Bezpośrednie wykrywanie aktywności enzymatycznej kinazy octanowej tworzącej octan

Eksperyment ten ma na celu bezpośredni pomiar aktywności kinazy octanowej w procesie tworzenia octanu. Rozpocząć reakcję przez dodanie enzymu do mieszaniny reakcyjnej zawierającej fosforan acetylu i substraty DP. Następnie dodaj chlorowodorek hydroksylaminy, aby przekształcić pozostały fosforan acetylu w hydroksylan acetylu.

Dodaj roztwór rozwojowy, aby przekształcić hydroksylan acetylu w kolorowy kompleks hydroksylanu żelaza, który można zmierzyć. Spektrometria fotometryczna na podstawie ilości zużytego substratu acetylofosforanu w wynikach reakcji pozwala na określenie parametrów kinetycznych enzymu. Przewaga tej techniki nad istniejącymi metodami polega na tym, że opiera się ona na bezpośrednim pomiarze zużycia fosforanu acetylu, a nie na rozłączeniu produkcji TP z redukcją A DP. Ponieważ test ten nie opiera się na produkcji TP, można go zastosować do nowej grupy kinaz octanowych, które wytwarzają fosforan energetyczny zamiast TP W przypadku krzywej standardowej od sześciu do ośmiu punktów rozcieńczyć roztwór podstawowy fosforanu acetylu w trisie 100 milimolowej do końcowej objętości próbki 300 mikrolitrów, należy również uwzględnić próbkę kontrolną bez fosforanu acetylu, zrównoważyć wszystkie próbki w bloku cieplnym o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez Minuta.

Teraz dodaj 50 mikrolitrów dwóch molowych chlorowodorków hydroksylaminy, wymieszaj trzykrotnie wstrząsając i inkubuj w bloku grzewczym o temperaturze 60 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie dodaj 100 mikrolitrów roztworu rozwojowego, mieszając trzykrotnie i pozwól kolorowi rozwinąć się przez co najmniej minutę w temperaturze pokojowej. Odwirować próbki za pomocą plastikowych kuwet do spektrofotometru.

Zmierz próbki w odległości 540 nanometrów. Przystąp do generowania standardowej krzywej chłonności przy 540 nanometrach w porównaniu z mikromolami fosforanu acetylu za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy danych i tworzenia wykresów. Oblicz wartość r kwadrat.

Rozprowadzić 300 mikrolitrów podwielokrotności mieszaniny reakcyjnej do probówek mikrowirówek. Pamiętaj, aby włączyć reakcję kontrolną bez probówek z równowagą enzymów przez jedną minutę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Jeśli przeprowadza się kilka reakcji, dodaj enzym do probówek w określonych odstępach czasu i natychmiast zwróć każdą probówkę do bloku grzewczego o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po pięciu minutach dodać 50 mikrolitrów dwóch molowych chlorowodorków hydroksyloaminy, wymieszać i inkubować przez pięć minut w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Następnie dodaj 100 mikrolitrów roztworu wywoływającego, wymieszaj i umieść w temperaturze pokojowej w celu uzyskania koloru. Następnie odwirować próbki w temperaturze 18 000 razy G przez jedną minutę.

Przystąp do pomiaru absorbancji przy 540 nanometrach. Określić ilość obecnego fosforanu acetylu przez porównanie z krzywą wzorcową fosforanu acetylu. Dane można wykreślić i dopasować do równania McKayla Cementin w celu określenia parametrów kinetycznych.

Test ten określa zużycie substratu fosforanu acetylu w celu pomiaru aktywności kinazy octanowej w kierunku tworzenia octanu. Fosforan acetylu pozostały po określonym czasie podczas reakcji enzymatycznej przekształca się w acetyloksymaślan, a następnie w kompleks hydroksyhydroksyanu żelaza, który ma czerwonawy kolor, który można zmierzyć na głębokości 540 nanometrów. Ta typowa krzywa standardowa wykreślająca chłonność przy 540 nanometrach w porównaniu z mikromolowym fosforanem acetylu ma nachylenie 1,2332 jednostki chłonności na mikromolowy fosforan acetylu.

Wynikowa wartość r kwadrat równa 0,99 wskazuje, że dane dobrze pasują do równania liniowego, jak pokazano tutaj. Test ten można wykorzystać do określenia KM dla fosforanu acetylu dla różnych preparatów enzymatycznych. Przy pięciu milimolach DP o różnych stężeniach oczyszczonej rekombinowanej kinazy octanowej fosforanu acetylu z metanolu, termofilna Sarina podąża za standardową kinetyką podobną do cementiny McKayla dla każdego podłoża, co daje pozorny KM 0,27 plus minus 0,01 milimolowego fosforanu acetylu.

W przeciwieństwie do standardowego testu sprzężonego, ten bezpośredni test może mierzyć aktywność kinaz octanowych wykorzystujących substraty inne niż TP. Na przykład, w przypadku wykorzystania fosforanu acetylu przez pirofosforan wytwarzający kinazę octanową inba histolytica, fosforan sodu został zastąpiony DP w mieszaninie reakcyjnej. Wynikowa krzywa wskazuje pozorną wartość KM wynoszącą 0,50 plus minus 0,006 milimolowego fosforanu acetylu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobry pomysł na to, jak bezpośrednio mierzyć aktywność kinazy octanowej poprzez określenie ilości spożywanego fosforanu acetylu.

Kluczowym czynnikiem w uzyskiwaniu powtarzalnych wyników jest konsekwentne działanie na każdym etapie, zwłaszcza na etapie dodawania enzymu i mieszania.