Charakterystyka elektrofizjologiczna populacji komórek wykazujących ekspresję GFP w nienaruszonej siatkówce

Ogólnym celem niniejszej procedury jest badanie odpowiedzi na światło oraz morfologii pojedynczych neuronów w nienaruszonej siatkówce, z wykorzystaniem linii myszy wykazującej ekspresję markera fluorescencyjnego wyłącznie w określonych typach komórek. W tym celu w pierwszej kolejności przeprowadza się dysekcję oka w celu wyizolowania siatkówki. W drugim kroku siatkówkę umieszcza się pod laserowym mikroskopem skaningowym, aby zwizualizować komórkę za pomocą dwufotonowej ekscytacji podczerwienią.

Następnie używa się mikropipety do uzyskania konfiguracji whole cell patch clamp w celu rejestracji i wypełnienia barwnikiem. Ostatecznie przygotowanie to umożliwia rejestrację odpowiedzi komórkowych na fotostymulację oraz ujawnia morfologię rejestrowanej komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak niekierowana rejestracja patch clamp z siatkówki, jest możliwość wizualnego skierowania rejestracji na komórkę znakowaną fluorescencyjnie bez stymulowania siatkówki światłem wzbudzenia.

Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad siatkówką, takie jak: jaki jest wkład danej populacji komórek w przetwarzanie informacji wizualnych? Dotyczy to również sytuacji, w których populacja komórek charakteryzuje się niską gęstością i nie posiada wyraźnych cech morfologicznych, które mogłyby ułatwić identyfikację. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy poddać mysz adaptacji do ciemności przez co najmniej trzy godziny.

W międzyczasie przygotować roztwór zewnątrzkomórkowy zgodnie z opisem w towarzyszącym manuskrypcie i napowietrzać go karbogenem w temperaturze pokojowej. Następnie uśmiercić mysz i wyciąć gałki oczne za pomocą zakrzywionych nożyczek irydologicznych. Przenieść je do naczynia z roztworem zewnątrzkomórkowym.

Następnie umieść go pod mikroskopem stereotypowym za pomocą nożyczek sprężynowych. Usuń rogówkę i ciało rzęskowe, otwierając gałkę oczną wzdłuż ora serrata. Wyjmij soczewkę i ostrożnie oddziel siatkówkę od nabłonka pigmentowego.

Następnie przetnij nerw wzrokowy pomiędzy siatkówką a nabłonkiem barwnikowym. Wyjmij siatkówkę z oczodołu. Należy pamiętać, że wewnętrzna strona zwiniętej siatkówki to strona komórek zwojowych.

Strona zewnętrzna to strona fotoreceptorów. Następnie należy usunąć ciało szkliste z wewnętrznej powierzchni siatkówki, delikatnie go odrywając za pomocą drewnianego wykałaczką. Następnie należy wykonać krótkie nacięcia wzdłuż obwodu siatkówki, aby ułatwić spłaszczenie tkanki.

Następnie przenieś siatkówkę do komory pomiarowej stroną z fotoreceptorami do dołu. Rozprostuj ją na szklanym dnie za pomocą cienkiego pędzla i unieruchom za pomocą ramki ze stali nierdzewnej z naciągniętą nylonową nicią. Umieść komorę pomiarową w ciemności pod odwróconym mikroskopem laserowym skanującym.

Preparat siatkówki należy nieprzerwanie perfundować z prędkością nie mniejszą niż 5 ml/min. Wykorzystując nasycony tlenem roztwór zewnątrzkomórkowy podgrzany do 35 °C, mikroskop umieszcza się na amortyzującym stole pneumatycznym wewnątrz klatki Faradaya. Aby zapewnić ekranowanie elektroniczne, klatkę należy osłonić nieprzezroczystą zasłoną, aby utrzymać preparat w ciemności.

Światło z monitorów komputerowych ekranujemy również za pomocą czerwonych przezroczystych folii. Laser podczerwony dostrajamy do zakresu od 850 do 870 nanometrów lub do dłuższych fal. Przełączamy urządzenie w tryb blokady modów i wykorzystujemy dwufotonową ekscytację do wizualizacji komórek wykazujących ekspresję GFP.

W celu przeprowadzenia rejestracji metodą patch clamp, należy napełnić mikropipety z borokrzemianowego szkła roztworem wewnątrzkomórkowym zawierającym sondę fluorescencyjną, zgodnie z opisem w towarzyszącym manuskrypcie. Następnie należy umieścić mikropipetę w uchwycie. Należy upewnić się, że elektroda odniesienia znajduje się w kontakcie z roztworem zewnątrzkomórkowym w komorze pomiarowej.

Następnie, przy użyciu obiektywu imersyjnego 40x, wywieramy nacisk mikropipetą na komórkę docelową A wykazującą ekspresję GFP. Ciała komórek Omicron znajdują się w warstwie komórek zwojowych, a także w proksymalnej części warstwy międzypleksiformowej. Przed zetknięciem mikropipety z docelową komórką należy przebić wewnętrzną błonę ograniczającą na powierzchni siatkówki. Prawidłowe przebicie rozpoznaje się po wypłynięciu roztworu wewnątrzkomórkowego z końcówki mikropipety oraz odwarstwieniu wewnętrznej błony ograniczającej od leżącej pod nią tkanki siatkówki. Barwnik fluorescencyjny zawarty w roztworze wewnątrzkomórkowym pozwala na śledzenie pozycji mikropipety w obrazie dwufotonowym podczas zbliżania się do wybranej komórki.

Następnie zwolnij nacisk z mikropipety i uzyskaj konfigurację whole cell patch clamp. W trybie clamp prądowym użyteczny zapis powinien wykazać potencjał błonowy od -50 do -55 mV i trwać co najmniej 20 minut. Po tym czasie zaprezentuj bodźce wizualne utworzone na monitorze komputera.

Dostrój intensywność bodźca, wstawiając filtry neutralnej gęstości do drogi wiązki, a następnie dopasuj położenie przestrzenne stymulacji do centrum rejestrowanej komórki. Następnie uruchom protokół stymulacji i zarejestruj odpowiedzi świetlne. Użyj generatora bodźców do wyzwolenia oprogramowania rejestrującego.

W ścieżce wiązki należy umieścić fotodiodę w celu rejestracji czasu trwania bodźca. Należy zachować ostrożność, aby nie wyciągnąć ciała komórki podczas wycofywania mikropipety. Po zakończeniu wypełniania barwnikiem należy pozostawić czynnik fluorescencyjny do dyfuzji do rejestrowanej komórki przez 30 do 45 minut.

Oto przykład komórek wykazujących ekspresję GFP w preparacie retinal flat mount pod kontrolą ich promotora. W przypadku hydroksylazy tyrozynowej można wyróżnić dwie populacje na podstawie jasności sygnału GFP. Komórki dopaminergiczne typu pierwszego, zlokalizowane w warstwie międzyjądrowej, wykazują słabą fluorescencję, co wskazują groty strzałek na rysunku A. Komórki typu drugiego były intensywnie znakowane i mają ciała komórkowe znajdujące się w tej samej warstwie, jak pokazują strzałki na rysunku A, lub przesunięte do warstwy komórek zwojowych, co przedstawia rysunek B. Rysunek C pokazuje stratyfikację dendrytów komórek typu drugiego w warstwie trzeciej wewnętrznej warstwy splotowej; przedstawiono tutaj przykład morfologii komórki typu drugiego po wstrzyknięciu znacznika neurobiotyny.

Marker został później zwizualizowany poprzez wiązanie ze streptawidyną znakowaną fluorescencyjnie, przedstawioną tutaj kolorem purpurowym. Poniżej pokazano różne wzorce odpowiedzi komórki typu drugiego z warstwy komórek zwojowych na światło białe. W celu lepszego rozróżnienia komponentów odpowiedzi w momencie rozpoczęcia i zakończenia stymulacji, po zastosowaniu tej procedury wykorzystano przedłużony bodziec trwający trzy sekundy.

W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak funkcjonalna rola danego typu komórek w obwodach siatkówki, można zastosować inne metody, m.in. eksperymenty farmakologiczne, obrazowanie wapnia lub immunochemię.