Name: Bezpośrednie wykrywanie aktywności enzymatycznej kinazy octanowej tworzącej octan (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Poznaj metodę bezpośredniego pomiaru aktywności kinazy octanowej poprzez oznaczanie zużycia acetylofosforanu. Technika ta umożliwia wyznaczenie parametrów kinetycznych enzymu i może być zastosowana do innych enzymów wykorzystujących acetylofosforan.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez grant NSF nr 0920274 oraz projekt South Carolina Experiment Station (SC-1700340) przyznany KSS. Niniejsza publikacja stanowi Wkład Techniczny nr 5929 Stacji Doświadczalnej Uniwersytetu Clemson.

Ogólny schemat tego protokołu przedstawiono na Rysunku 1.
1. Przygotowanie roztworów do krzywych wzorcowych i analiz
<ol>
	<li>Przygotować 100 mL 2 mol/L roztworu chlorowodorku hydroksyloaminy. Odważyć 13,9 g chlorowodorku hydroksyloaminy (MW 69,49 g/mol) i rozpuścić w około 50 mL destylowanej wody dejonizowanej (ddH2O). Dostosować pH do wartości 7,0 przy użyciu granulek wodorotlenku potasu lub roztworu stężonego. Doprowadzić objętość końcową do 100 mL. Roztwór można przechowywać w temperaturze pokojowej do 30 dni lub w 4 °C do 90 dni.</li>
	<li>Przygotować 100 mL roztworu chlorku żelaza(III) i kwasu solnego. Odważyć 13,5 g chlorku żelaza(III) (MW 270,32 g/mol) i rozpuścić w około 50 mL ddH2O. Dodać 41,3 mL stężonego kwasu solnego (12,1 mol/L) i doprowadzić do objętości końcowej 100 mL. Końcowe stężenie chlorku żelaza(III) wyniesie 0,5 mol/L, a końcowe stężenie kwasu solnego 5 mol/L. Roztwór przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować 100 mL 1,84 mol/L roztworu kwasu trichlorooctowego. Odważyć 30,0 g kwasu trichlorooctowego (MW 163,39 g/mol), rozpuścić w ddH2O i doprowadzić objętość końcową do 100 mL. Roztwór przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować 5 mL 0,1 mol/L roztworu fosforanu acetylowego. Odważyć 0,092 g fosforanu acetylowego (MW 184,06 g/mol), rozpuścić w ddH2O i doprowadzić objętość końcową do 5 mL. Rozdzielić roztwór do probówek do mikrocentryfugi (0,25 mL na probówkę) i zamrozić w -20 °C do momentu użycia. Rozmrożony roztwór należy umieścić na lodzie; można go używać przez około 1 godzinę. Rozmrożonego roztworu fosforanu acetylowego nie należy ponownie zamrażać ani wykorzystywać ponownie.</li>
	<li>Przygotować 5 mL 0,1 mol/L roztworu ADP. Odważyć 0,24 g ADP (MW 472,5 g/mol), rozpuścić w ddH2O i doprowadzić objętość końcową do 5 mL. Rozdzielić roztwór do probówek do mikrocentryfugi (0,5 mL na probówkę) i zamrozić w -20 °C do momentu użycia. Rozmrożony roztwór przechowywać na lodzie do czasu użycia.</li>
	<li>Przygotować 50 mL 1 mol/L roztworu Tris. Odważyć 6,06 g Tris (MW 121,14 g/mol) i rozpuścić w 40 mL ddH2O. Dostosować pH roztworu do 7,0 za pomocą kwasu solnego i doprowadzić objętość końcową do 50 mL. Roztwór przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować 10 mL 1 mol/L roztworu chlorku magnezu. Odważyć 2,03 g chlorku magnezu (MW 203,31 g/mol), rozpuścić w ddH2O i doprowadzić objętość końcową do 10 mL. Roztwór przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować 25 mL roztworu wywołującego poprzez zmieszanie równych objętości roztworu chlorku żelaza(III)/kwasu solnego oraz roztworu kwasu trichlorooctowego. Roztwór wywołujący należy przygotowywać codziennie na świeżo i przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
2. Przygotowanie krzywej wzorcowej dla fosforanu acetylowego
<ol>
	<li>Krzywą wzorcową dla fosforanu acetylowego tworzy się przy użyciu znanych ilości fosforanu acetylowego. Odpowiednia jest krzywa wzorcowa składająca się z sześciu do ośmiu punktów. Stężenia wzorców powinny mieścić się w zakresie od 0,03 μmoles do 0,9 μmoles na 300 μL, co odpowiada stężeniom końcowym od 0,1 do 3 mmol/L. Roztwór zapasowy fosforanu acetylowego należy rozcieńczyć do odpowiednich stężeń w 100 mM roztworze Tris do końcowej objętości 300 μL. Należy również przygotować próbkę kontrolną bez fosforanu acetylowego.</li>
	<li>Każdy wzorzec oraz kontrolę należy inkubować w 37 °C w bloku grzejnym przez 1 minutę.</li>
	<li>Do każdego wzorca oraz kontroli należy dodać 50 μL roztworu chlorowodorku hydroksyloaminy i wymieszać, potrząsając trzy razy. Wzorzec należy umieścić w bloku grzejnym w 60 °C i inkubować przez pięć minut.</li>
	<li>Do wzorców oraz kontroli należy dodać 100 μL roztworu wywołującego, wymieszać, potrząsając trzy razy, i pozostawić do wywołania barwy przez co najmniej jedną minutę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wszystkie wzorce oraz kontrolę należy odwirować w mikrowirówce przy 18,000 x g przez 1 minutę.</li>
	<li>Próbki należy zmierzyć spektrofotometrycznie przy 540 nm przy użyciu plastikowych kuwet 1mL, wykorzystując kontrolę jako próbkę zerową (blank) do spektrofotometrii.</li>
	<li>Krzywą wzorcową generuje się przy użyciu odpowiedniego oprogramowania do analizy danych i tworzenia wykresów (np. Kaleidagraph, Synergy Software). Pożądane są wartości R2 równe 0,99 lub wyższe. Dane nanosi się jako absorbancję przy 540 nm w funkcji μmoles obecnego fosforanu acetylowego.</li>
</ol>
3. Analiza aktywności kinazy octanowej
<ol>
	<li>Używając opisanych roztworów, przygotować mieszaninę reakcyjną o końcowym stężeniu 0,1 mol/L buforu Tris, 10 mmol/L chlorku magnezu, 5 mmol/L ADP oraz 2 mmol/L acetylofosforanu. Przygotowanie 10 mL mieszaniny reakcyjnej wymaga 8,2 mL ddH2O, 1,0 mL roztworu Tris, 0,1 mL roztworu chlorku magnezu, 0,5 mL roztworu ADP i 0,2 mL roztworu acetylofosforanu. Mieszaninę reakcyjną rozdzielić do probówek do mikrocentryfugi w aliquotach po 300 μl. W celu wyznaczenia parametrów kinetycznych i optymalizacji stężeń substratów, w reakcjach można zmieniać stężenie jednego substratu, utrzymując drugie na stałym poziomie.</li>
	<li>Preinkubować reakcje przez 1 minutę w temperaturze 37 °C w bloku grzewczym.</li>
	<li>Do reakcji dodać odpowiednią ilość enzymu i natychmiast umieścić probówkę z powrotem w bloku grzewczym o temperaturze 37 °C. Należy również przygotować reakcję kontrolną, do której nie dodaje się enzymu. W przypadku przeprowadzania kilku reakcji, enzym należy dodawać do probówek w określonych odstępach czasu, dbając o precyzyjne monitorowanie czasu. (UWAGA: Ilość użytego enzymu musi zostać zoptymalizowana, aby zapobiec całkowitemu wyczerpaniu substratu w postaci acetylofosforanu lub ADP – patrz sekcja Dyskusja)</li>
	<li>Po 5 minutach dodać 50 μl roztworu hydroponianu hydrochlorku do każdej reakcji oraz do kontroli, wymieszać i umieścić probówki w bloku grzewczym o temperaturze 60 °C. Jeśli przeprowadzanych jest kilka reakcji, czynność tę należy wykonać w takich samych odstępach czasu, w jakich dodawano enzym.</li>
	<li>Inkubować reakcje oraz kontrolę przez 5 minut w temperaturze 60 °C.</li>
	<li>Do każdej reakcji oraz do kontroli dodać 100 μL roztworu wywoływującego, wymieszać i umieścić w statywie na blacie laboratoryjnym. Pozostawić do rozwoju barwy na co najmniej 1 minutę.</li>
	<li>Wszystkie probówki odwirować w mikrocentryfudze przy 18 000 x g przez 1 minutę.</li>
	<li>Próbki zmierzyć spektrofotometrycznie przy 540 nm, używając plastikowych kuwet 1 mL, i określić ilość obecnego acetylofosforanu poprzez porównanie z krzywą wzorcową acetylofosforanu.</li>
	<li>Ilość zużytego substratu acetylofosforanu można wyznaczyć, odejmując ilość acetylofosforanu pozostałego po reakcji enzymatycznej od ilości acetylofosforanu obecnego w kontroli bez enzymu. Analizę danych przeprowadzić przy użyciu odpowiedniego oprogramowania do analizy danych i tworzenia wykresów (np. Kaleidagraph, Synergy Software). Pożądane są wartości R2 powyżej 0,97.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
Celem niniejszego testu jest pomiar aktywności kinazy octanowej w kierunku tworzenia octanu. Jest to realizowane poprzez pomiar zużycia substratu w postaci acetylofosforanu, ponieważ nie istnieje łatwa, bezpośrednia metoda pomiaru produkcji octanu. Acetylofosforan pozostały po określonym czasie reakcji enzymatycznej jest przekształcany w acetylhydroksamat, a następnie w kompleks hydroksamatu żelaza(III), który ma czerwonawy kolor (Rysunek 2) mierzalny przy 540 nm. Do określenia ilości acetylofosforanu pozostałego w każdej reakcji służy krzywa wzorcowa przedstawiająca zależność absorbancji od μmoli acetylofosforanu obecnych we wzorcach. Krzywa wzorcowa powinna być liniowa i przechodzić przez punkt zero. Reprezentatywna krzywa wzorcowa przedstawiona na Rysunku 3 ma nachylenie wynoszące 1,2332 jednostek absorbancji na μmol obecnego acetylofosforanu oraz wartość R2 równą 0,99, co wskazuje na dobre dopasowanie danych do równania liniowego. Równanie dopasowania liniowego do danych krzywej wzorcowej jest wykorzystywane do obliczenia ilości acetylofosforanu pozostałego w reakcji. Liczbę μmoli zużytego acetylofosforanu wyznacza się jako różnicę między liczbą μmoli acetylofosforanu obecnych w reakcji kontrolnej bez enzymu a liczbą μmoli acetylofosforanu pozostałych po reakcji enzymatycznej.
Oczyszczoną, rekombinowaną kinazę octanową z M. thermophila analizowano zgodnie z opisanym protokołem. Dla eksperymentu przedstawionego na Rysunku 4 stężenie ADP utrzymano na stałym poziomie 5 mmol/L, a stężenie fosforanu acetylowego w reakcji zmieniano w celu wyznaczenia Km dla fosforanu acetylowego. Jak oczekiwano, eksperyment ten wykazał, że enzym wykazuje standardową kinetykę typu Michaelisa-Menten dla każdego substratu, a wykres zależności aktywności od stężenia fosforanu acetylowego przyjął postać krzywej nasycenia o kształcie hiperbolicznym. Pozorna wartość Km dla fosforanu acetylowego wyniosła 0,27 ± 0,01 mmol/L, co jest wynikiem porównywalnym z opublikowaną wartością Km wynoszącą 0,47 ± 0,01 mmol/L przy zastosowaniu testu sprzężonego13.
Metodę bezpośrednią można również wykorzystać do pomiaru aktywności kinaz octanowych wykorzystujących substraty inne niż ATP, co nie jest możliwe w przypadku standardowego testu sprzężonego. Oczyszczona rekombinowana kinaza octanowa E. histolytica16, która w kierunku tworzenia octanu produkuje PPi zamiast ATP, została poddana tej analizie z zastosowaniem fosforanu sodu zamiast ADP. Stężenie fosforanu sodu w reakcji utrzymano na stałym poziomie 0,2 mol/L i zmieniano stężenie acetylofosforanu. Podobnie jak w przypadku kinazy octanowej M. thermophila, kinaza octanowa E. histolytica wykazywała kinetykę typu Michaelisa-Menten w odniesieniu do acetylofosforanu i zaobserwowano hiperboliczną krzywą nasycenia (Rysunek 5). Pozorna wartość Km dla acetylofosforanu wynosiła 0,50 ± 0,006 mmol/L. Reeves i Guthrie15 wyznaczyli wartość Km dla acetylofosforanu wynoszącą 0,06 mmol/L dla natywnego enzymu; jednak ich enzym był jedynie częściowo oczyszczony, a w ich analizie wykorzystano cztery enzymy sprzęgające, które również były tylko częściowo oczyszczone. W związku z tym bezpośrednie porównanie tych wartości jest utrudnione.
Schemat protokołu
<ol>
	<li>Sporządzenie krzywej wzorcowej dla fosforanu acetylowego</li>
	<li>Rozcieńczenie enzymu do pożądanego stężenia</li>
	<li>Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej i odpipowanie 300 μl do probówek do mikrocentryfugi</li>
	<li>Preinkubacja reakcji w temperaturze 37 °C przez 1 minutę</li>
	<li>Rozpoczęcie reakcji poprzez dodanie enzymu w określonych odstępach czasu</li>
	<li>Dodanie hydroksylaminy w tych samych odstępach czasu w celu zatrzymania reakcji i inkubacja w temperaturze 60 °C przez 5 minut</li>
	<li>Dodanie roztworu chlorku żelaza/kwasu trichlorooctowego w celu wywołania zabarwienia</li>
	<li>Wirowanie probówek z prędkością 18,000 x g przez 1 minutę</li>
	<li>Pomiar absorbancji przy 540 nm</li>
	<li>Wyznaczenie ilości zużytego fosforanu acetylowego poprzez porównanie z krzywą wzorcową</li>
</ol>
<img alt="Protokół testu na fosforan acetylowy, kroki obejmują rozcieńczanie enzymu, reakcję, pomiar absorbancji przy 540 nm." src="/files/ftp_upload/3474/3474fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat protokołu
<img alt="Analiza kolorymetryczna; kuwety; eksperyment; układ spektroskopowy; pomiar stężenia." src="/files/ftp_upload/3474/3474fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Standardy fosforanu acetylowego. Rosnące stężenia fosforanu acetylowego poddano reakcji z hydroksyloaminą, a następnie wywołano barwę zgodnie z opisem. Próba kontrolna bez fosforanu acetylowego ma jasny żółty kolor, a reakcje zawierające coraz większe ilości fosforanu acetylowego wykazują sukcesywnie ciemniejszy odcień. Zmianę barwy tę mierzy się przy 540 nm.
<img alt="Absorbancja w funkcji fosforanu acetylowego; wykres dopasowania liniowego; analiza spektrofotometryczna; dane badawcze." src="/files/ftp_upload/3474/3474fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Przykładowa krzywa wzorcowa dla fosforanu acetylowego. Różne ilości fosforanu acetylowego poddano reakcji z hydroksyloaminą oraz roztworem barwnym, a następnie zmierzono absorbancję przy 540 nm. Przedstawiono zależność absorbancji przy 540 nm od μmoli fosforanu acetylowego i zastosowano liniowe dopasowanie do danych.
<img alt="Wykres zużycia acetylofosforanu; kinetyka enzymatyczna; stężenie vs. ilość zużyta; analiza punktów danych." src="/files/ftp_upload/3474/3474fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Wykorzystanie acetylofosforanu przez produkującą ATP acetatokinazę M. thermophila. Aktywność enzymatyczna została określona w kierunku tworzenia octanu w obecności 5 mmol/L ADP przy zmiennych stężeniach acetylofosforanu. Ilość zużytego acetylofosforanu określono jako różnicę między początkową ilością acetylofosforanu w reakcji a ilością acetylofosforanu pozostałą po reakcji enzymatycznej. Analizy przeprowadzono w trzech powtórzeniach; na wykresie naniesiono słupki błędów.
<img alt="Wykres zużycia acetylofosforanu w funkcji stężenia, przedstawiający kinetykę reakcji w badaniu biochemicznym." src="/files/ftp_upload/3474/3474fig5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Wykorzystanie acetylofosforanu przez kinazę octanową E. histolytica wytwarzającą PPi. Aktywność enzymatyczną w kierunku tworzenia octanu określono w obecności 0,2 mol/L fosforanu sodu przy zmiennych stężeniach acetylofosforanu. Ilość zużytego acetylofosforanu wyznaczono jako różnicę między ilością początkową acetylofosforanu w reakcji a ilością acetylofosforanu pozostałą po reakcji enzymatycznej. Analizy przeprowadzono w trzech powtórzeniach; na wykresie naniesiono słupki błędów.

<ol><li>Bork, P., Sander, C., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ATPase+domain+common+to+prokaryotic+cell+cycle+proteins%2C+sugar+kinases%2C+actin%2C+and+hsp70+heat+shock+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">An ATPase domain common to prokaryotic cell cycle proteins, sugar kinases, actin, and hsp70 heat shock proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 7290-7294 (1992).</li>
<li>Bork, P., Sander, C., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+evolution+of+similar+enzymatic+function+on+different+protein+folds%3A+the+hexokinase%2C+ribokinase%2C+and+galactokinase+families+of+sugar+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Convergent evolution of similar enzymatic function on different protein folds: the hexokinase, ribokinase, and galactokinase families of sugar kinases.</a> Protein Sci. 2, 31-40 (1993).</li>
<li>Buss, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urkinase%3A+structure+of+acetate+kinase%2C+a+member+of+the+ASKHA+superfamily+of+phosphotransferases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Urkinase: structure of acetate kinase, a member of the ASKHA superfamily of phosphotransferases.</a> J. Bacteriol. 183, 680-686 (2001).</li>
<li>Hurley, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sugar+kinase%2Fheat+shock+protein+70%2Factin+superfamily%3A+implications+of+conserved+structure+for+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">The sugar kinase/heat shock protein 70/actin superfamily: implications of conserved structure for mechanism.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 25, 137-162 (1996).</li>
<li>Holmes, K. C., Sander, C., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+ATP-binding+fold+in+actin%2C+hexokinase+and+Hsc70%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">A new ATP-binding fold in actin, hexokinase and Hsc70.</a> Trends. Cell. Biol. 3, 53-59 (1993).</li>
<li>Ingram-Smith, C., Martin, S. R., Smith, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetate+kinase%3A+not+just+a+bacterial+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Acetate kinase: not just a bacterial enzyme.</a> Trends. Microbiol. 14, 249-253 (2006).</li>
<li>Aceti, D. J., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+acetate+kinase+from+acetate-grown+Methanosarcina+thermophila.+Evidence+for+regulation+of+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of acetate kinase from acetate-grown Methanosarcina thermophila. Evidence for regulation of synthesis.</a> J. Biol. Chem. 263, 15444-15448 (1988).</li>
<li>Latimer, M. T., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning%2C+sequence+analysis%2C+and+hyperexpression+of+the+genes+encoding+phosphotransacetylase+and+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Cloning, sequence analysis, and hyperexpression of the genes encoding phosphotransacetylase and acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Bacteriol. 175, 6822-6829 (1993).</li>
<li>Ingram-Smith, C., Barber, R. D., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+histidines+in+the+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The role of histidines in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 275, 33765-33770 (2000).</li>
<li>Miles, R. D., Iyer, P. P., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutational+analysis+of+active+site+residues+in+the+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutational analysis of active site residues in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 276, 45059-45064 (2001).</li>
<li>Miles, R. D., Gorrell, A., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+transition+state+analog%2C+MgADP-aluminum+fluoride-acetate%2C+in+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evidence for a transition state analog, MgADP-aluminum fluoride-acetate, in acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 277, 22547-22552 (2002).</li>
<li>Ingram-Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+acetate+binding+pocket+in+the+Methanosarcina+thermophila+acetate+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the acetate binding pocket in the Methanosarcina thermophila acetate kinase.</a> J. Bacteriol. 187, 2386-2394 (2005).</li>
<li>Gorrell, A., Lawrence, S. H., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+kinetic+analyses+of+arginine+residues+in+the+active+site+of+the+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural and kinetic analyses of arginine residues in the active site of the acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 280, 10731-10742 (2005).</li>
<li>Gorrell, A., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+Methanosarcina+thermophila+acetate+kinase+mechanism+by+fluorescence+quenching%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Investigation of the Methanosarcina thermophila acetate kinase mechanism by fluorescence quenching.</a> Biochemistry. 46, 14170-14176 (2007).</li>
<li>Reeves, R. E., Guthrie, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetate+kinase+%28pyrophosphate%29.+A+fourth+pyrophosphate-dependent+kinase+from+Entamoeba+histolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Acetate kinase (pyrophosphate). A fourth pyrophosphate-dependent kinase from Entamoeba histolytica.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 66, 1389-1395 (1975).</li>
<li>Fowler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+and+structural+characterization+of+the+novel+PPi-dependent+acetate+kinase+from+the+parasite+Entamoeba+histolytica%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Kinetic and structural characterization of the novel PPi-dependent acetate kinase from the parasite Entamoeba histolytica.</a> , Forthcoming (2011).</li>
<li>Lipmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+synthesis+of+acetyl+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Enzymatic synthesis of acetyl phosphate.</a> J. Biol. Chem. 155, 55-70 (1944).</li>
<li>Lipmann, F., Tuttle, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specific+micromethod+for+determination+of+acyl+phosphates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A specific micromethod for determination of acyl phosphates.</a> J. Biol. Chem. 159, 21-28 (1945).</li>
<li>Lipmann, F., Jones, M. E., Black, S., Flynn, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+the+ATP-CoA-acetate+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol.+Suppl%22%5BJournal%5D)">The mechanism of the ATP-CoA-acetate reaction.</a> J. Cell. Physiol. Suppl. 41, 109-112 (1953).</li>
<li>Rose, I. A., Grunberg-Manago, M., Korey, S. F., Ochoa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+phosphorylation+of+acetate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Enzymatic phosphorylation of acetate.</a> J. Biol. Chem. 211, 737-756 (1954).</li>
<li>Allen, S. H., Kellermeyer, R. W., Stjernholm, R. L., Wood, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+properties+of+enzymes+involved+in+the+proponic+acid+fermentation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Purification and properties of enzymes involved in the proponic acid fermentation.</a> Journal of Bacteriology. 87, 171-187 (1964).</li>
<li>Clarke, P. M., Payton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzymatic+assay+for+acetate+in+spent+bacterial+culture+supernatants%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">An enzymatic assay for acetate in spent bacterial culture supernatants.</a> Anal. Biochem. 130, 402-405 (1983).</li>
<li>Mukhopadhyay, S., Hasson, M. S., Sanders, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+assay+of+acetate+kinase+activity%3A+measurement+of+inorganic+phosphate+release+generated+by+hydroxylaminolysis+of+acetyl+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Chem%22%5BJournal%5D)">A continuous assay of acetate kinase activity: measurement of inorganic phosphate release generated by hydroxylaminolysis of acetyl phosphate.</a> Bioorg. Chem. 36, 65-69 (2008).</li>
<li>Nakajima, H., Suzuki, K., Imahori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+properties+of+acetate+kinase+from+Bacillus+stearothermophilus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification and properties of acetate kinase from Bacillus stearothermophilus.</a> J. Biochem. 84, 193-203 (1978).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Wykrywanie acetylofosforanu w tym teście zależy od odpowiedniego stężenia chlorowodorku hydroksyloaminy oraz stężenia i kwasowości roztworu chlorku żelaza(III). Zmiana objętości testu będzie wymagała ponownego rozważenia obu tych komponentów. Opisane tutaj reakcje enzymatyczne przeprowadzono w 37°C, natomiast zakończenie reakcji za pomocą hydroksyloaminy wykonano w 60 °C przez 5 minut. Wyższa temperatura jest kluczowa dla zapewnienia szybkiej konwersji pozostałego acetylofosforanu do acetylohydroksamianu. Czas etapu rozw...

<table><tbody><tr><td>Fosforan acetylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>01409</td><td>Sól litu (97%)</td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednodstawny (bezwodny)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>S381</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy (bezwodny)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>S374</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (sześciowodny)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>M33</td><td></td></tr><tr><td>Tris (zasada)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>B152</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek żelaza(III) (sześciowodny)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>I88</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trójchlorooctowy</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>A324</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek hydroksyloaminy</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>H330</td><td></td></tr><tr><td>&lt;p align=&quot;centro">Adenozyna 5&amp;rsquo;-difosforan &lt;/p&gt; sól sodowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr Biomate III</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>142982082</td><td>Standardowy spektrofotometr UV/Vis</td></tr></tbody></table>

bezpośrednie wykrywanie aktywności octanowej enzymu kinazy octanowej

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Kinaza octanowa, należąca do superrodziny enzymów kinaz octanowych i cukrowych-Hsp70-aktyny (ASKHA)1-5, odpowiada za odwracalną fosforylację octanu do fosforanu acetyloenolu z wykorzystaniem ATP jako substratu. Kinazy octanowe występują powszechnie u Bacteria, znaleziono je u jednego rodzaju Archaea, a także występują one u mikroorganizmów z grupy Eukarya6. Najlepiej scharakteryzowaną kinazą octanową jest enzym pochodzący z produkującego metan archeona Methanosarcina thermophila7-14. Kinaza octanowa, która w kierunku tworzenia fosforanu acetyloenolu potrafi wykorzystać wyłącznie PPi, a nie ATP, została wyizolowana z Entamoeba histolytica, czynnika etiologicznego amebowej czerwonki, i do tej pory stwierdzono jej obecność jedynie w tym rodzaju15,16.
W kierunku tworzenia fosforanu acetylowego aktywność kinazy acetylowej mierzy się zazwyczaj za pomocą testu hydroksamanowego, po raz pierwszy opisanego przez Lipmanna17-20, który jest testem sprzężonym, w którym konwersja ATP do ADP jest sprzężona z utlenianiem NADH do NAD+ przez enzymy kinazę pirogronianową i dehydrogenazę mleczanową21,22, lub za pomocą testu mierzącego uwalnianie fosforanu nieorganicznego po reakcji produktu w postaci fosforanu acetylowego z hydroksyloaminą23. Aktywność w przeciwnym kierunku, tworzenia octanu, mierzy się poprzez sprzężenie syntezy ATP z ADP z redukcją NADP+ do NADPH przez enzymy heksokinazę i dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową24.
W niniejszej pracy opisujemy metodę wykrywania aktywności kinazy octanowej w kierunku tworzenia octanu, która nie wymaga enzymów sprzęgających, lecz opiera się na bezpośrednim oznaczaniu zużycia acetylofosforanu. Po reakcji enzymatycznej pozostały acetylofosforan jest przekształcany w kompleks hydroksamatu żelaza(III), który można zmierzyć spektrofotometrycznie, analogicznie do testu hydroksamanowego. W przeciwieństwie do standardowego testu sprzężonego dla tego kierunku reakcji, który zależy od produkcji ATP z ADP, niniejszy test bezpośredni może być stosowany w przypadku kinaz octanowych produkujących ATP lub PPi.

Opisano metodę oznaczania aktywności kinazy octanowej. Analiza ta wykorzystuje reakcję bezpośrednią do wyznaczania aktywności enzymatycznej i kinetyki kinazy octanowej w kierunku tworzenia octanu z zastosowaniem różnych akceptorów fosforanowych. Ponadto metodę tę można wykorzystać do analizy innych enzymów wykorzystujących acetylofosforan lub acetylo-CoA.

Bezpośrednie wykrywanie aktywności octanowej enzymu kinazy octanowej

Kinaza octanowa, należąca do superfamilii enzymów kinaz octanowych i cukrowych-Hsp70-aktyny (ASKHA)1-5, odpowiada za odwracalną fosforylację...

Celem tego eksperymentu jest bezpośredni pomiar aktywności octanowej kinazy w kierunku syntezy octanu. Reakcję inicjuje się poprzez dodanie enzymu do mieszaniny reakcyjnej zawierającej fosforan acetylowy i substraty DP. Następnie dodaje się chlorek hydroksyloaminy, aby przekształcić pozostały fosforan acetylowy w hydroksylan acetylowy.Dodaj roztwór wywoływujący, aby przekształcić acetylohydroksylan w barwny kompleks hydroksylanu żelaza(III), który można zmierzyć spektrofotometrycznie. Wyniki oparte na ilości substratu acetylofosforanu zużytego w reakcji umożliwiają oznaczenie parametrów kinetycznych enzymu. Przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami jest to, że opiera się ona na bezpośrednim pomiarze zużycia acetylofosforanu, a nie na sprzężeniu produkcji ATP z redukcją ADP. Ponieważ ten test nie opiera się na produkcji ATP, może być stosowany dla nowej grupy kinaz octanowych, które produkują fosforan nieorganiczny zamiast ATP. W celu przygotowania krzywej wzorcowej składającej się z sześciu do ośmiu punktów, rozcieńcz roztwór zapasowy acetylofosforanu w 100 mM TRIS do końcowej objętości próbki 300 µL; należy również przygotować próbkę kontrolną bez acetylofosforanu. Wszystkie próbki inkubuj w bloku grzewczym w temperaturze 37 °C przez jedną minutę.Następnie dodaj 50 µL 2 M chlorku hydroksyloaminy, wymieszaj wstrząsając trzy razy i inkubuj w bloku grzewczym o temperaturze 60 °C przez pięć minut. Następnie dodaj 100 µL roztworu wywoływującego, wymieszaj wstrząsając trzy razy i pozostaw do wywołania koloru przez co najmniej jedną minutę w temperaturze pokojowej. Odwiruj próbki, używając plastikowych kuwet do spektrofotometru.Zmierzyć próbki przy długości fali 540 nanometrów. Następnie wyznaczyć krzywą wzorcową absorbancji przy 540 nanometrach w funkcji mikromoli acetylofosforanu, wykorzystując odpowiednie oprogramowanie do analizy danych i tworzenia wykresów. Obliczyć wartość współczynnika determinacji r².Rozdziel aliquoty 300 µL mieszaniny reakcyjnej do probówek do mikrocentryfugi. Należy pamiętać o przygotowaniu reakcji kontrolnej bez enzymu; inkubować probówki przez jedną minutę w temperaturze 37 °C. W przypadku przeprowadzenia kilku reakcji, dodawać enzym do probówek w określonych odstępach czasu i natychmiast przekładać każdą probówkę z powrotem do bloku grzewczego o temperaturze 37 °C.Po pięciu minutach dodać 50 µL 2 M chlorku hydroksyloaminy, wymieszać i inkubować przez pięć minut w temperaturze 60 °C. Następnie dodać 100 µL roztworu wywoływującego, wymieszać i pozostawić w temperaturze pokojowej w celu wywołania koloru. Następnie odwirować próbki z prędkością 18 000 ×g przez jedną minutę.Następnie należy zmierzyć absorbancję przy 540 nanometrach. Ilość obecnego acetylofosforanu wyznacza się poprzez porównanie z krzywą wzorcową acetylofosforanu. Dane można nanieść na wykres i dopasować do równania McKayla Cementin w celu wyznaczenia parametrów kinetycznych.Niniejszy test określa zużycie substratu w postaci acetylfosforanu w celu pomiaru aktywności kinazy octanowej w kierunku powstawania octanu. Acetylfosforan pozostały po określonym czasie reakcji enzymatycznej jest przekształcany w acetyloksybutan, a następnie w kompleks wodorotlenku żelaza(III) z octanem, który ma czerwonawy kolor mierzalny przy 540 nanometrach. Typowa krzywa wzorcowa przedstawiająca zależność absorbancji przy 540 nanometrach od mikromoli acetylfosforanu ma nachylenie wynoszące 1,2332 jednostki absorbancji na mikromol acetylfosforanu.Otrzymana wartość r kwadrat wynosząca 0,99 wskazuje, że dane dobrze pasują do równania liniowego przedstawionego tutaj. Analizę tę można wykorzystać do wyznaczenia KM dla acetylofosforanu dla różnych preparatów enzymatycznych. Przy stężeniu pięciu milimoli DP z różnymi stężeniami acetylofosforanu oczyszczona rekombinowana kinaza octanowa z methanol Sarina thermophilic wykazuje standardową kinetykę typu McKayla cementin dla każdego substratu, co skutkuje pozornym KM wynoszącym 0,27 plus lub minus 0,01 milimola acetylofosforanu.W przeciwieństwie do standardowego testu sprzężonego, ten test bezpośredni pozwala na pomiar aktywności kinaz octanowych wykorzystujących substraty inne niż TP. Na przykład, w przypadku wykorzystania acetylofosforanu przez produkującą pirofosforan kinazę octanową z Entamoeba histolytica, w mieszaninie reakcyjnej w miejsce DP zastosowano fosforan sodu. Otrzymana krzywa wskazuje pozorną wartość KM wynoszącą 0,50 plus lub minus 0,006 millimolar acetylofosforanu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobre wyobrażenie o tym, jak bezpośrednio mierzyć aktywność kinazy octanowej poprzez oznaczenie ilości zużytego acetylofosforanu.Kluczowym czynnikiem w uzyskaniu powtarzalnych wyników jest zachowanie spójności na każdym etapie, zwłaszcza podczas dodawania enzymu oraz w kroku mieszania.

direct-detection-acetate-forming-activity-enzyme-acetate

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wykrywanie bezpośrednie aktywności tworzenia octanu enzymu octan kinazy

Ten protokół opisuje wymagane kroki do przeprowadzenia testów deacetylacji in vitro i in vivo w celu ustalenia roli białek jako specyficznych substratów deacetylacji dla sirtuin i dalszego badania roli odwracalnej acetylacji lizyny jako modyfikacji potranslacyjnej.

Testy deacetylacji w celu rozwikłania wzajemnych zależności między sirtuinami (SIRT2) a specyficznymi substratami białkowymi

Ta praca przedstawia metodę wysokoprzepustowych badań przesiewowych przy użyciu uniwersalnego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych, który teoretycznie można zastosować do ponad 200 enzymów. W tym przypadku pojedynczy system przesiewowy identyfikuje trzy różne enzymy (lipazę, celulazę i fosfatazę alkaliczną), po prostu zmieniając zastosowany substrat (octan p-nitrofenylu, p-nitrofenylo-β-D-celobiozyd i fosforan fenylu).

Badania przesiewowe wielu enzymów przy użyciu wysokoprzepustowego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych

Opisujemy podstawowy protokół ilościowego oznaczania aktywności ATPazy in vitro. Protokół ten można zoptymalizować w oparciu o poziom aktywności i wymagania dla danej oczyszczonej ATPazy.

Pomiar aktywności ATPazy in vitro w celu charakterystyki enzymatycznej

Tutaj opisujemy przygotowanie i użycie sondy opartej na aktywności (ARN14686, undec-10-ynyl-N-[(3S)-2-oksoazetydyno-3-ylo]karbaminianu), która pozwala na wykrycie i ilościowe określenie aktywnej formy prozapalnego enzymu amidazy kwasu N-acyloetanoloaminowego (NAAA), zarówno in vitro, jak i ex vivo.

Przygotowanie i zastosowanie in vivo sondy aktywności dla amidazy kwasu N-acyloetanoloaminowego

Kinazy białkowe to wysoce rozwinięte enzymy sygnalizacyjne i rusztowania, które są kluczowe dla między- i wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnału. Przedstawiamy protokół pomiaru aktywności kinazy za pomocą znakowanego radioaktywnie trifosforanu adenozyny ([γ-32P] ATP), niezawodnej metody pomagającej w wyjaśnieniu regulacji sygnalizacji komórkowej.

Oznaczanie aktywności kinazy białkowej za pomocą znakowanego radioaktywnie ATP

Rozszerzenie kodu genetycznego służy jako potężne narzędzie do badania szerokiego zakresu procesów biologicznych, w tym acetylacji białek. Tutaj demonstrujemy prosty protokół wykorzystania tej techniki do generowania jednorodnie acetylowanych białek w określonych miejscach w komórkach Escherichia coli.

Łatwy protokół do generowania specyficznie specyficznych dla miejsca acetylowanych białek w Escherichia coli

Celem tego protokołu jest etykietowanie, wzbogacanie i identyfikowanie substratów kinazy białkowej CK2 ze złożonej próbki biologicznej, takiej jak lizat komórkowy lub homogenat tkankowy. W tym celu metoda ta wykorzystuje unikalne aspekty biologii CK2.

Identyfikacja nowych substratów kinazy CK2 przy użyciu wszechstronnego podejścia biochemicznego

Scharakteryzowaliśmy nowe białko kinazy za pomocą solidnych podejść biochemicznych: analiza Western Blot z dedykowanym specyficznym przeciwciałem na różnych liniach komórkowych i tkankach, interakcje za pomocą eksperymentów z koimmunoprecypitacją, aktywność kinazy wykryta przez Western Blot przy użyciu przeciwciała specyficznego dla fosfy oraz znakowanie γ[32P] ATP.

Charakterystyka na poziomie molekularnym przy użyciu solidnych podejść biochemicznych nowego białka kinazy

Prezentowany tutaj jest czuły test fluorescencyjny do monitorowania aktywności N-acylotransferazy apolipoproteiny przy użyciu peptydu diacyloglicerylu i alkinofosfolipidów jako substratów z chemią kliknięć.

Test fluorometryczny oparty na technologii click-chemistry dla N-acylotransferazy apolipoproteiny od charakterystyki enzymu do wysokoprzepustowych badań przesiewowych

W tym artykule przedstawiono znormalizowane metody ekotoksykologiczne do oceny biomarkerów u neotropikalnych gatunków bezogonowych. W szczególności w artykule tym szczegółowo opisano kilka metodologii w różnych skalach oceny ekotoksykologicznej, takich jak poziom genetyczny, komórkowo-histologiczny, biochemiczny, morfologiczny i indywidualny.

Metodologie ekotoksykologiczne do oceny biomarkerów w różnych skalach u anuranów neotropikalnych

Szybkie i dokładne testy chemiczne do badań przesiewowych pod kątem określonych inhibitorów są ważnym narzędziem w arsenale rozwoju leków. Tutaj przedstawiamy skalowalny test chemiczny acetylu do pomiaru hamowania aktywności acetylacji HAT1.

Test chemiczny Acetyl-Click do pomiaru acetylacji acetylotransferazy histonowej 1

Poznaj metodę bezpośredniego pomiaru aktywności kinazy octanowej poprzez oznaczanie zużycia acetylofosforanu. Technika ta umożliwia wyznaczenie parametrów kinetycznych enzymu i może być zastosowana do innych enzymów wykorzystujących acetylofosforan.

Bezpośrednie wykrywanie aktywności octanowej enzymu kinazy octanowej

Przeglądaj więcej filmów