12].
1. Przygotowanie zwierząt i tkanek
<ol>
	<li>Utrzymaj mysz w adaptacji do ciemności przez co najmniej 3 h. W tym czasie przygotuj 1-2 l roztworu zewnątrzkomórkowego składającego się z (w mM) 125 NaCl, 2,5 KCl, 1 CaCl2, 1,6 MgCl2, 25 NaHCO3, 10 D-glukozy i zrównoważ jego pH do poziomu 7,4 poprzez napowietrzanie karbogenem (5% CO2 w O2) w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Uśmierć mysz w szczelnej komorze poprzez przedawkowanie CO2, a następnie wykonaj zwichnięcie szyjowe. Tę procedurę oraz kolejne kroki należy przeprowadzać w ciemności. Aby umożliwić widoczność przy jednoczesnym zachowaniu adaptacji oczu zwierzęcia do ciemności (myszy mają słaby wzrok w czerwonej części widma światła), stosuj słabe oświetlenie o długiej fali (blokujemy krótkie fale z zimnego źródła światła za pomocą filtra długoprzechodniego 690 nm). Do pracy w całkowitej ciemności używaj oświetlenia podczerwienią (&gt;800 nm) i noś gogle noktowizyjne.</li>
	<li>Wyjąć gałki oczne za pomocą zakrzywionych nożyczek tęczówkowych i przenieść je do naczynia z roztworem zewnątrzkomórkowym umieszczonego pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
	<li>Usunąć rogówkę i ciało rzęskowe, otwierając gałkę oczną wzdłuż ora serrata (granicy między siatkówką a ciałem rzęskowym) za pomocą nożyczek sprężynowych (najpierw używamy lancetu, aby zrobić otwór początkowy do cięcia). Wyjąć soczewkę i ostrożnie oddzielić siatkówkę od nabłonka pigmentowego. Jeśli orientacja siatkówki jest kluczowa dla badania, zaznacz ją zgodnie z Ref [12]. Przeciąć nerw wzrokowy między siatkówką a nabłonkiem pigmentowym i wyjąć siatkówkę z oczodołu. Zwróć uwagę na kierunek powierzchni siatkówki: wewnętrzna strona zwiniętej siatkówki to strona komórek zwojowych, a zewnętrzna to strona fotoreceptorów.</li>
	<li>Usunąć ciało szkliste z wewnętrznej powierzchni siatkówki, delikatnie odciągając je za pomocą drewnianego wykałaczką. W tym celu użyj niewielkiej objętości roztworu zewnątrzkomórkowego, która zaledwie pokrywa siatkówkę. Ciało szkliste przylega do wykałaczki i może być przeciągane odśrodkowo od siatkówki. Następnie wykonaj krótkie nacięcia wzdłuż obwodu siatkówki, aby ułatwić spłaszczenie tkanki.</li>
	<li>Przenieść siatkówkę do komory rejestracyjnej stroną fotoreceptorów do dołu, rozprostować ją na szklanym dnie (używając cienkiego pędzla) i unieruchomić za pomocą nylonowej ramki ze stali nierdzewnej. W ten sam sposób przygotuj drugą siatkówkę i utrzymuj ją w adaptacji do ciemności w napowietrzonym karbogenem roztworze zewnątrzkomórkowym do późniejszego użycia.</li>
</ol>
2. Nagrania
<ol>
	<li>Zainstaluj komorę rejestracyjną w ciemności pod odwróconym mikroskopem skanującym laserem i stale perfunduj preparat siatkówki (z prędkością nie mniejszą niż 5 ml/min) nasyconym karboksygenem roztworem zewnątrzkomórkowym podgrzanym do 35 °CMikroskop (wyposażony również w kamerę CCD czułą na podczerwień) znajduje się na amortyzowanym stole pneumatycznym wewnątrz klatki Faradaya służącej do ekranowania elektronicznego. Klatkę należy osłonić nieprzezroczystą zasłoną, aby utrzymać preparat w ciemności. Światło z monitorów komputerowych ekranujemy dodatkowo czerwoną przezroczystą folią.</li>
	<li>Nastroić laser podczerwony na zakres 850–870 nm lub dłuższe fale, przełączyć go w tryb blokady modów (mode-locked) i zastosować dwufotonową wzbudzenie w celu wizualizacji komórek wykazujących ekspresję GFP. Osłabić moc wyjściową lasera za pomocą filtrów neutralnych sterowanych przez oprogramowanie do skanowania laserowego do stopnia, który jest wystarczający do wyraźnego rozpoznania fluorescencyjnych komórek.</li>
	<li>Do rejestracji metodą patch-clamp w trybie pomiaru prądu (current-clamp) należy użyć szklanych mikropipet (stosujemy rurki z borokrzemowego szkła o średnicy zewnętrznej 1,5 mm i grubości ścianki 0,225 mm) wypełnionych roztworem wewnątrzkomórkowym składającym się z (w mM): 125 glukonianu K, 10 KCl, 0,5 EGTA, 10 HEPES, z pH dostrojonym do 7,4 za pomocą KOH (co daje oporność pipety wynoszącą około 5 MΩ). Należy pamiętać, że inne warunki eksperymentalne, takie jak rejestracja w trybie pomiaru napięcia (voltage-clamp), wymagają zastosowania innego roztworu. W przypadku chęci przeprowadzenia wstrzyknięć barwnika należy dodać sondę fluorescencyjną (stosujemy 10 mM Alexa Fluor 594) lub cząsteczkę znacznika (3% neurobiotyny). Wprowadzić mikropipetę do uchwytu i upewnić się, że elektroda odniesienia (chlorkowany drut srebrny) styka się z roztworem zewnątrzkomórkowym w komorze rejestracyjnej.</li>
	<li>Wywieraj nacisk za pomocą mikropipety i nakieruj ją na komórkę wykazującą ekspresję GFP (używamy obiektywu imersyjnego z wodą z powiększeniem 40x; NA 1,25). Ciała komórek amacrynych znajdują się w warstwie komórek zwojowych (bezpośrednio pod powierzchnią przy obecnej orientacji siatkówki) oraz w proksymalnej części wewnętrznej warstwy nuklearnej (około 55-75 μm (głęboko wewnątrz preparatu). Przed kontaktem mikropipety z docelową komórką należy przebić błonę ograniczającą wewnętrzną (osłonę zbudowaną z stóp końcowych komórek glejowych) na powierzchni siatkówki. Pomyślne przebicie rozpoznaje się po tym, że roztwór wewnątrzkomórkowy zostaje wypchnięty z końcówki mikropipety i oddziela błonę ograniczającą wewnętrzną od leżącej pod nią tkanki siatkówki, co można zaobserwować na obrazie transmisyjnym w podczerwieni zarejestrowanym przez kamerę IR-CCD.</li>
	<li>Należy zbliżyć się do pożądanej komórki, porównując położenie somy na obrazie dwufotonowym z obrazem z kamery IR-CCD, który pokazuje położenie mikropipety rejestrującej. Należy pamiętać, że ten etap nie jest łatwy do wykonania i wymaga wprawy, ponieważ komórka wykazująca ekspresję GFP musi zostać rozpoznana na obrazie transmisyjnym w podczerwieni, aby móc skierować ku niej mikropipetę. Prawidłowe celowanie zostaje osiągnięte, gdy końcówka mikropipety powoduje wgłębienie powierzchni komórki, widoczne na obrazie dwufotonowym. Alternatywnie do tej procedury można zastosować barwnik fluorescencyjny (np. Alexa Fluor 594, 100 μM) w roztworze wewnątrzkomórkowym, aby uwidocznić położenie mikropipety na obrazie dwufotonowym. Dwufotonowa ekscytacja podczerwienią zapewnia wystarczającą fluorescencję tego barwnika, by mikropipeta była dostrzegalna. W tym celu należy dostosować zakres detekcji w oprogramowaniu do skanowania laserowego tak, aby obejmował on również fluorescencję czerwoną.</li>
	<li>Zwolnij ciśnienie z mikropipety i uzyskaj konfigurację patch-clamp w trybie whole-cell (całej komórki) w trybie clampowania prądowego (current-clamp). Użyteczny pomiar powinien wykazać potencjał błonowy od -50 do -55 mV i trwać co najmniej 20 min.</li>
	<li>Prezentuj bodźce wizualne stworzone za pomocą oprogramowania do stymulacji (używamy programu QDS autorstwa Thomasa Eulera z Uniwersytetu w Tübingen w Niemczech)11 na monitorze komputera. Dostosuj położenie przestrzenne stymulacji tak, aby znajdowała się ona w centrum rejestrowanej komórki: zaznacz pozycję komórki na monitorze wyświetlającym obraz transmisyjny z kamery IR-CCD i wycentruj na niej bodziec punktowy. Dostrój intensywność bodźca, wstawiając filtry neutralne w tor wiązki. Kalibrację widma i intensywności monitora opisano w ref. [14]. Wybierz wydłużony odstęp międzybodźcowy (np. 15 s), aby uniknąć adaptacji. Umieść fotodiodę w torze wiązki, aby rejestrować czas trwania bodźca.</li>
	<li>Uruchom protokół stymulacji i zarejestruj odpowiedzi na światło (stosujemy częstotliwość próbkowania 10 kHz z filtrowaniem przy 5 kHz dla komórek niewytwarzających potencjałów czynnościowych; do rejestracji impulsów zaleca się wyższą częstotliwość próbkowania, np. 20 kHz). Użyj oprogramowania do stymulacji światłem w celu uruchomienia oprogramowania rejestrującego.</li>
	<li>W celu wypełnienia barwnikiem należy pozwolić na dyfuzję czynnika fluorescencyjnego do rejestrowanej komórki przez 30–45 min, a następnie ostrożnie wycofać mikropipetę z komórki. Należy uważać, aby nie wyciągnąć ciała komórki. Jeśli użyto niefluorescencyjnego znacznika Neurobiotyna, wymagana jest jego wizualizacja poprzez wiązanie z streptawidyną sprzężoną z fluorophorem (stosujemy streptawidynę-Cy3 w rozcieńczeniu 1:400 przez noc w 4 °C po 20-minutowej fiksacji siatkówki paraformaldehydem; w przypadku badań nad sprzęganiem barwników inkubację z streptawidyną można przedłużyć do 3 dni). Alternatywnie wtryskiwanie można również przeprowadzić za pomocą mikroelektrod (&gt;100 MΩ), gdy barwnik jest wprowadzany do nakłutej komórki drogą jontoforezy (pulsy prostokątne: 0,25–1 nA, 100 ms, odstęp 100 ms, czas całkowity 3–6 min).</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki:
Poniższe wyniki pochodzą z badania na myszy wykazującej ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) pod promotorem tyrozynowej hydroksylazy13,14, enzymu katalizującego etap ograniczający szybkość syntezy katecholamin (mysz TH::GFP). Na podstawie jasności sygnału GFP można wyróżnić dwie odrębne populacje komórek (Rysunek 2A). Komórki wykazujące wyższy poziom GFP posiadają ciała komórkowe zlokalizowane w wewnętrznej warstwie jądrowej (INL, Rysunek 2A) lub przesunięte do warstwy komórek zwojowych (GCL, Rysunek 2B) i rozwarstwiają się w środkowej części wewnętrznej warstwy splotowatej (IPL, Rysunek 2C). Zidentyfikowano je jako komórki typu 214-16, które można było systematycznie badać pod kątem morfologii (Rysunek 3) i aktywności elektrycznej (Rysunek 4), mimo że gęstość ich populacji wynosi zaledwie 250 komórek/mm2.
<img alt="Schemat układu fotostymulacji z laserem podczerwonym, lustrem dichroicznym, PMT i przetwarzaniem danych." src="/files/ftp_upload/3457/3457fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schematyczny opis układu eksperymentalnego. Pobudzenie dwufotonowe (czerwona przerywana ścieżka światła) komórek wykazujących ekspresję fluoroforu w nienaruszonej siatkówce umożliwia wizualne celowanie za pomocą mikropipety (zielona ścieżka emisji światła). Siatkówka jest poddawana bodźcom optycznym projektowanym przez kondensator mikroskopu (żółta ścieżka światła), a następnie rejestrowane są komórkowe odpowiedzi świetlne.
<img alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiające struktury komórkowe i analizę sieci białkowej przy 50 μm." src="/files/ftp_upload/3457/3457fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Komórki wykazujące ekspresję GFP w preparacie płaskim siatkówki myszy TH::GFP. Można wyróżnić dwie populacje na podstawie intensywności sygnału GFP: komórki typu 1 (komórki DA) zlokalizowane w INL wykazujące słabą fluorescencję (A, patrz groty strzałek) oraz intensywnie znakowane komórki typu 2 z ciałami komórkowymi znajdującymi się albo w INL (A, patrz strzałki), albo przemieszczonymi do GCL (B) oraz z dendrytyczną stratyfikacją w warstwie S3 IPL (C). Paski skali, 50 μm.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna neuronu z EGFP i neurobiotyną, schemat wizualizacji rozgałęzień, skala 50 µm." src="/files/ftp_upload/3457/3457fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Morfologia komórki typu 2 wstrzykniętej znacznikiem Neurobiotin. Znacznik został następnie zwizualizowany za pomocą wiązania streptawidyny-Cy3 (magenta). Mikrografia, przedstawiająca również sygnał GFP (zielony), jest projekcją stosów obrazów obejmujących GCL i IPL. Pasek skali, 50 μm.
<img alt="Wykres odpowiedzi siatkówki; natężenie światła w funkcji czasu; dane elektrofizjologiczne; aktywność fotoreceptorów." src="/files/ftp_upload/3457/3457fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Reakcje świetlne komórki typu 2 zlokalizowanej w GCL. Wzorzec odpowiedzi na pełnowpólne oświetlenie białym światłem o zwiększającym się natężeniu w zakresie skotopowym. Natężenie bodźca podano w liczbie fotoizomeryzacji na pręcik na sekundę (Rh*/rod/s). W celu lepszego rozróżnienia komponentów odpowiedzi w momencie rozpoczęcia bodźca (odpowiedź ON) i jego zakończenia (odpowiedź OFF) zastosowano przedłużony bodziec trwający 3 s.

<ol><li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+plan+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The fundamental plan of the retina.</a> Nat. Neurosci. 4, 877-886 (2001).</li>
<li>Baccus, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+and+computation+in+inner+retinal+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Timing and computation in inner retinal circuitry.</a> Annu. Rev. Physiol. 69, 271-290 (2007).</li>
<li>Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wässle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+green+fluorescent+protein+in+retinal+neurons+of+four+transgenic+mouse+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines.</a> Neuroscience. 160, 126-139 (2009).</li>
<li>Siegert, S., Gross-Scherf, B., Del Punta, K., Didkovsky, N., Heintz, N., Roska, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+address+book+for+retinal+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic address book for retinal cell types.</a> Nat. Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Euler, T., Detwiler, P. W., Denk, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directionally+selective+calcium+signals+in+dendrites+of+starburst+amacrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directionally selective calcium signals in dendrites of starburst amacrine cells.</a> Nature. 418, 845-852 (2002).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSakmann%2C+B+%22Single-Channel+Recording%22">Single-Channel Recording</a>. , Plenum Press. (1995).</li>
<li>Jackson, M. B. Whole-cell voltage clamp recording. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJackson%2C+MB+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22">Current Protocols in Neuroscience</a>. Gerfen, C. , Wiley. (1997).</li>
<li>Majewska, A., Yiu, G., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+custom-made+two-photon+microscope+and+deconvolution+system%5BTitle%5D)+AND+%22Pf%C3%BCgers+Arch.+-+Eur.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A custom-made two-photon microscope and deconvolution system.</a> Pfügers Arch. - Eur. J. Physiol. 441, 398-408 (2000).</li>
<li>Yuste, R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYuste%2C+R+%22maging+in+Neuroscience+and+Development%3A+A+Laboratory+Manual%22">maging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. (2005).</li>
<li>Euler, T., Hausselt, S. E., Margolis, D. J., Breuninger, T., Castell, X., Detwiler, P. B., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyecup+scope+-+optical+recordings+of+light+stimulus-evoked+fluorescence+signals+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Arch.+-+Eur.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Eyecup scope - optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina.</a> Pflügers Arch. - Eur. J. Physiol. 457, 1393-1414 (2009).</li>
<li>Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+targeted+recording+of+GFP-expressing+neurons+for+light+responses+and+live-cell+imaging+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina.</a> Nat. Protoc. 5, 1347-1352 (2010).</li>
<li>Matsushita, N., Okada, H., Yasoshima, Y., Takahashi, N., Kiuchi, K., Kobayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+tyrosine+hydroxylase+promoter+activity+during+midbrain+dopaminergic+neuron+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Dynamics of tyrosine hydroxylase promoter activity during midbrain dopaminergic neuron development.</a> J. Neurochem. 82, 295-304 (2002).</li>
<li>Knop, G. C., Feigenspan, A., Weiler, R., Dedek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inputs+underlying+the+ON-OFF+light+responses+of+type+2+wide-field+amacrine+cells+in+TH-GFP+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inputs underlying the ON-OFF light responses of type 2 wide-field amacrine cells in TH-GFP mice.</a> J. Neurosci. 31, 4780-4791 (2011).</li>
<li>Zhang, D. Q., Stone, J. F., Zhou, T., Ohta, H., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+genetically+labeled+catecholamine+neurons+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Characterization of genetically labeled catecholamine neurons in the mouse retina.</a> Neuroreport. 15, 1761-1765 (2004).</li>
<li>Contini, M., Lin, B., Kobayashi, K., Okano, H., Masland, R. H., Raviola, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+input+to+ON-biploar+cells+onto+the+dopaminergic+neurons+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Synaptic input to ON-biploar cells onto the dopaminergic neurons of the mouse retina.</a> J. Comp. Neurol. 518, 2035-2050 (2010).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).</li>
<li>Dedek, K., Breuninger, T., de Sevilla Müller, L. P., Maxeiner, S., Schultz, K., Janssen-Bienhold, U., Willecke, K., Euler, T., Weiler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+type+of+interplexiform+amacrine+cell+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A novel type of interplexiform amacrine cell in the mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 30, 217-228 (2009).</li>
<li>Denk, W., Detwiler, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+recording+of+light-evoked+calcium+signals+in+the+functionally+intact+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Optical recording of light-evoked calcium signals in the functionally intact retina.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 7035-7040 (1999).</li>
</ol>

Myszy obsługiwano i uśmiercano zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi dobrostanu zwierząt oraz przepisami dotyczącymi eksperymentów na zwierzętach wydanymi przez rząd niemiecki.

Metoda ta umożliwia badanie właściwości elektrycznych konkretnych neuronów w nienaruszonej siatkówce pod kontrolą wizualną, bez wpływania na stan adaptacyjny siatkówki. Jest ona szczególnie odpowiednia do charakterystyki komórek, które są obecnie słabo zbadane ze względu na niską gęstość populacji, takich jak większość populacji komórek amakrynowych. Wzbudzenie dwufotonowe pozwala na obrazowanie o wysokiej rozdzielczości i wysokim kontraście nawet z głębszych części tkanki17, co jest warunkiem niezbędnym do dokładnego celowania i udanego patch-clampowania komórek, szczególnie w warstwie INL o wysokiej gęstości ciał komórkowych.
Wyizolowana siatkówka mysia pozostaje żywotna przez 3-4 h w warunkach eksperymentalnych. Jeśli druga siatkówka jest przechowywana w całkowitej ciemności przy ciągłym przepływie karbogenu, zachowuje fioletowy kolor niewybielonego fotopigmentu i może zostać wykorzystana po zakończeniu eksperymentów z pierwszą siatkówką. Na początku celowanie mikropipetą w wybraną komórkę w preparacie siatkówki całego preparatu (wholemount) jest nieco trudne i wymaga wprawy, szczególnie podczas pracy w ciemności. Dodanie barwnika fluorescencyjnego do mikropipety może uprościć procedurę, ponieważ komórka i mikropipeta są jednocześnie widoczne przy wzbudzeniu dwufotonowym. Jednak dodawanie składników do roztworu wewnątrzkomórkowego może utrudnić utworzenie gigaseala lub pogorszyć jakość rejestracji. Po pomyślnym uzyskaniu, dobra rejestracja może trwać około 1 h.
Podczas gdy podczerwone światło wzbudzenia jest słabo pochłaniane przez fotoreceptory siatkówki, wzbudzone komórki wykazujące ekspresję GFP emitują światło w widzialnej części widma. Jednak fluorofory są wzbudzane jedynie w niewielkiej objętości ogniskowej, co prawdopodobnie nie zmieni stanu adaptacyjnego siatkówki. Co więcej, wzbudzenie jest wymagane jedynie do celowania i może zostać wyłączone podczas rejestracji odpowiedzi świetlnych.
Użyteczność tego podejścia została już wykazana w badaniach nad konkretnymi populacjami komórek amacrinowych14,18, z których rejestracje elektrofizjologiczne byłyby w przeciwnym razie możliwe jedynie przypadkowo12. Wreszcie, tę potężną technikę można dodatkowo rozszerzyć o podejście farmakologiczne14, obrazowanie Ca2+19 lub wykorzystanie wstrzykniętych komórek do badań immunocytochemicznych bądź mikroskopii elektronowej. W ten sposób można odsłonić funkcjonalną pozycję danego typu komórek w obwodach siatkówki.

<table><tbody><tr><td>Gogle noktowizyjne</td><td>Gutzeit GmbH, Warthausen, Niemcy</td><td>Xtron F1</td><td>zawierają źródło światła 800 nm</td></tr><tr><td>Filtr optyczny</td><td>Schott AG</td><td>RG9</td><td>filtr długoprzepustowy z odcięciem przy 690 nm</td></tr><tr><td>Nożyczki do tęczówki</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-09</td><td>zakrzywione z ostrzem 22 mm</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td>proste z ostrzem 3 mm</td></tr><tr><td>Komora rejestracyjna</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann</td><td>200-100 500 0180 typ A(TC)</td><td>komora teflonowa z zamontowanym od spodu szkiełkiem przedmiotowym (ok. 0.15 mm; nr 200-100 500 0182)</td></tr><tr><td>Podgrzewacz przepływowy</td><td>Multi Channel System MCS GmbH</td><td>PH01, TC01</td><td>podgrzewana kaniula perfuzyjna z czujnikiem temperatury i kontrolerem temperatury</td></tr><tr><td>Skaningowy mikroskop laserowy</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM LFS</td><td>sterowany oprogramowaniem Leica Confocal Software</td></tr><tr><td>Stół optyczny pneumatyczny</td><td>Newport Corp.</td><td>VH 3036W-OPT</td><td></td></tr><tr><td>Laser</td><td>Newport Corp.</td><td></td><td>Laser tytano-szafirowy z blokadą modów Tsunami</td></tr><tr><td>Kamera CCD</td><td>pco AG, Kelheim, Niemcy</td><td>PixelFly QE</td><td>łącznie z oprogramowaniem sterującym</td></tr><tr><td>Szklane kapilary do mikropipet</td><td>Hilgenberg, Malsfeld, Niemcy</td><td>1408411</td><td></td></tr><tr><td>Wytwornica mikropipet</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-20004</td><td>barwnik fluorescencyjny</td></tr><tr><td>Neurobiotyna</td><td>Axxora</td><td>VC-SP-1120-M050</td><td>tracery niefluorescencyjny</td></tr><tr><td>Streptawidyna-Cy3</td><td>Dianova</td><td>016-160-084</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann</td><td>210-100 000 0010</td><td>zmotoryzowana jednostka manipulatora Mini25 z wyświetlaczem SM-5</td></tr><tr><td>Wzmacniacz patch-clamp</td><td>npi electronic</td><td>SEC-05LX npi</td><td></td></tr><tr><td>Digitaryzator</td><td>National Instruments</td><td>BNC-2090</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji danych WinWCP</td><td>John Dempster, University of Scotland, Glasgow, UK</td><td></td><td>http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/ software.htm</td></tr><tr><td>Generator bodźców wzrokowych QDS</td><td>Thomas Euler, University of T&amp;#252;bingen, Niemcy</td><td></td><td>musi być obsługiwany na osobnym komputerze sterującym 2 monitorami (interfejs użytkownika, monitor bodźców)</td></tr><tr><td>Filtry neutralne</td><td>ITOS, Mainz, Niemcy</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

charakterystyka elektrofizjologiczna populacji komórek wykazujących ekspresję gfp w nienaruszonej siatkówce

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Badanie właściwości fizjologicznych i połączeń synaptycznych konkretnych neuronów w nienaruszonym tkance jest wyzwaniem w przypadku komórek, które nie posiadają wyraźnych cech morfologicznych lub wykazują niską gęstość populacji. Dotyczy to w szczególności komórek amacryny siatkówki, wyjątkowo różnorodnej klasy interneuronów, która u ssaków obejmuje około 30 podtypów1. Mimo że stanowią one kluczowy element przetwarzania wizualnego poprzez kształtowanie sygnału wyjściowego siatkówki2, większość tych podtypów nie została dotychczas zbadana w kontekście funkcjonalnym, ponieważ dotarcie do tych komórek za pomocą elektrody rejestrującej jest zdarzeniem rzadkim.
W ostatnim czasie udostępniono liczne linie myszy transgenicznych wykazujące ekspresję markerów fluorescencyjnych, takich jak zielone białko fluorescencyjne (GFP), pod kontrolą promotorów receptorów błonowych lub enzymów specyficznych jedynie dla określonego podzbioru neuronów w danej tkance3,4. Te uprzednio znakowane komórki są zatem dostępne dla ukierunkowanego celowania mikroelektrodami pod kontrolą mikroskopową, co umożliwia systematyczne badanie ich właściwości fizjologicznych in situ. Jednak wzbudzanie markerów fluorescencyjnych wiąże się z ryzykiem fototoksyczności dla żywej tkanki. W przypadku siatkówki podejście to jest dodatkowo utrudnione przez fakt, że światło wzbudzające powoduje odpowiednią stymulację fotoreceptorów, co prowadzi do blaknięcia fotobarwników i wprowadza obwody siatkówkowe w stan adaptacji do światła. Wadom tym zaradza się, stosując wzbudzanie w podczerwieni dostarczane przez laser z blokadą modów w krótkich impulsach z zakresu femtosekundowego. Wzbudzanie dwufotonowe dostarcza energii wystarczającej do wzbudzenia fluoroforu, a jednocześnie ogranicza wzbudzenie do niewielkiej objętości tkanki, minimalizując ryzyko uszkodzeń fotochemicznych5. Ponadto sprawia ono, że siatkówka pozostaje responsywna na bodźce wzrokowe, ponieważ światło podczerwone (&gt;850 nm) jest słabo absorbowane przez fotobarwniki6.
W niniejszym artykule demonstrujemy wykorzystanie siatkówki transgenicznej myszy do przeprowadzenia elektrofizjologicznych rejestracji in situ z komórek wykazujących ekspresję GFP, które są celowane wizualnie za pomocą wzbudzenia dwufotonowego. Siatkówka jest przygotowywana i utrzymywana w ciemności i może być poddawana bodźcom optycznym projektowanym przez kondensor mikroskopu (Rycina 1). Rejestracja odpowiedzi świetlnych metodą patch-clamp może być połączona z wypełnianiem barwnikiem w celu ujawnienia morfologii oraz sprawdzenia sprzężenia barwnika za pośrednictwem złączy szczelinowych z sąsiednimi komórkami, co pozwala na badanie komórki docelowej na różnych poziomach eksperymentalnych.

Niniejszy artykuł przedstawia rejestrację sygnałów z pojedynczych komórek pochodzących z fluorescencyjnie znakowanych populacji neuronów w nienaruszonej siatkówce myszy. Dzięki zastosowaniu dwufotonowego wzbudzenia w podczerwieni, transgenicznie znakowane komórki zostały wytypowane do rejestracji metodą patch-clamp w celu zbadania ich reakcji na światło, właściwości pól recepcyjnych oraz morfologii.

Charakterystyka elektrofizjologiczna populacji komórek wykazujących ekspresję GFP w nienaruszonej siatkówce

Badanie właściwości fizjologicznych i połączeń synaptycznych konkretnych neuronów w nienaruszonej tkance stanowi wyzwanie w przypadku komórek, którym brakuje ...

Ogólnym celem tej procedury jest badanie odpowiedzi na światło oraz morfologii pojedynczych neuronów w nienaruszonej siatkówce z wykorzystaniem linii myszy wykazującej ekspresję markera fluorescencyjnego wyłącznie w określonych typach komórek. Cel ten osiąga się najpierw poprzez wypreparowanie oka w celu uzyskania izolowanej siatkówki. Drugim krokiem jest umieszczenie siatkówki pod laserowym mikroskopem skaningowym i wizualizacja komórki za pomocą dwufotonowej ekscytacji podczerwienią.Następnie używa się mikropipety, aby uzyskać konfigurację whole cell patch clamp w celu rejestracji i wypełnienia barwnikiem. Ostatecznie preparat ten pozwala na rejestrację odpowiedzi komórkowych na fotostymulację oraz ujawnia morfologię rejestrowanej komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak niekierowana rejestracja patch clamp z siatkówki, jest możliwość wizualnego skierowania rejestracji na komórkę znakowaną fluorescencyjnie bez stymulowania siatkówki światłem wzbudzenia.Niniejsza metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad siatkówką, takie jak: jaki jest wkład danej populacji komórek w przetwarzanie informacji wizualnych? Ma to zastosowanie nawet wtedy, gdy populacja komórek charakteryzuje się niską gęstością i nie posiada wyraźnych cech morfologicznych, które mogłyby ułatwić identyfikację. Eksperyment należy rozpocząć od adaptacji myszy do ciemności przez co najmniej trzy godziny przed badaniem.W międzyczasie przygotować roztwór pozakomórkowy zgodnie z opisem w załączonym manuskrypcie i napowietrzać go karbogenem w temperaturze pokojowej. Następnie uśmiercić mysz i przeprowadzić enukleację gałek ocznych za pomocą zakrzywionych nożyczek do tęczówki. Przenieść je do naczynia z roztworem pozakomórkowym.Następnie umieść próbkę pod mikroskopem stereoskopowym i użyj sprężynowych nożyczek chirurgicznych. Usuń rogówkę oraz ciało rzęsiste, rozcinając gałkę oczną wzdłuż ora serrata. Wyjmij soczewkę i ostrożnie oddziel siatkówkę od nabłonka barwnikowego.Następnie przetnij nerw wzrokowy pomiędzy siatkówką a nabłonkiem barwnym. Usuń siatkówkę z oczodołu. Zwróć uwagę, że wewnętrzna strona zwiniętej siatkówki to strona komórek zwojowych.Strona zewnętrzna to strona fotoreceptorów. Następnie należy usunąć ciało szkliste z wewnętrznej powierzchni siatkówki, delikatnie odrywając je za pomocą drewnianego wykałaczki. Następnie wykonuje się krótkie nacięcia wzdłuż obwodu siatkówki, aby ułatwić spłaszczenie tkanki.Następnie przenieś siatkówkę do komory rejestracyjnej stroną fotoreceptorów skierowaną w dół. Rozprostuj ją na szklanym dnie za pomocą cienkiego pędzla i unieruchom za pomocą ramki ze stali nierdzewnej z nylonowymi nićmi. Umieść komorę rejestracyjną w ciemności pod odwróconym mikroskopem laserowym ze skanowaniem.Płucz preparat siatkówki w sposób ciągły, z przepływem nie mniejszym niż 5 ml/min. Wykorzystując nasycony tlenem roztwór zewnątrzkomórkowy podgrzany do 35 °C, mikroskop należy ustawić na amortyzowanym stole pneumatycznym wewnątrz klatki Faradaya. W celu zapewnienia ekranowania elektronicznego, przykryj klatkę nieprzezroczystą zasłoną, aby utrzymać preparat w ciemności.Ekranujemy również światło z monitorów komputerowych za pomocą czerwonych przezroczystych folii. Nastroimy laser podczerwony na zakres od 850 do 870 nanometrów lub dłuższe fale. Przełączamy urządzenie w tryb blokady modów i wykorzystujemy dwufotonową ekscytację w celu wizualizacji komórek ekspresujących GFP.W celu przeprowadzenia rejestracji metodą patch clamp, należy napełnić mikropipety z borokrzemianu szkła roztworem wewnątrzkomórkowym zawierającym sondę fluorescencyjną, zgodnie z opisem w towarzyszącym manuskrypcie. Następnie należy umieścić mikropipetę w uchwycie. Należy upewnić się, że elektroda odniesienia znajduje się w kontakcie z roztworem zewnątrzkomórkowym w komorze rejestracyjnej.Następnie, za pomocą obiektywu imersyjnego 40x, wywarcie nacisk na komórkę docelową A GFP za pomocą mikropipety. Ciała komórek Omicron znajdują się w warstwie komórek zwojowych oraz w proksymalnej części warstwy międzypleksiformej; przed kontaktem mikropipety z docelową komórką należy przebić wewnętrzną błonę ograniczającą na powierzchni siatkówki. Prawidłowe przebicie rozpoznaje się po wypłynięciu roztworu wewnątrzkomórkowego z końcówki mikropipety oraz oddzieleniu wewnętrznej błony ograniczającej od leżącej pod nią tkanki siatkówki. Barwnik fluorescencyjny zawarty w roztworze wewnątrzkomórkowym może ujawnić pozycję mikropipety na obrazie dwufotonowym podczas zbliżania się do wybranej komórki.Następnie zwolnić nacisk z mikropipety i uzyskać konfigurację whole-cell patch clamp. W trybie current clamp prawidłowy zapis powinien wykazywać potencjał błony od -50 do -55 mV i trwać co najmniej 20 minut. Po tym czasie zaprezentować bodźce wizualne wygenerowane na monitorze komputera.Dostosuj intensywność bodźca, wstawiając filtry neutralne do drogi wiązki, i ustaw pozycję przestrzenną stymulacji na środek rejestrowanej komórki. Następnie uruchom protokół stymulacji i zarejestruj odpowiedzi świetlne. Użyj generatora bodźców do wyzwalania oprogramowania rejestrującego.W ścieżce wiązki należy umieścić fotodiodę w celu rejestracji czasu podawania bodźca. Należy uważać, aby nie wyciągnąć ciała komórki podczas wycofywania mikropipety. Po zakończeniu wypełniania barwnikiem należy pozwolić substancji fluorescencyjnej dyfundować do rejestrowanej komórki przez 30 do 45 minut.Oto przykład komórek wykazujących ekspresję GFP w preparacie płaskim siatkówki pod promotorem dla hydroksylazy tyrozynowej; można wyróżnić dwie populacje na podstawie intensywności sygnału GFP. Komórki dopaminergiczne typu pierwszego, zlokalizowane w warstwie prześwietlnej, wykazują słabą fluorescencję, co wskazują groty strzałek na rysunku A. Komórki typu drugiego zostały intensywnie znakowane i posiadają ciała komórkowe albo w tej samej warstwie, jak pokazują strzałki na rysunku A, albo przesunięte do warstwy komórek zwojowych, co przedstawiono na rysunku B. Rysunek C pokazuje stratyfikację dendrytyczną komórek typu drugiego w trzeciej warstwie wewnętrznej warstwy splotowej; przedstawiony tutaj przykład ukazuje morfologię komórki typu drugiego wstrzykniętej z tracerem neurobiotyną.Marker został następnie zwizualizowany poprzez wiązanie ze znakowaną fluorescencyjnie streptawidyną, przedstawioną tutaj w kolorze purpurowym. Poniżej przedstawiono różne wzorce odpowiedzi komórki typu drugiego znajdującej się w warstwie komórek zwojowych na światło białe. W celu lepszego rozróżnienia komponentów odpowiedzi w momencie rozpoczęcia i zakończenia bodźca, po zastosowaniu powytej procedury, wykorzystano przedłużony bodziec trwający trzy sekundy.W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak funkcjonalna rola danego typu komórek w obrębie obwodów siatkówki, można przeprowadzić inne metody, np. eksperymenty farmakologiczne, obrazowanie wapnia lub immunochemię.

electrophysiological-characterization-gfp-expressing-cell-populations

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Charakterystyka elektrofizjologiczna populacji komórek ekspresujących GFP w nietkniętej siatkówce

Niniejszy artykuł zawiera opis sposobu wycinania i rejestrowania aktywności z izolowanego preparatu siatkówki myszy. W szczególności opisujemy, jak rejestrować odpowiedzi na światło z populacji komórek zwojowych znakowanych fluorescencyjnie, a następnie identyfikować i analizować ich morfologię.<br...

Izolowany preparat siatkówki do rejestracji odpowiedzi świetlnej genetycznie znakowanych komórek zwojowych siatkówki

Prezentujemy protokół elektroporacji in vivo do transfekcji pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek zwojowych siatkówki (RGCs) oraz innych typów komórek siatkówki u myszy postnatalnych w szerokim zakresie wieku. Zdolność do znakowania i genetycznej manipulacji postnatalnymi RGCs in vivo stanowi potężne narzędzie w badaniach nad rozwojem.

Transfekcja komórek zwojowych siatkówki myszy za pomocą elektroporacji in vivo

Niniejszy protokół opisuje prostą i niedrogą metodę ilościowego określania aktywności elementów cis-regulatorowych (tj. enhancerów/promotorów) w żywych siatkówkach myszy za pomocą elektroporacji eksplantów. Opisano przygotowanie DNA, wycięcie siatkówki, elektroporację, hodowlę eksplantów siatkówki oraz analizę i kwantyfikację po utrwaleniu.

Ilościowe określenie aktywności elementów regulacyjnych cis w siatkówce myszy za pomocą elektroporacji eksplantatu

Ogólnym celem tego filmu jest pokazanie, jak przeprowadzić celowaną iniekcję do siatkówki oraz elektroporację konstruktów DNA/RNA in ovo do siatkówki zarodka kurczaka w stadium 22-23 według skali Hamburgera i Hamiltona, co odpowiada około 4. dniu inkubacji (E4). Technika ta jest bardzo użyteczna w badaniu ekspresji genów, regulacji genów oraz zmian morfologicznych w rozwijającej się siatkówce kurczaka.

Elektroporacja in ovo siatkówki zarodka kurczaka

Film demonstruje metodę badania pobudliwości komórek neuronalnych wyrażających białko fluorescencyjne za pomocą cęgów prądowych dla całych komórek. W trybie cęgowym generowane są potencjały czynnościowe wskazujące na pobudliwość neuronów.

Badanie pobudliwości neuronów fluorescencyjnych za pomocą klamry krosowej dla całych komórek

Źródło: Laboissonniere, et. al. Jednokomórkowy sekwencjoner RNA zdefiniowanych podzbiorów komórek zwojowych siatkówki. J. Vis. exp. (2017).  Ten film demonstruje technikę fluorescencyjnego śledzenia w celu identyfikacji podtypów komórek zwojowych siatkówki (RGC) w transgenicznej siatkówce myszy. Proces ten polega na zabezpieczeniu izolowanej siatkówki w komorze rejestracyjnej, utrzymaniu żywotności komórek za pomocą natlenionej perfuzji i celowaniu w znakowane fluorescencyjnie RGC za pomocą...

Identyfikacja podtypów komórek zwojowych siatkówki myszy za pomocą śledzenia fluorescencyjnego

Tutaj prezentujemy kombinatoryczne podejście do klasyfikacji typów komórek neuronalnych przed izolacją i późniejszej charakterystyki transkryptomów jednokomórkowych. Protokół ten optymalizuje przygotowanie próbek do udanego sekwencjonowania RNA (RNA-Seq) i opisuje metodologię zaprojektowaną specjalnie w celu lepszego zrozumienia różnorodności komórkowej.

Sekwencja RNA pojedynczej komórki zdefiniowanych podzbiorów komórek zwojowych siatkówki

Regeneracja siatkówki danio pręgowanego była głównie badana przy użyciu stałych siatek oka. Jednak dynamiczne procesy, takie jak interkinetyczna migracja jądrowa, zachodzą podczas odpowiedzi regeneracyjnej i wymagają obrazowania żywych komórek w celu zbadania mechanizmów leżących u ich podstaw. W tym miejscu opisujemy warunki hodowli i obrazowania w celu monitorowania międzykinetycznej migracji jądrowej (INM) w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii wielofotonowej.

Hodowla dorosłych transgenicznych eksplantatów siatkówki danio pręgowanego do obrazowania żywych komórek za pomocą mikroskopii wielofotonowej

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem do badania biologii w zdrowiu i chorobie. Protokół ten opisuje obrazowanie przezźrenicowe siatkówki myszy za pomocą standardowego mikroskopu dwufotonowego. Zademonstrowano również różne metody obrazowania in vivo, które umożliwiają fluorescencyjne znakowanie wielu kohort komórkowych siatkówki.

Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Protezy siatkówki mają zdolność generowania percepcji wzrokowej. Aby przyspieszyć rozwój nowych protez, potrzebne są metody ex vivo do testowania urządzeń przed implantacją. W tym artykule przedstawiono kompleksowy protokół badania aktywności wapnia w warstwie komórek zwojowych siatkówki poddanych stymulacji elektrycznej.

Obrazowanie wapnia w stymulowanych elektrycznie płaskich siatkówkach

Praca ta przedstawia alternatywne przygotowanie siatkówki płaskie, w którym usunięcie ciał komórek fotoreceptorowych umożliwia szybszą dyfuzję przeciwciał oraz poprawiony dostęp pipety plastrowej do wewnętrznych neuronów siatkówki do immunohistochemii, hybrydyzacji in situ oraz eksperymentów elektrofizjologicznych.

Rozdzielona siatkówka jako ulepszone przygotowanie płaskie do badania neuronów wewnętrznej warstwy jądrowej w siatkówce kręgowej

Poznaj metodę patch-clamp z wykorzystaniem dwufotonowej ekscytacji podczerwienią do badania odpowiedzi na światło i morfologii pojedynczych neuronów w nienaruszonej siatkówce myszy.

Charakterystyka elektrofizjologiczna populacji komórek wykazujących ekspresję GFP w nienaruszonej siatkówce

Przeglądaj więcej filmów