Name: Wyprowadzanie prekursorów z ograniczeniami glejowymi od myszy E13 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Poznaj metodę wyprowadzania prekursorów z ograniczeniami glejowymi z rdzenia kręgowego płodów myszy E13. Protokół obejmuje izolację, hodowlę i immuno-panning komórek GRP do badań nad rozwojem oligodendrocytów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować drowi Devinowi Gary'emu za jego wkład i uwagi dotyczące wykorzystania komórek GRP.

Wprowadzenie
W niniejszym protokole przedstawiamy sposób izolacji, selekcji i wysiewania prekursorów ograniczonych do gleby (GRP) z rdzenia kręgowego płodów myszy w 13. dniu embrionalnym (E13). Komórki te są wczesnymi prekursorami w liniach oligodendrocytycznej i astrocytycznej, a ich identyfikacja opiera się na ekspresji A2B5. W pożywce GRP uzupełnionej o FGF-2, komórki GRP A2B5+ zaczynają wykazywać ekspresję wczesnych markerów linii oligodendrocytycznej: PDGFαR oraz NG21,2. Komórki linii oligodendrocytów przechodzą przez szereg odrębnych etapów fenotypowych, z których każdy charakteryzuje się zmianami morfologicznymi oraz ekspresją markerów specyficznych dla poszczególnych stadiów rozwojowych.
Komórki prekursorowe te są obecnie badane jako potencjalne źródło dla terapii komórkowych w zaburzeniach istoty białej ośrodkowego układu nerwowego, w tym w stwardnieniu rozsianym, leukodystrofiach i okołodomkowym rozmiękczeniu białej istoty (PVL)3,4,5,6. Badania z wykorzystaniem prekursorów linii oligodendrocytów pochodzących z ludzkiego mózgu wykazały skuteczną remielinizację w mózgach myszy w modelu dysmielinizacji „shiverer” oraz w modelach demielinizacji rdzenia kręgowego u gryzoni6,7,8,9. Te glialne komórki prekursorowe były wykorzystywane również w badaniach nad innymi modelami chorób istoty białej, takimi jak urazy rdzenia kręgowego i stwardnienie boczne zanikowe10,11,12,13.
W naszym laboratorium opracowaliśmy model niedotlenienia i niedokrwienia u myszy w wczesnym okresie ponatalnym, za pomocą którego oceniamy skuteczność pochodzących z rdzenia kręgowego komórek GRP jako podejścia regeneracyjnego w PVL, będącym główną przyczyną porażenia mózgowego14,15,16. Istnieje również model OPC pochodzący z mózgu gryzoni, który jest powszechnie stosowany do badania uszkodzeń istoty białej, ponieważ komórki GRP mają tendencję do różnicowania się w kierunku astrocytarnym17. Fenotyp OPC wszedł już na ścieżkę linii oligodendrocytów, co wydaje się zjawiskiem nieodwracalnym. Jesteśmy jednak zainteresowani oceną odpowiedzi szerszego spektrum progenitorów oligodendrocytów, w tym GRP, a być może nawet NEP pochodzących z E10.5. Z tego powodu w naszych badaniach przyjęliśmy model GRP pochodzących z rdzenia kręgowego.
Oprócz wykorzystania GRP w celu zastąpienia komórek, pozyskiwanie tych komórek z modeli gryzoni typu dzikiego oraz transgenicznych modeli chorób istoty białej pozwala na dalsze badanie różnicowania gleju w warunkach prawidłowych i chorobowych w układzie in vitro. Wcześniejsze publikacje dostarczają dowodów na selektywną podatność prekursorów linii oligodendrocytycznej na różne stresory zewnętrzne, takie jak zależna od dojrzewania ekscytotoksyczność glutaminianu, stres oksydacyjny oraz wybrane czynniki zaangażowane w neurostan zapalny18,19. Nasze badania koncentrowały się na zrozumieniu komórkowych i molekularnych mechanizmów powstawania tych uszkodzeń istoty białej, ocenie podatności komórek z widma linii oligodendrocytów na uszkodzenia, a także na analizie potencjalnych podejść terapeutycznych.
Materiały
Wszystkie procedury z udziałem zwierząt są zgodne z polityką PHS oraz IACUC Uniwersytetu im. Johna Hopkinsa (JHU). Wszystkie czynności powinny być wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza w celu zachowania warunków aseptycznych. Zazwyczaj sekcje wykonuje się w komorze o przepływie poziomym, a prace in vitro w komorze o przepływie pionowym. Wszystkie pożywki stosowane podczas sekcji powinny być schłodzone. Myszy wykorzystane w naszym badaniu to szczep typu dzikiego CD-1 oraz myszy transgeniczne GFP na tle szczepu C57/BL6. Jedna matka CD-1 dostarcza zazwyczaj ponad 10 płodów, co wystarcza do zaszczepienia 1-2 kolb T25. Zazwyczaj w jednym czasie uśmierca się dwie matki, a rdzenie kręgowe płodów są łączone i wysiewane do jednej kolby T25 na każdą matkę. Po wyizolowaniu komórki mogą być namnażane i charakteryzowane in vitro na potrzeby dalszych badań.
1. Przygotowanie pożywek i kolb
<ul type="disc">
 <li>Podłoże stokowe GRP stosowane jako podłoże do sekcji: DMEM / F12 1:1 (Invitrogen) + B27 (50x; Invitrogen) N2 (100x; Invitrogen) Supplements oraz albumina surowicy bydlęcej (BSA; 0,5% w/v).</li>
 <li>Podłoże do dysocjacji: takie samo jak podłoże do sekcji.</li>
 <li>Podłoże hodowlane: podłoże stokowe GRP + FGF-2 (10-20 ng/ml; Invitrogen) i heparyna (1 μg/ml; Sigma).</li>
 <li>Kolby 75 cm2 lub 25 cm2 (T75 lub T25) powlekane PLL/lamininą.</li>
 <li>Kolby do hodowli tkankowych (75 cm2, Falcon) powlekano 15-20 μg/ml poli-L-lizyną (PLL; Sigma) w destylowanej H2O, inkubowano w 37 °C przez 1 h, a następnie odessano roztwór. Kolby przemyto raz PBS, a następnie powlekano 15-20 μg/ml lamininą (Sigma) w PBS w 37 °C przez 1 h; po tym czasie odessano roztwór i dodano świeży PBS lub podłoże do momentu przygotowania komórek do wysiewu. Po powleczeniu kolby nie mogą wyschnąć, lecz mogą być przechowywane w PBS lub podłożu w 4 °C przez krótkie okresy przed użyciem.</li>
</ul>
2. Instrumenty i inne materiały
<ul type="disc">
 <li>Szalki Petriego: 4 na jedną samicę: 3 szalki do sekcji (75 mm), szalka 20 mm do zbierania wyizolowanych rdzeni kręgowych.</li>
 <li>Duże nożyczki (nożyczki operacyjne 43 mm, Roboz) oraz pęseta tkankowa do otwierania jamy brzusznej samicy.</li>
 <li>Małe nożyczki do preparowania macicy i usuwania płodów (mikronożyczki do sekcji 15 mm, Roboz).</li>
 <li>Mikronożyczki sprężynowe do sekcji (6 mm) do preparowania rdzenia kręgowego płodów.</li>
 <li>Kątne mikropęsety do sekcji do unieruchomienia ciała samicy i płodów podczas operacji oraz do późniejszego usuwania odsłoniętego rdzenia kręgowego.</li>
 <li>Sito do komórek o oczkach 40 lub 70 µm do usuwania resztek komórkowych przed wysiewaniem.</li>
 <li>0,05% trypsyna uprzednio ogrzana do 37 °C.</li>
 <li>10 mg/ml DNAse 1 (Sigma), przygotowana jako roztwór stokowy 100x (1 g/ml).</li>
 <li>Worek na odpady biologiczne na zwłoki zwierząt.</li>
 <li>Probówki wirówkowe 15 i 50 ml do obróbki wyizolowanych rdzeni kręgowych.</li>
</ul>
3. Określanie czasu trwania ciąży
Ciążowe myszy matki są zamawiane z komercyjnych źródeł z określeniem dostawy w 12. (E12) lub 13. (E13) dniu embrionalnym rozwoju płodu lub ciąża jest ustalana wewnątrz jednostki badawczej. W skrócie, dwie samice są umieszczane razem z jednym samcem późnym popołudniem i pozostawiane razem na noc. Następnego dnia obserwuje się samice pod kątem obecności czopu śluzowego w pochwie. Czop śluzowy jest jedynie wskazówką, że doszło do kopulacji, dlatego zwierzęta są następnie ważone codziennie w celu monitorowania tempa przyrostu masy ciała. Dzień, w którym zaobserwowano czop śluzowy, definiuje się jako pierwszy dzień embrionalny (E1).
4. Pozyskiwanie tkanek
<ol>
 <li>Pracuj pod poziomym dygestorium z nawiewem laminarnym, aby zachować warunki aseptyczne.</li>
 <li>Spryskać dygestorium i obszar roboczy 70% etanolem.</li>
 <li>Sterylizować narzędzia w autoklawie lub obficie spryskać 70% etanolem.</li>
 <li>Przygotować instrumenty, podłoża i mikroskop do użycia.</li>
 <li>Wlej 20 ml schłodzonego medium do sekcji do sterylnej szalki Petriego.</li>
 <li>Zanurzyć zwierzę w narkozie za pomocą chlorku chloralu (500 mg/kg) podanego dootrzewnowo (IP), a następnie przeprowadzić dyslokację szyjną lub dekapitację.</li>
 <li>Spryskaj okolicę brzucha samicy 70-90% etanolem (dezynfekcja)</li>
 <li>Otwórz jamę brzuszną za pomocą dużych nożyczek i pęsety.
 <ol type="a">
 <li>W szczepach CD1 i C57/BL6: zazwyczaj w macicy znajduje się od 8 do 14 płodów. Liczba płodów zależy od szczepu.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Wyjąć macicę myszy wraz z płodami i umieścić w czystym naczyniu Petri z nowym, zimnym podłożem do sekcji, aby wypłukać krew i resztki tkanek z płodów.</li>
 <li>Wyjmij każdy płód z rogu macicy i oddziel go od pęcherzyka zarodkowego oraz łożyska, używając małych nożyczek. Przenieś wyjęte płody do świeżego medium do sekcji w nowej szalce Petriego.
 <ol type="a">
 <li>Medium do dyssekcji powinno być w niskiej temperaturze, aby obniżyć aktywność metaboliczną i zachować żywotność uzyskanych komórek.</li>
 <li>Od tego momentu należy pracować przy użyciu dwóch pincet oraz mikro-nożyczek chirurgicznych.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Pracując pod mikroskopem stereoskopowym, należy naciąć skórę wzdłuż rdzenia kręgowego za pomocą mikroszyder chirurgicznych, a następnie odsunąć skórę, aby odsłonić rdzeń kręgowy.</li>
 <li>Przetnij rdzeń kręgowy nożyczkami mikrosurgicalnymi na poziomie około C1 oraz u nasady ogona.</li>
 <li>Usunąć rdzeń kręgowy za pomocą kleszczyków tępych, upewniając się, że usunięto całą kość i chrząstkę, a następnie przenieść do 3B&R Szalka Petri z podłożem do preparowania.</li>
 <li>Aby zapobiec nadmiernemu rozrostowi tkanki oponowej w kolejnych kulturach komórkowych, należy dążyć do usunięcia jak największej ilości opon z rdzenia kręgowego. Ze względu na wyrastające nerwy obwodowe jest to trudniejsze niż usuwanie tkanki oponowej z wyizolowanego mózgowia.</li>
 <li>Po usunięciu opon mózgowo-rdzeniowych przenieść rdzenie kręgowe do szalki Petriego o średnicy 20 mm.</li>
 <li>Oczyścić obszar, spryskując go dokładnie 70-90% etanolem.</li>
 <li>Poniższe kroki dysocjacji należy przeprowadzić szybko, aby zachować wysoką żywotność otrzymanej tkanki rdzenia kręgowego.</li>
</ol>
5. Zakładanie hodowli
<ol>
 <li>Trypsynę należy wstępnie ogrzewać przez co najmniej 30 min w 37 °C H2Kąpiel olejowa. Należy pobrać odpowiednią alikwot z roztworu zapasowego, aby ograniczyć jego narażenie na wahania temperatury.</li>
 <li>Przenieść pobrane rdzenie kręgowe do probówki do wirowania o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml podgrzanej wcześniej trypsyny (0,05%; Quality Biologicals) i 100 μl DNAzę (10 mg/ml) i krótko homogenizować przez pipetowanie.</li>
 <li>Inkubować w 37 °C H2kąpiel w wodzie przez 10 minut.</li>
 <li>Homogenizować i inkubować przez kolejne 10 min.</li>
 <li>Dodać 5 ml medium GRP (zdefiniowanego powyżej) i odwirować przez 5 min przy 1000 RPM.</li>
 <li>Odssać supernatant i resuspendować osad w 10 ml pożywki GRP, a następnie dodać DNazę-1 (10 mg/ml; Sigma).</li>
 <li>Inkubować w 37 °C H2Kąpiel w wodzie o temperaturze 0°C przez 10 minut.</li>
 <li>Wirować przez 5 min przy 1000 obr./min i odessać nadsącz.</li>
 <li>Resuspenduj osad w świeżej pożywce GRP, a następnie odfiltruj zanieczyszczenia za pomocą sitka o rozmiarze 40 - 70 μm sito do komórek</li>
 <li>Wysiać na naczynia 25 cm pokryte PLL/lamininą2 kolby (T25) i inkubować w 37 °C, 95% wilgotności i 5% CO22.</li>
 <li>Następnego dnia należy przeprowadzić całkowitą wymianę pożywki (100%).</li>
 <li>W tym momencie GRP przyłączyły się i rozpoczęły wydłużanie wypustek.</li>
</ol>
6. Immunopanning populacji GRP
<ol>
 <li> Wysiać tkankę rdzenia kręgowego do kolbek pokrytych PLL/lamininą i hodować do momentu uzyskania 85-90% konfluencji lub przez około tydzień.</li>
 <li> Zebrać komórki, zeskrobując je z kolbek gumową skrobaczką lub przy użyciu 0.05% trypsyny, dokładnie, lecz ostrożnie utrzeć, odwirować przy 1000 RPM przez 5 min i dokładnie resuspender osad w 3 ml pożywki GRP.</li>
 <li> Przenieść po 1 ml do 3 kolbek T25 lub 3 ml do 1 kolbki T75; dodać odpowiednią objętość pożywki, aby całkowicie pokryć komórki i doprowadzić do uzyskania 80-90% konfluencji.</li>
 <li> Wymieniać pożywkę co drugi dzień, a częściej, jeśli pożywka szybko się zużywa.</li>
 <li> Pokryć czalki bakteriologiczne (75 mm) przez noc w temperaturze 4 °C przeciwciałem przeciwko IgM mysiej (Southern Biotech) w stężeniu 10 μg/ml w PBS.</li>
 <li> Odessać nadmiar buforu i przemyć czalki 3x buforem PBS.</li>
 <li> Dodać przeciwciało A2B5 (Millipore) w stężeniu 5 μg/ml rozcieńczonym w PBS i inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej (RT).</li>
 <li> Ponownie przemyć płytki 3x buforem PBS, a następnie dodać 8 ml pożywki GRP, aby zapobiec wyschnięciu płytki.</li>
 <li> Przenieść 5 ml pożywki GRP z czalek i zebrać komórki GRP, zeskrobując je z kolbek gumową skrobaczką w celu odczepienia wszystkich komórek.</li>
 <li> Krótko utrzeć zawiesinę komórkową, aby rozbić grudki, a następnie przenieść 5 ml zawiesiny komórkowej na czalki bakteriologiczne pokryte przeciwciałem A2B5.</li>
 <li> Inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej bez wytrząsania.</li>
 <li> Po 1 h odessać pożywkę i przemyć płytki 8x buforem PBS.</li>
 <li> Delikatnie zeskrobać komórki gumową skrobaczką do 2 ml pożywki GRP, a następnie przenieść na płytki lub do kolbek pokrytych PLL/lamininą z odpowiednią objętością pożywki GRP.</li>
</ol>
7. Mrożenie i przechowywanie pochodnych komórek
<ol>
 <li>Komórki zbiera się z kolby T25 lub T75 o konfluencji 85-90%, wykorzystując 2 ml 0,05% trypsyny.</li>
 <li>Trypsynę rozcieńcza się i inaktywuje za pomocą 8 ml pożywki stokowej GRP, a następnie wiruje przy 1000 obr./min przez 5 min.</li>
 <li>Osady z kolb T25 resuspendTime w 1 ml medium mrożącego GRP (podstawowe medium GRP uzupełnione o 10% (v/v) DMSO i opcjonalnie 20% FBS). Większe osady z kolb T75 rozcieńcza się dwukrotnie.</li>
 <li>zawiesiny komórkowe o stężeniu 1,5 – 3 x 1010,11,12,13 komórki przenosi się do probówek kriogenicznych (Nalgene) i przechowuje przez noc w pojemniku kriogenicznym (Nalgene) zawierającym izopropanol w temperaturze -80 °C do powolnego zamrażania przez noc.</li>
 <li>Po zamrożeniu przez noc komórki przenosi się do pudełek do zamrażarki i przechowuje od 6 miesięcy do 1 roku w temperaturze -80 °C lub przez dłuższy czas w N(l)Rozmrożone komórki wykazują zazwyczaj 60–80% żywotności, co zależy w głównej mierze od jakości powłoki z PLL/lamininy.</li>
</ol>
8. Reprezentatywne wyniki
CO2 nie jest stosowany do znieczulania zwierząt ze względu na możliwy późniejszy wpływ na żywotność płodów, a w konsekwencji na pochodne z nich komórki. Ponadto, całkowite usunięcie opon miękkich z rdzenia kręgowego podczas procedury izolacji będzie bardzo trudne, jednak połączenie pożywki GRP i immunopanningu wyeliminuje te szybko rosnące komórki. Podobnie, pobierany jest cały rdzeń kręgowy, mimo większego stężenia populacji GRP w części brzusznej, ponieważ wywodzą się one z brzusznej części rdzenia i migrują grzbietowo20. Niemniej jednak, pożywka GRP selekcjonuje fenotyp GRP, a populacja ta jest maksymalizowana poprzez immunopanning A2B5. Po wysianiu tkanek rdzenia kręgowego, hodowle in vitro są inkubowane przez dwa pasaże lub około tydzień. Po 2 dniach hodowli w kolbach do hodowli tkankowych można zaobserwować komórki o różnych morfologiach, co wskazuje na heterogenność populacji, jednak pożywka GRP selekcjonuje fenotyp GRP. Komórki te stanowią kombinację A2B5+ GRP, E-NCAM+ prekursorów ograniczonych do linii neuronalnej (NRP) oraz nestin+, A2B5- komórek neuroepithelialnych i prawdopodobnie fibronectin+ komórek oponowych. Dodatkowo mogą występować bardziej dojrzałe fenotypy wykazujące markery, w tym doublecortin i Tuj1 dla linii neuronalnej, GFAP dla astrocytów oraz PDGFaR i GalC dla linii oligodendrocytów. Aby maksymalnie wzbogacić populację GRP z początkowej heterogennej puli (Ryc. 1A), można przeprowadzić podwójny immunopanning w celu selekcji i eliminacji komórek E-NCAM+, a następnie selekcję populacji A2B5+ GRP, gdy gęstość komórek w kolbach T75 wzrośnie do około 85-90% konfluencji. Komórki GRP zachowują zdolność do przekształcania się w astrocyty mimo przebywania w pożywce selekcjonującej fenotyp oligodendrocytów, dlatego może być konieczny kolejny immunopanning A2B5 w celu utrzymania silnie wzbogaconej populacji GRP. Immunopanning zazwyczaj pozwala uzyskać do 95% komórek A2B5+, ale dla jeszcze większej wydajności można zastosować magnetyczne koraliki sprzężone z A2B5 (Miltenyi Biotec Inc.), co pozwala osiągnąć wydajność do 97%. Sumienność w utrzymaniu hodowli GRP, taka jak regularne zmiany pożywki, zminimalizuje proliferację nietypowych dla GRP typów komórek. Nawet w przypadku braku BMP-4 mogą nadal występować astrocyty, a w szczególności wyczerpana pożywka wydaje się indukować różnicowanie w kierunku fenotypu astrocytarnego. Chociaż suplement B27 zawiera hormon trijodotyroninę (T3), w populacji GRP nie zaobserwowano tendencji do różnicowania się w oligodendrocyty; zjawisko to występuje tylko wtedy, gdy do pożywki dodano wyższe stężenia T3. Jeśli jednak istnieje obawa przed zanieczyszczeniem dojrzałymi oligodendrocytami, można zastosować suplement B27 wolny od T3 (Ryc. 1B). Komórki GRP można łatwo zidentyfikować po ich morfologii – mały soma z 2 lub 3 krótkimi wypustkami – jednak w celu przesiewowego badania innych typów komórek, które mogą być obecne, można przeprowadzić immunocytochemię na wcześniej wymienione wspólne markery rozwojowe i specyficzne dla typów komórek. Zazwyczaj występuje niewielka, trwała populacja komórek A2B5-, które są neuroepithelialne (NEP) i zdolne do przekształcenia się w GRP lub NRP. Na szczęście, im dłużej komórki są utrzymywane w pożywce GRP, tym bardziej prawdopodobne jest, że pożywka ta wyselekcjonuje fenotyp GRP.
<img alt="Proces różnicowania OPC; komórki GRP w medium dla OPC; obrazy mikroskopowe; morfologia komórkowa." src="/files/ftp_upload/3462/3462fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1.">
Rysunek 1. a) Po 2 dniach hodowli obserwuje się wysiane komórki rdzenia kręgowego o heterogenicznej morfologii. b) Immunopanning pozwala na wyizolowanie maksymalnej liczby komórek z populacji silnie wzbogaconej w GRP z początkowej heterogenicznej puli.

<ol><li>Kalyani, A., Hobson, K., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroepithelial+stem+cells+from+the+embryonic+spinal+cord%3A+isolation%2C+characterization%2C+and+clonal+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Neuroepithelial stem cells from the embryonic spinal cord: isolation, characterization, and clonal analysis.</a> Developmental biology. 186, 202-202 (1997).</li>
<li>Rao, M. S., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial-restricted+precursors+are+derived+from+multipotent+neuroepithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Glial-restricted precursors are derived from multipotent neuroepithelial stem cells.</a> Developmental biology. 188, 48-48 (1997).</li>
<li>Goldman, S. A., Lang, J., Roy, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+cell-based+myelination+as+a+model+for+cell-based+therapy+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Ernst+Schering+Research+Foundation+workshop%22%5BJournal%5D)">Progenitor cell-based myelination as a model for cell-based therapy of the central nervous system.</a> Ernst Schering Research Foundation workshop. (60), 195-195 (2006).</li>
<li>Goldman, S. A., Schanz, S., Windrem, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-based+strategies+for+treating+pediatric+disorders+of+myelin%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Stem cell-based strategies for treating pediatric disorders of myelin.</a> Human molecular genetics. 17, 76-76 (2008).</li>
<li>Goldman, S. A., Windrem, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+replacement+therapy+in+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+transactions+of+the+Royal+Society+of+London%22%5BJournal%5D)">Cell replacement therapy in neurological disease.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. 361, 1463-1463 (2006).</li>
<li>Walczak, P., All, A. H., Rumpal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+glial-restricted+progenitors+survive%2C+proliferate%2C+and+preserve+electrophysiological+function+in+rats+with+focal+inflammatory+spinal+cord+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Human glial-restricted progenitors survive, proliferate, and preserve electrophysiological function in rats with focal inflammatory spinal cord demyelination.</a> Glia. 59, 499-499 (2011).</li>
<li>Liu, S., Qu, Y., Stewart, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+differentiate+into+oligodendrocytes+and+myelinate+in+culture+and+after+spinal+cord+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 6126-6126 (2000).</li>
<li>Windrem, M. S., Schanz, S. J., Guo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+chimerization+with+human+glial+progenitor+cells+can+both+remyelinate+and+rescue+the+otherwise+lethally+hypomyelinated+shiverer+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Neonatal chimerization with human glial progenitor cells can both remyelinate and rescue the otherwise lethally hypomyelinated shiverer mouse.</a> Cell stem cell. 2, 553-553 (2008).</li>
<li>Groves, A. K., Barnett, S. C., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+demyelinated+lesions+by+transplantation+of+purified+O-2A+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Repair of demyelinated lesions by transplantation of purified O-2A progenitor cells.</a> Nature. 362, 453-453 (1993).</li>
<li>Back, S. A., Han, B. H., Luo, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+vulnerability+of+late+oligodendrocyte+progenitors+to+hypoxia-ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective vulnerability of late oligodendrocyte progenitors to hypoxia-ischemia.</a> J. Neurosci. 22, 455-45 (2002).</li>
<li>Johnston, M. V., Trescher, W. H., Ishida, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobiology+of+hypoxic-ischemic+injury+in+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+research%22%5BJournal%5D)">Neurobiology of hypoxic-ischemic injury in the developing brain.</a> Pediatric research. 49, 735-735 (2001).</li>
<li>Lepore, A. C., Han, S. S., Tyler-Polsz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+fate+of+multipotent+and+lineage-restricted+neural+precursors+following+transplantation+into+the+adult+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron+glia+biology%22%5BJournal%5D)">Differential fate of multipotent and lineage-restricted neural precursors following transplantation into the adult CNS.</a> Neuron glia biology. 1, 113-113 (2004).</li>
<li>Rothstein, J. D., Dykes-Hoberg, M., Pardo, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+of+glutamate+transporters+reveals+a+major+role+for+astroglial+transport+in+excitotoxicity+and+clearance+of+glutamate%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knockout of glutamate transporters reveals a major role for astroglial transport in excitotoxicity and clearance of glutamate.</a> Neuron. 16, 675-675 (1996).</li>
<li>Johnston, M. V., Ferriero, D. M., Vannucci, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+cerebral+palsy%3A+which+ones+are+best%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+child+neurology%22%5BJournal%5D)">Models of cerebral palsy: which ones are best.</a> Journal of child neurology. 20, 984-98 (2005).</li>
<li>Comi, A. M., Johnston, M. V., Wilson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+variability%2C+injury+distribution%2C+and+seizure+onset+in+a+mouse+model+of+stroke+in+the+immature+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Strain variability, injury distribution, and seizure onset in a mouse model of stroke in the immature brain.</a> Developmental neuroscience. 27, 127-127 (2005).</li>
<li>Comi, A. M., Weisz, C. J., Highet, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+of+stroke+and+ischemic+seizures+in+the+immature+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+neurology%22%5BJournal%5D)">A new model of stroke and ischemic seizures in the immature mouse.</a> Pediatric neurology. 31, 254-254 (2004).</li>
<li>Dietrich, J., Noble, M., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+A2B5%2B+glial+precursor+cells+from+cryopreserved+human+fetal+brain+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Characterization of A2B5+ glial precursor cells from cryopreserved human fetal brain progenitor cells.</a> Glia. 40, (2002).</li>
<li>Alberdi, E., Sanchez-Gomez, M. V., Marino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+influx+through+AMPA+or+kainate+receptors+alone+is+sufficient+to+initiate+excitotoxicity+in+cultured+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+disease%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) influx through AMPA or kainate receptors alone is sufficient to initiate excitotoxicity in cultured oligodendrocytes.</a> Neurobiology of disease. 9, 234-234 (2002).</li>
<li>Volpe, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+injury+in+premature+infants%3A+a+complex+amalgam+of+destructive+and+developmental+disturbances%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+neurology%22%5BJournal%5D)">Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances.</a> Lancet neurology. 8, 110-110 (2009).</li>
<li>Warf, B. C., Fok-Seang, J., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+ventral+origin+of+oligodendrocyte+precursors+in+the+rat+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Evidence for the ventral origin of oligodendrocyte precursors in the rat spinal cord.</a> J. Neurosci. 11, 2477-2477 (1991).</li>
<li>Deng, W., Poretz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendroglia+in+developmental+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Oligodendroglia in developmental neurotoxicity.</a> Neurotoxicology. 24, 161-161 (2003).</li>
<li>Deng, W., Rosenberg, P. A., Volpe, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-permeable+AMPA%2Fkainate+receptors+mediate+toxicity+and+preconditioning+by+oxygen-glucose+deprivation+in+oligodendrocyte+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Calcium-permeable AMPA/kainate receptors mediate toxicity and preconditioning by oxygen-glucose deprivation in oligodendrocyte precursors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 6801-6801 (2003).</li>
<li>Karadottir, R., Cavelier, P., Bergersen, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptors+are+expressed+in+oligodendrocytes+and+activated+in+ischaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">NMDA receptors are expressed in oligodendrocytes and activated in ischaemia.</a> Nature. 438, 1162-1162 (2005).</li>
<li>Pleasure, D., Soulika, A., Singh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+in+white+matter%3A+clinical+and+pathophysiological+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Mental+retardation+and+developmental+disabilities+research+reviews%22%5BJournal%5D)">Inflammation in white matter: clinical and pathophysiological aspects.</a> Mental retardation and developmental disabilities research reviews. 12, 141-141 (2006).</li>
<li>Gregori, N., Proschel, C., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tripotential+glial-restricted+precursor+%28GRP%29+cell+and+glial+development+in+the+spinal+cord%3A+generation+of+bipotential+oligodendrocyte-type-2+astrocyte+progenitor+cells+and+dorsal-ventral+differences+in+GRP+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The tripotential glial-restricted precursor (GRP) cell and glial development in the spinal cord: generation of bipotential oligodendrocyte-type-2 astrocyte progenitor cells and dorsal-ventral differences in GRP cell function.</a> J. Neurosci. 22, 248-248 (2002).</li>
<li>Rao, M. S., Noble, M., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tripotential+glial+precursor+cell+is+present+in+the+developing+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A tripotential glial precursor cell is present in the developing spinal cord.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3996-3996 (1998).</li>
<li>Raff, M. C., Miller, R. H., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glial+progenitor+cell+that+develops+in+vitro+into+an+astrocyte+or+an+oligodendrocyte+depending+on+culture+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium.</a> Nature. 303, 390-390 (1983).</li>
<li>Strathmann, F. G., Wang, X., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+novel+glial-restricted+cell+populations+in+the+embryonic+telencephalon+arising+from+unique+origins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Identification of two novel glial-restricted cell populations in the embryonic telencephalon arising from unique origins.</a> BMC developmental biology. 7, 33-33 (2007).</li>
<li>Nunes, M. C., Roy, N. S., Keyoung, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+isolation+of+multipotential+neural+progenitor+cells+from+the+subcortical+white+matter+of+the+adult+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain.</a> Nature. 9, 439-439 (2003).</li>
<li>Roy, N. S., Wang, S., Harrison-Restelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+isolation%2C+and+promoter-defined+separation+of+mitotic+oligodendrocyte+progenitor+cells+from+the+adult+human+subcortical+white+matter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification, isolation, and promoter-defined separation of mitotic oligodendrocyte progenitor cells from the adult human subcortical white matter.</a> J. Neurosci. 19, 9986-9986 (1999).</li>
<li>Chen, Y., Balasubramaniyan, V., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nature protocols. 2, 1044-1044 (2007).</li>
</ol>

Badanie to zostało sfinansowane przez National Institute of Health [NICHD P30HD024061 (A.W.P.), NINDS K08NS063956 (A.F.) oraz R01NS028208 (M.V.J.)] oraz Child Neurology Foundation. Treść niniejszego raportu jest wyłączną odpowiedzialnością autorów i nie musi reprezentować oficjalnych opinii National Institute of Health oraz DHHS. Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów związanych z niniejszym badaniem.

Zaburzenia istoty białej ośrodkowego układu nerwowego obejmują szeroki zakres etiologii, w tym przyczyny genetyczne, zapalne, niedokrwienne i toksyczne19,21,22,23,24. Podczas gdy stwardnienie rozsiane i naczyniopatie są głównymi przyczynami chorób istoty białej u dorosłych, leukomalacja okołokomorowa związana z przedwczesnym urodzeniem jest najczęstszą przyczyną uszkodzenia istoty białej w populacji dziecięcej. Aby dokładniej określić mechanizmy choroby, wymagane są dalsze badania nad komórkami linii oligodendrocytycznej, które ulegają znacznemu uszkodzeniu w wyniku urazów okołoporodowych. Wykazano, że GRP wyizolowane z zarodkowego rdzenia kręgowego gryzoni mają charakter tripotencjalny, dając początek oligodendrocytom i dwóm odrębnym populacjom astrocytów, ale nie różnicują się w neurony2,25,26. Podobnie wykazano, że komórki prekursorowe oligodendrocytów (OPC) pochodzące z nerwu wzrokowego szczura oraz z późnego okresu embrionalnego lub wczesnego okresu ponatalnego mózgu szczura dojrzewają do funkcjonalnych oligodendrocytów w odpowiednich warunkach hodowlanych27,28. Ponadto ludzkie OPC pochodzenia płodowego lub dorosłego były poddawane dalszym manipulacjom w celu uzyskania bardziej dojrzałych fenotypów oligodendrocytów29,30.
 Komórki GRP zostały wyizolowane zarówno z rdzenia kręgowego szczurów w stadium E13.5, jak i myszy w stadium E12-13.5. U szczurów zgłoszono różnice w odpowiedzi komórek GRP pochodzących z części grzbietowej i brzusznej na warunki sprzyjające generowaniu oligodendrocytów lub astrocytów, przy czym komórki GRP pochodzenia brzusznego wykazywały większą skłonność do różnicowania się w bardziej dojrzałe fenotypy25,26,28. Może to wynikać z migracji nowo powstałych komórek GRP z części brzusznej do grzbietowej, w wyniku której mogą one być mniej podatne na sygnały różnicowania. Immunopanning pozwala na wyizolowanie i zebranie subpopulacji wykazującej ekspresję A2B5 w celu ich utrzymania w hodowli.
 Nasze hodowle mysich komórek GRP pochodzą z całkowitej tkanki rdzenia kręgowego, która dostarcza heterogenną, zmieszaną populację komórek, z której komórki GRP są wybierywane za pomocą technik chemicznych (podłoże) oraz opartych na przeciwciałach. Podczas gdy w naszych badaniach wykorzystano mysie komórki GRP pochodzące z rdzenia kręgowego, w literaturze donoszono ostatnio o uzyskaniu mysich komórek progenitorowych oligodendrocytów pochodzących z mózgu, które również są zdolne do przekształcenia się w dojrzałe oligodendrocyty31. W tym przypadku uzyskane komórki są początkowo hodowane jako oligosfery, które przy zastosowaniu odpowiedniego podłoża hodowlanego są przekształcane w wzbogaconą populację OPC PDGFαR+31. Nasze badania koncentrowały się na wpływie naszego modelu niedotleniająco- Niedokrwiennego uszkodzenia na komórki w spektrum linii oligodendrocytów, od prekursorów GRP A2B5+, PDGFαR- do dojrzałych oligodendrocytów wykazujących ekspresję białka podstawowego mieliny (MBP+). Rzeczywiście, nasza charakterystyka in vitro wykazała, że te niedojrzałe komórki GRP dojrzewają do komórek wykazujących ekspresję MBP zarówno w monokulturach, jak i w kokulturach z neuronami korowymi. Komórki te można modyfikować w hodowli w kierunku specyficznych ścieżek różnicowania w celu badania mechanizmów zaangażowanych w okołoporowe uszkodzenie istoty białej. Istnieje kilka mysich modeli chorób istoty białej z udziałem komórek linii oligodendrocytów, a dostępność tej populacji pozwala na dokładne zbadanie mechanizmów powodujących uszkodzenia, a także na sprawdzenie użyteczności potencjalnych opcji terapii komórkowej.

<table><tbody><tr><td>DMEM/ F12 1:1</td><td>Invitrogen</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>rH-FGF-basic</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0026</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna (0,05%) EDTA</td><td>Quality Biological, Inc.</td><td>118-087-721</td><td></td></tr><tr><td>POLY-L-LYSINE HBr</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1274-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>DNaza 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr></tbody></table>

wyizolowanie prekursorów ograniczonych do linii glejowej (grp) od myszy w 13. dniu embrionalnym (e13)

Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

Niniejszy protokół opisuje metodę izolacji glialnych prekursorów ograniczonych (GRP) z rdzenia kręgowego płodów myszy w 13. dniu embrionalnym (E13). Komórki te są wczesnymi prekursorami w linii komórkowej oligodendrocytów. W ostatnim czasie badano je jako potencjalne źródło terapii regeneracyjnych w chorobach istoty białej. Leukomalacja okołokomorowa (PVL) jest główną przyczyną niegenetycznych chorób istoty białej w dzieciństwie i dotyka do 50% skrajnie przedwcześnie urodzonych niemowląt. Dane sugerują zwiększoną podatność rozwijającego się mózgu na niedotlenienie-niedokrwienie, stres oksydacyjny oraz ekscytotoksyczność, które selektywnie atakują nowo powstającą istotę białą. Glialne prekursory ograniczone (GRP), komórki progenitorowe oligodendrocytów (OPC) oraz niedojrzałe oligodendrocyty (preOL) wydają się odgrywać kluczową rolę w rozwoju PVL i są przedmiotem ciągłych badań. Ponadto poprzednie analizy zidentyfikowały podzbiór tkanki OUN o zwiększonej podatności na ekscytotoksyczność glutaminianową, a także wykazano istnienie wzorca rozwojowego tej podatności. Nasze laboratorium obecnie bada rolę progenitorów oligodendrocytów w PVL, wykorzystując komórki na etapie rozwoju GRP. Wykorzystujemy te wyizolowane komórki GRP w kilku paradygmatach doświadczalnych, aby przetestować ich reakcję na wybrane stresory zgodne z patogenezą PVL. Komórki GRP mogą być przekształcane in vitro w OPC i preOL na potrzeby eksperymentów transplantacyjnych w mysich modelach PVL oraz w modelach in vitro uszkodzeń typu PVL, w tym niedotlenienia-niedokrwienia. Zastosowanie hodowli komórkowych i badań in vitro pozwala na zmniejszenie zmienności między eksperymentami, co ułatwia interpretację danych. Hodowle komórkowe umożliwiają również wzbogacenie populacji GRP przy jednoczesnym zminimalizowaniu wpływu zanieczyszczeń komórkami o fenotypie innym niż GRP.

Niniejszy protokół opisuje metodę otrzymywania prekursorów ograniczeń glejowych (Glial Restricted Precursors) z płodowych rdzeni kręgowych oraz ich utrzymywanie in vitro w celu transplantacji lub badania linii oligodendrocytów.

Wyizolowanie prekursorów ograniczonych do linii glejowej (GRP) od myszy w 13. dniu embrionalnym (E13)

Niniejszy protokół opisuje metodę pozyskiwania komórek prekursorowych ograniczonych do linii glejowej (GRP) z rdzenia kręgowego płodów myszy w 13. dniu embrionalnym (E13). Komórki te są wczesnymi prekursorami...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie prekursorów ograniczonych do glejocytów lub komórek GRP z płodowych rdzeni kręgowych. Osiąga się to poprzez wyizolowanie rdzeni kręgowych z płodów w 13. dniu embrionalnym (E 13) i przeniesienie ich na płytki hodowlane z selektywnym medium GRP. Następnie zastosowano immunoprecypitację (immuno panning) w celu wzbogacenia populacji GRP i wyeliminowania linii komórek innych niż GRP.Oczyszczone komórki GRP można zamrozić i poddać długoterminowemu przechowywaniu. Oczyszczone komórki GRP można rozmrozić i wykorzystać w przyszłych eksperymentach, takich jak wykazanie migracji przeszczepionych komórek GRP przez przejście o szerokości jednej komórki. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy chirurgiczne mogą być trudne do opanowania, zwłaszcza dla osób niedoświadczonych.Prezentatorami są Roche De Silva i Joel Marx, studenci w naszym laboratorium. Pozyskaj ciężarne samice myszy w 12. lub 13. dniu embrionalnym (E 12 lub E 13) rozwoju płodu z komercyjnego źródła lub przygotowane wewnętrznie. Dzień E 1 definiuje obecność czopu śluzowego w pochwie.Dzień po umieszczeniu samicy w klatce z samcem, po uprzednim wysterylizowaniu wszystkich narzędzi i komory przepływu laminarnego do hodowli tkanek, przygotuj czystą szalkę Petriego z 20 mililitrami zimnego medium do sekcji. Następnie przygotuj mysz, podając zastrzyk z chlorkiem chloralu w celu znieczulenia.Gdy mysz przestanie wykazywać odruch bólowy, na przykład po uciśnięciu palca u stopy, należy ją eutanazować poprzez zwichnięcie stawów szyjnych lub gilotynowanie. Unikamy stosowania CO2 do znieczulania zwierząt ze względu na możliwy późniejszy wpływ na żywotność płodów i w konsekwencji na pochodne z nich komórki. Po zdezynfekowaniu obszaru brzucha należy go otworzyć za pomocą dużych nożyczek i pęsety, aby wyciąć macicę. W zależności od szczepu w macicy znajdzie się od 8 do 14 płodów.Umieść macicę w czystej płytce Petri z nowym, zimnym medium do sekcji, aby wyizolować płody. Najpierw wypłucz krew i nadmiar tkanek. Następnie wyjmij każdy płód z rogu macicy i oddziel go od pęcherzyka zarodkowego oraz łożyska.Za pomocą małych nożyczek przenieś płody do naczynia z nową, chłodną pożywką do sekcji. Chłodna pożywka obniży aktywność metaboliczną i zachowa żywotność uzyskanych komórek. Pod mikroskopem sekcyjnym użyj pęsety i nożyczek sprężynowych, aby naciąć skórę wzdłuż rdzenia kręgowego, odsunąć ją i odsłonić rdzeń kręgowy.Przetnij rdzeń kręgowy na poziomie około C1 oraz na początku ogona. Następnie ostrożnie usuń rdzeń kręgowy wraz z otaczającymi go kośćmi i chrząstkami, a każdy przygotowany rdzeń kręgowy umieść w oddzielnejy szalce. Używając świeżego medium do sekcji, pobieramy cały rdzeń kręgowy, mimo że większa populacja komórek GRP znajduje się w określonych obszarach.Ostatecznie jednak pożywka GRP selekcjonuje fenotyp GRP, a populacja ta jest dalej maksymalizowana przez przeciwciała anty-H2B5, aby zapobiec przerostowi tkanki oponowej. W kolejnych hodowlach komórkowych należy usunąć z rdzenia kręgowego jak najwięcej opon ze względu na nowo powstające, wystające nerwy obwodowe. Jest to trudniejsze niż usuwanie tkanki oponowej z wyekstrahowanego mózgu.Po usunięciu tak dużej części opon mózgowo-rdzeniowych, jak to tylko możliwe, przenieść rdzenie kręgowe do szalki Petriego o średnicy 20 mm i przystąpić do dysocjacji komórek w preparacie. Podgrzać alykwot trypsyny przez co najmniej pół godziny w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.Następujące kroki należy wykonać szybko, aby zwiększyć żywotność uzyskanej tkanki rdzenia kręgowego. Przenieś rdzenie kręgowe do probówki wirnikowej o pojemności 50 ml zawierającej trypsynę i DNazy. Następnie krótko potraktuj mieszaninę trituracją za pomocą pipety.Inkubuj mieszaninę przez 10 minut w temperaturze 37°C. Wymieszaj ją ponownie, a następnie kontynuuj inkubację przez kolejne 10 minut. Następnie dodaj 5 mL medium GRP i wiruj w wirówce przez pięć minut.Przy 1000 RPM odessaj supernatant i ponownie zawieś. Zawieś osad w 10 mililitrach medium GRP z DNAs one. Następnie inkubuj przez kolejne 10 minut i odwiruj komórki przy 1000 RPM przez pięć minut.Odssać supernatant i resuspendować osad w świeżej pożywce GRP. Przepuścić komórki przez sito komórkowe o rozmiarze oczek od 40 do 70 µm i wysiać je na kolby T 25 powlekane PLL i lamininą.Inkubować komórki, a następnego dnia wymienić 100% pożywki, a następnie co drugi dzień lub częściej, jeśli składniki odżywcze zostaną wyczerpane. Na tym etapie GRP przyczepiły się i zaczęły wysyłać wypustki; proces ten można zoptymalizować za pomocą immunoselekcji (immuno panning). Kontynuować hodowlę komórek aż do osiągnięcia 85 do 90% konfluencji lub do upływu tygodnia.Następnie zebrać komórki za pomocą gumowego skrobaka lub trypsyny. Ponownie zawiesić komórki w świeżej pożywce i prowadzić ich ekspansję w trzech kolbach T 25, wymieniając pożywkę co najmniej co 48 godzin. Gdy kolby osiągną pełną konfluencję, zebrać komórki w ten sam sposób do pięciu mililitrów pożywki GRP. Triturację zawiesiny komórkowej przeprowadzić w celu rozbicia skupisk, a następnie przenieść je do dwóch kolb 25 powlekanych bakteriologicznie.Szalki Petri z komórkami inkubuje się na płytkach A dwie B przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej bez wytrząsania. Następnie odsysa się medium i płucze płytki od czterech do ośmiu razy PBS, aby zachować wysoką rygorystyczność w celu uniknięcia niespecyficznego wiązania komórek z płytką. Do tego celu używa się gumowej łopatki (rubber policeman).Zebrać wypłukane komórki do dwóch mililitrów pożywki GRP, a następnie przenieść zawiesinę na płytki lub kolby powlekane lamininą PLL z pożywką GRP. Po osiągnięciu przez komórki konfluencji na poziomie 85 do 90%, zebrać je przy użyciu trypsyny, następnie rozcieńczyć i inaktywować trypsynę ośmioma mililitrami pożywki zapasowej GRP i odwirować komórki do postaci pelletu. Resuspender komórki z kolby T 25 w jednym mililitrze medium do zamrażania GRP lub komórki z kolby T 75 w dwóch mililitrach medium do zamrażania GRP.W razie potrzeby dostosuj stężenie zawiesiny komórkowej, a następnie przenieś komórki do fiolek kriogenicznych; powoli zamrażaj komórki przez noc w pojemniku kriogenicznym zawierającym izopropanol w temperaturze -80 °C. Następnego dnia przenieś komórki do przechowywania długoterminowego. Po rozmrożeniu od sześciu miesięcy do jednego roku przeżywalność komórek będzie wynosić od 60 do 80%.Żywotność zależy w dużej mierze od jakości powłoki z PLL i lamininy. Po dwóch dniach hodowli zaobserwowano maksymalne wzbogacenie wysianych komórek rdzenia kręgowego o różnej morfologii. Populacja komórek GRP jest poddawana immunoselekcji w celu wyodrębnienia populacji A dwa B pięć.Jeśli występuje problem z kontaminacją komórkami neuroepitelialnymi, można zastosować podwójny immuno-panning, aby najpierw wyeliminować populację NCAM-dodatnią, a następnie przeprowadzić selekcję A2B5. W celu ograniczenia kontaminacji dojrzałymi oligodendrocytami dodano suplement N2B27. Oczyszczone komórki GRP można było zidentyfikować po ich małych somach oraz dwóch lub trzech krótkich wypustkach.Często występowała również niewielka, trwała populacja komórek A two B five negatywnych, które były neuroepitelialne i zdolne do przekształcenia się w GRP lub N rp. Na szczęście, im dłużej komórki były utrzymywane na medium GRP, tym bardziej prawdopodobne było przyjęcie przez nie fenotypu GRP. Podstawowe techniki tej procedury mogą być wykorzystane do otrzymania innych typów komórek, co pozwoli odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, która komórka jest lepiej dostosowana do terapii zastępczej komórek lub czy neurony pochodzące z kory mogą być dobrymi modelami mielinizacji in vitro.

derivation-of-glial-restricted-precursors-from-e13-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Pochodzenie ograniczonych prekursorów glialnych od myszy E13

W tym filmie opisano metodę izolacji neuroprekursorów z rozwijającej się kory zarodków myszy. Przedstawiono procedurę usuwania zarodków z macicy, wycinania tkanki korowej oraz trawienia wyizolowanej kory mózgu.

Hodowla prekursorów neuronalnych komórek macierzystych myszy

Film demonstrował metodę izolowania i hodowli komórek z mózgu noworodka myszy. Polegało to na enzymatycznej i mechanicznej dysocjacji mózgu, a następnie hodowli w pożywkach wzrostowych pozbawionych neuronalnego czynnika wzrostu w celu uzyskania mieszanej populacji glejowej.

Uzyskiwanie mieszanej hodowli komórek glejowych z mózgu noworodka myszy

Przeszczep komórek macierzystych/progenitorowych (NPC) jest bardzo obiecujący w neurologii regeneracyjnej. Systemowe dostarczanie NPC przekształciło się w skuteczny, mało inwazyjny i bardzo skuteczny terapeutycznie protokół dostarczania komórek macierzystych do mózgu i rdzenia kręgowego gryzoni i naczelnych dotkniętych eksperymentalnym przewlekłym uszkodzeniem zapalnym ośrodkowego układu nerwowego.

Systemowe wstrzykiwanie nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych u myszy z przewlekłym EAE

Ta procedura pokazuje, jak celować w interneurony w rozwijającym się przodomózgowiu myszy za pomocą elektroporacji in utero. Technika ta okazała się szczególnie skuteczna w osiąganiu selektywnej ekspresji genów w podtypach interneuronów przeznaczonych do powierzchownych warstw kory mózgowej.

Elektroporacja selektywna dla podtypów interneuronów korowych

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych dostarcza fascynujących perspektyw dla pochodnych autologicznych przeszczepów. Jednak progresja przez stan pluripotencjalny i pracochłonne różnicowanie nadal utrudnia translację kliniczną. Tutaj opisujemy pochodzenie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednią konwersję do indukowanych nerwowych komórek progenitorowych, a następnie różnicowanie w linie nerwowe.

Wyprowadzanie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednia konwersja do ekspandowalnych nerwowych komórek progenitorowych

Ten protokół opisuje metodę generowania prekursorów interneuronów korowych i prekursorów interneuronów postmitotycznych z embrionalnych komórek macierzystych myszy przy użyciu zmodyfikowanej metody embrionalnej ciała do monowarstwy. Te progenitory/prekursory mogą być używane in vitro lub sortowane fluorescencyjnie i przeszczepiane do kory nowej noworodka w celu badania determinacji losu lub wykorzystywane w zastosowaniach terapeutycznych.

Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy w prekursory interneuronów korowych

Tutaj opisujemy izolację komórek glejowych jelitowych z błony podśluzowej jelita za pomocą sekwencyjnych inkubacji EDTA do chelatowania kationów dwuwartościowych, a następnie inkubacji w nieenzymatycznym roztworze do odzyskiwania komórek. Posiewanie powstałej zawiesiny komórkowej na poli-D-lizynie i lamininie daje w wyniku wysoce wzbogaconą hodowlę komórek glejowych podśluzówkowych do analizy funkcjonalnej.

Izolacja komórek glejowych jelitowych z błony podśluzowej i blaszki właściwej dorosłej myszy

Tutaj wprowadzamy nowatorską technikę mikrochirurgiczną do izolacji nerwowych komórek macierzystych z wyniosłości zwojowej zarodka myszy E13.

Izolacja i hodowla embrionalnych mysich nerwowych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy protokół izolacji in vitro wielu populacji komórek glejowych z ośrodkowego układu nerwowego myszy. Metoda ta pozwala na segregację regionalnego mikrogleju, komórek prekursorowych oligodendrocytów i astrocytów w celu zbadania fenotypów każdego z nich w różnych systemach hodowli.

Rozwarstwienie i izolacja mysiego gleju z wielu regionów ośrodkowego układu nerwowego

Opisujemy procedurę różnicowania in vitro embrionalnych komórek macierzystych myszy w komórki neuronalne za pomocą metody wiszącej kropli. Ponadto przeprowadzamy kompleksową analizę fenotypową za pomocą RT-qPCR, immunofluorescencji, sekwencjonowania RNA i cytometrii przepływowej.

Różnicowanie i charakterystyka neuronalnych progenitorów i neuronów z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Podczas rozwoju kory mózgowej, neurony i komórki glejowe pochodzą ze strefy komorowej wyściełającej komorę i migrują w kierunku powierzchni mózgu. W proces ten zaangażowanych jest wiele genów. Protokół ten wprowadza technikę obrazowania poklatkowego migrujących neuronów i komórek progenitorowych glejowych.

Obrazowanie poklatkowe migrujących neuronów i progenitorów glejowych w embrionalnych wycinkach mózgu myszy

Poznaj metodę wyprowadzania prekursorów z ograniczeniami glejowymi z rdzenia kręgowego płodów myszy E13. Protokół obejmuje izolację, hodowlę i immuno-panning komórek GRP do badań nad rozwojem oligodendrocytów.

Wyizolowanie prekursorów ograniczonych do linii glejowej (GRP) od myszy w 13. dniu embrionalnym (E13)

Przeglądaj więcej filmów