Name: Ściąganie białek wiążących kalmodulinę (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Poznaj metodę ściągania białek wiążących kalmodulinę w zależności od wapnia. Technika wykorzystuje koraliki CaM-sepharose do identyfikacji interakcji białkowych w komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Tiffany Cherry za pomoc w optymalizacji niniejszego protokołu. Praca ta była finansowana przez National Institute of Aging (AG032320) oraz Advancing a Healthier Wisconsin.

Podstawowy schemat procedury, rozpoczynającej się od homogenatu, przedstawiono na Rysunku 1. Przewidywany czas od przygotowania ekstraktów komórkowych do elucji białek związanych z CaM wynosi około sześciu do siedmiu godzin.
1. Przygotowanie tkanki
<ol>
	<li>Wstrzyknąć do organotypowych przekrojów hipokampa wirusa zawierającego plazmid ekspresyjny dla rekombinowanego białka zainteresowania (w tym przykładzie Ng z etykietą białka fluorescencyjnego GFP) i pozostawić tkankę na noc w celu ekspresji białka.</li>
 <li>Około 12 do 18 godzin po wstrzyknięciu wirusa (zależnie od czasu ekspresji wiralnej), przygotować tkankę do pobrania. Do szalki Petriego dodać 1mL buforu do dyssekcji (10mM glukozy, 4mM KCl, 26mM NaHCO3, 233mM sacharozy, 5mM MgCl2, 1mM CaCl2 oraz 0,1% czerwieni fenolowej, nasyconego mieszanką 5% CO2 i 95% O2). Przenieść hodowaną tkankę/insert do szalki Petriego i dodać 2mL buforu do dyssekcji do insertu, aby zanurzyć tkankę. </li>
 <li>Pobrać organotypową tkankę hipokampa (od 5 do 10 przekrojów), delikatnie oddzielając tkankę od membrany insertu za pomocą skalpela. Opcjonalnie można usunąć konkretny obszar zainteresowania (np. CA1). Przenieść zawieszoną tkankę do probówki do mikrowirowania o pojemności 1,5mL za pomocą odwróconej pipety Pasteura. </li>
 <li>Wirować próbki przy 1 500 rcf przez 1 min, aby oddzielić tkankę od buforu do dyssekcji. Ostrożnie usunąć nadsącz poprzez aspirację, uważając, aby nie zaburzyć osadu. </li>
 <li>Dla każdego użytego przekroju dodać do tkanki od 30 do 60 μL buforu do homogenizacji (150mM NaCl, 20mM Tris pH 7,5, 1mM DTT, 1μg/mL leupeptyny, 1μg/mL chemostatyny, 1μg/mL antipainy, 1μg/mL pepstatyny oraz 1% Triton X-100) i dokładnie zhomogenizować za pomocą tłuczka.</li>
 <li>W celu usunięcia resztek komórkowych, wirować pozostały homogenat przy 1 100 rcf przez 10 min i ostrożnie usunąć nadsącz przez aspirację, unikając zanieczyszczenia osadem.</li>
 <li>Odjąć 10% nadsączu jako próbkę wejściową (próbka 1). Pozostały nadsącz przechowywać w lodzie podczas przygotowywania kulek CaM-sepharose do użycia w kroku 3.</li>
</ol>
Uwaga: Wykorzystana w tym przypadku tkanka to organotypowe skrawki hipokampa. Można jednak użyć dysocjowanych neuronów lub dowolnego innego systemu hodowli komórkowej. W takim przypadku należy rozpocząć od kroku 1.4 po odpowiednim pobraniu tkanki.
2. Przygotowanie kulek do pull-down
Podczas pracy z kuleczkami ważne jest odzyskanie ich oraz maksymalizacja wydajności reakcji poprzez zapobieganie wysychaniu kuleczek na ściankach probówki. Aby to osiągnąć, najlepiej jest obrócić probówki na bok, pozwalając roztworowi zwilżyć kuleczki znajdujące się na ściankach, bezpośrednio przed wirowaniem.
<ol>
	<li>Do każdego pull-downu pipetuj 400 μL zawiesiny kulek Calmodulin-Sepharose do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL z relatywnie płaskim dnem, aby zmaksymalizować powierzchnię kontaktu i interakcję roztworów z kulekami podczas inkubacji. </li>
 <li>Centryfuguj kuleczki przy 21 000 rcf przez 30 sekund i ostrożnie usuń nadsącz poprzez aspirację. Upewnij się, że nie poruszyłeś osadu kulek. </li>
 <li>Aby wypłukać kuleczki, dodaj 100 μL odpowiedniego buforu do homogenizacji zawierającego 2 mM CaCl2 w przypadku pull-downu białek wiążących Ca2+-CaM lub 2 mM EDTA (znanego chelatora Ca2+) w przypadku kulek do pull-downu białek wiążących ApoCaM. Delikatnie opukaj probówkę, aby ponownie zawiesić kuleczki, i centryfuguj przy 1 500 rcf przez 1 min. Ostrożnie usuń nadsącz poprzez aspirację, dbając o to, by nie poruszyć kuleczek. </li>
</ol>
Uwaga: We wszystkich etapach aspiracji zaleca się stosowanie końcówek do pipety z wąskim otworem (np. końcówek do nakładania żeli), aby umożliwić usunięcie roztworu bez usuwania kulek.
3. Wiązanie białek do sepharose-CaM
<ol>
	<li>Podziel supernatant na dwie próbki o równej objętości. W zależności od warunków doświadczenia, dodaj do supernatantu odpowiednią ilość CaCl2 lub EDTA, tak aby osiągnąć stężenie 2 mM dla każdego z nich.</li>
 <li>Dodaj supernatant z kroku 1.7 do kulek wypłukanych w odpowiednim buforze homogenizacyjnym. Delikatnie stuknij probówką o blat, aby wymieszać zawartość.</li>
 <li>Inkubuj próbki w temperaturze 4°C przez 3 h na wytrząsarce. Resuspenduj kulejki mniej więcej co 30 min, aby zwiększyć wydajność wiązania.</li>
 <li>Odwiruj probówkę z próbkami i kulejkami przy 1 500 rcf przez 3 min.</li>
 <li>Pobierz 50 µL supernatantu jako próbkę białka niezwiązanego (próbka 2), a pozostały supernatant ostrożnie usuń za pomocą aspiratora i odrzuć.</li>
 <li>Wypłucz kulejki trzy razy zgodnie z opisem w kroku 2.3, używając 100 µL odpowiedniego buforu homogenizacyjnego.</li>
</ol>
4. Elucja
<ol>
	<li>Dodaj do kulek 50μL buforu elucyjnego (50mM Tris-HCl pH 7.5 i 150mM NaCl) zawierającego przeciwstawne warunki (10mM CaCl2 lub 10mM EDTA). Na przykład próbki, które zostały homogenizowane i związane w buforze zawierającym Ca2+, są eluowane w buforze elucyjnym zawierającym EDTA i odwrotnie.</li>
</ol>
Opcjonalnie: Podgrzanie buforu elucyjnego do 37°C przed dodaniem go do kulek może zwiększyć wydajność.
<ol start="2">
 <li>Inkubować roztwór z kuleczkami w temperaturze pokojowej przez 30 min na wytrząsarce. Mieszać kuleczki, delikatnie opukując probówkę mniej więcej co 5 min. </li>
 <li>Wiruć kuleczki przy 1 500 rcf przez 3 min, a następnie ostrożnie odessać 50 μL supernatantu zawierającego białko związane (próbka 3). Należy uważać, aby nie poruszyć osadu kuleczek. </li>
 <li>Dodać bufor do ładowania białek do wszystkich próbek (tj. do homogenatu, białka niezwiązanego i związanego, a także do białek wciąż związanych z kuleczkami). </li>
</ol>
Uwaga: Aby zmaksymalizować elucję (zwłaszcza w przypadku nieefektywnej elucji), przed podgrzaniem próbek należy dodać do kulek 50μL odpowiedniego buforu elucyjnego (np. dodanie buforu zawierającego EDTA do kulek związanych w CaCl2), aby pomóc w elucji pozostałego związanego białka, a następnie powtórzyć kroki opisane w punkcie 4.3 w celu usunięcia pozostałych związanych białek.
5. SDS-PAGE i western blot
Przeprowadź elektroforezę SDS-PAGE i przeanalizuj wyniki za pomocą western blotu, wykrywając interesujące białko oraz białko znane z wiązania CaM w przeciwstawnym wariancie jako kontrolę pozytywną.
6. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 2B przedstawia przykład testu CaM-pull-down badającego wiązanie CaM przez Ng znakowane GFP w porównaniu do endogennego Ng. W tym celu GFP-Ng wyeksprymowano nadekspresyjnie w naszych organotypowych skrawkach hipokampa przez noc, a następnie tkankę poddano homogenizacji. Homogenizat inkubowano z kuleczkami CaM-sepharose w obecności Ca2+ lub EDTA. Próbka wejściowa homogenizatu pokazuje, że GFP-Ng zostało wyeksprymowane obok endogennego Ng i kinazy II zależnej od Ca2+/CaM (CaMKII). Zgodnie z oczekiwaniami, opartymi na znanym wiązaniu endogennego Ng (przedstawionym na Rys. 2A), Ng znakowane GFP zostało eluowane wobec braku Ca2+ (białko związane przez EDTA) i nie zostało związane w obecności Ca2+ (Rys. 2B). W przeciwieństwie do tego, kontrola, CaMKII, została eluowana tylko w obecności Ca2+ (białko związane) i nie została związana w jego nieobecności (EDTA). Dowodzi to, że kuleczki CaM działały prawidłowo, a elucje były wydajne. Co najważniejsze, wykazuje to, że GFP-Ng wiąże się z ApoCaM w sposób podobny do formy endogennej, co sugeruje, że znacznik GFP nie zmienił funkcji naszego białka rekombinowanego.
<img src="/files/ftp_upload/3502/3502fig1.jpg" alt="Schemat badania pull-down CaM: próbka wejściowa, wiązanie białek, elucja; wirowanie, zastosowanie odczynników." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Schemat badania pull-down CaM 
(A) Homogenat tkankowy jest wirowany w celu usunięcia szczątków komórkowych. Około 10% supernatantu jest pobierane jako próbka wejściowa (input) (1). Pozostały supernatant dzieli się po równo na różne warunki i dodaje odpowiednie odczynniki (CaCl2 lub EDTA), aby sprawdzić wiązanie w tych warunkach. Każdy supernatant (zawierający CaCl2 lub EDTA) nanosi się na odpowiednio przygotowane kulki CaM-sepharose i (B) inkubuje, aby umożliwić wiązanie. Niewiążące się białka są usuwane (2), a następnie (C) związane białka (3) są eluowane z kulek przy użyciu buforu elucyjnego (E.B.) zawierającego warunki przeciwstawne do warunków wiązania. Skład białkowy tych trzech próbek białkowych można analizować za pomocą SDS-PAGE i analizy western blot.
<img src="/files/ftp_upload/3502/3502fig2.jpg" alt="Schemat oddziaływań białek wiążących wapń oraz wyniki elektroforezy żelowej wykazujące CaM, CaMKII, Ng." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. A.) Schemat zależnego od Ca2+ wiązania i elucji CaM w analizie pull-down. Przedstawiono przykłady dwóch typów białek, które wiążą CaM w sposób zależny od Ca2+.
Neurogranina (Ng) reprezentuje białka wiążące apo-CaM, a CaMKII reprezentuje białka wiążące CaM bogatą w Ca2+. CaM przedstawiono w stanie dysocjowanym przed inkubacją z białkami z homogenatu. Po inkubacji w warunkach wysokich stężeń Ca2+ (2 mM) lub w obecności chelatora Ca2+, EDTA (2 mM), białka zwiążą się z CaM odpowiednio do tych warunków. Ng wiąże CaM w warunkach z EDTA, ponieważ obecność Ca2+ jest znikoma lub żadna, i zostałaby eluowana z kulek CaM-sepharose w obecności Ca2+. Natomiast CaMKII wiązałaby się z CaM w obecności wysokich ilości Ca2+ i dysocjowałaby po chelatacji Ca2+.
 B.) Wyniki przykładowej analizy pull-down CaM. Rycina ta demonstruje oczekiwany końcowy wynik analizy pull-down z użyciem CaM-sepharose, w której próbki badano pod kątem obecności Ng i CaMKII. Zarówno endogenna Ng, jak i GFP-Ng są obecne w ścieżkach białek związanych z CaM w obecności EDTA. Ng nie wiąże się, gdy próbki są inkubowane z CaM w obecności Ca2+, co dowodzi, że Ng wiąże wyłącznie apo-CaM. Z kolei nasza kontrola pozytywna, CaMKII, wiąże się z CaM tylko w obecności Ca2+.

<ol><li>Vincenzi, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin+in+the+regulation+of+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+West+Pharmacol+Soc%22%5BJournal%5D)">Calmodulin in the regulation of intracellular calcium.</a> Proc. West Pharmacol Soc. 22, 289-294 (1979).</li>
<li>Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin+plays+a+pivotal+role+in+cellular+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation.</a> Science. 207, 19-27 (1980).</li>
<li>Zhang, M., Tanaka, T., Ikura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-induced+conformational+transition+revealed+by+the+solution+structure+of+apo+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium-induced conformational transition revealed by the solution structure of apo calmodulin.</a> Nat. Struct. Biol. 2, 758-767 (1995).</li>
<li>Alexander, K. A., Wakim, B. T., Doyle, G. S., Walsh, K. A., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+the+calmodulin-binding+domain+of+neuromodulin%2C+a+neurospecific+calmodulin-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of the calmodulin-binding domain of neuromodulin, a neurospecific calmodulin-binding protein.</a> J. Biol. Chem. 263, 7544-7549 (1988).</li>
<li>Huang, K. P., Huang, F. L., Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+7.5-kDa+protein+kinase+C+substrate+%28RC3+protein%2C+neurogranin%29+from+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Characterization of a 7.5-kDa protein kinase C substrate (RC3 protein, neurogranin) from rat brain.</a> Arch. Biochem. Biophys. 305, 570-580 (1993).</li>
<li>Bahler, M., Rhoads, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin+signaling+via+the+IQ+motif%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Calmodulin signaling via the IQ motif.</a> FEBS Lett. 513, 107-113 (2002).</li>
<li>Routtenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+activation+leading+to+protein+F1+phosphorylation+may+regulate+synaptic+plasticity+by+presynaptic+terminal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Neural.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C activation leading to protein F1 phosphorylation may regulate synaptic plasticity by presynaptic terminal growth.</a> Behav. Neural. Biol. 44, 186-200 (1985).</li>
<li>Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogranin+enhances+synaptic+strength+through+its+interaction+with+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin.</a> EMBO J. 28, 3027-3039 (2009).</li>
<li>Needham, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+and+adenosinetriphosphate+in+relation+to+muscle+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Myosin and adenosinetriphosphate in relation to muscle contraction.</a> Biochim. Biophys. Acta. 4, 42-49 (1950).</li>
<li>Hathaway, D. R., Adelstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+platelet+myosin+light+chain+kinase+requires+the+calcium-binding+protein+calmodulin+for+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Human platelet myosin light chain kinase requires the calcium-binding protein calmodulin for activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 1653-1657 (1979).</li>
<li>Fukunaga, K., Yamamoto, H., Matsui, K., Higashi, K., Miyamoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+a+Ca2%2B-+and+calmodulin-dependent+protein+kinase+from+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of a Ca2+- and calmodulin-dependent protein kinase from rat brain.</a> J. Neurochem. 39, 1607-1617 (1982).</li>
<li>Yang, S. D., Tallant, E. A., Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcineurin+is+a+calmodulin-dependent+protein+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Calcineurin is a calmodulin-dependent protein phosphatase.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 106, 1419-1425 (1982).</li>
<li>Huestis, W. H., Nelson, M. J., Ferrell, J. E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin-dependent+spectrin+kinase+activity+in+human+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Clin.+Biol.+Res%22%5BJournal%5D)">Calmodulin-dependent spectrin kinase activity in human erythrocytes.</a> Prog. Clin. Biol. Res. 56, 137-155 (1981).</li>
<li>Yamniuk, A. P., Vogel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin%27s+flexibility+allows+for+promiscuity+in+its+interactions+with+target+proteins+and+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Calmodulin's flexibility allows for promiscuity in its interactions with target proteins and peptides.</a> Mol. Biotechnol. 27, 33-57 (2004).</li>
<li>Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogranin+phosphorylation+fine-tunes+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiony protokół wykorzystuje kulek CaM-sepharose do badania zależności białek wiążących CaM od stężenia Ca2+. Wiele białek wiąże CaM w sposób zależny od Ca2+. Oddziaływania te mają ogromne znaczenie ze względu na liczbę białek wiążących CaM oraz ich krytyczną rolę w wielu szlakach sygnalizacyjnych. W niniejszym protokole kulek CaM-sepharose są używane do oddzielenia białek wiążących CaM z homogenatu tkankowego w obecności lub w braku Ca2+. Wyniki tego prostego podejścia pozwolą na ...

<table><tbody><tr><td>Kuleczki Calmodulin-Sepharose</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0529-01</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CamKII alpha</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6974</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-neurogranina</td><td>EMD Millipore</td><td>07-425</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet do nakładania żelu</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-138</td><td>Stosować do odsysania nadnadkładzin</td></tr><tr><td>Probówki do mikrocentryfugi (2,0 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-146</td><td>Stosować we wszystkich etapach z użyciem kuleczek calmodulin-sepharose</td></tr></tbody></table>

wytrącanie białek wiążących kalmoduliną (pull-down)

Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

Wapń (Ca2+) jest jonem kluczowym w regulacji funkcji komórkowych poprzez szereg mechanizmów. Znaczna część sygnalizacji Ca2+ jest przekazywana przez białko wiążące wapń, znane jako kalmodulina (CaM)1,2. CaM bierze udział na wielu poziomach w niemal wszystkich procesach komórkowych, w tym w apoptozie, metabolizmie, skurczu mięśni gładkich, plastyczności synaptycznej, wzroście nerwów, zapaleniu i odpowiedzi immunologicznej. Liczne białka pomagają regulować te szlaki poprzez oddziaływania z CaM. Wiele z tych oddziaływań zależy od konformacji CaM, która wyraźnie różni się w stanie związania z Ca2+ (Ca2+-CaM) w porównaniu ze stanem wolnym od Ca2+ (ApoCaM)3.
Podczas gdy większość białek docelowych wiąże kompleks Ca2+-CaM, niektóre białka wiążą wyłącznie ApoCaM. Niektóre wiążą CaM poprzez swoją domenę IQ, w tym neuromodulina4, neurogranina (Ng)5 oraz niektóre miozyny6. Wykazano, że białka te odgrywają istotną rolę odpowiednio w funkcji presynaptycznej7, funkcji postsynaptycznej8 oraz w skurczu mięśni9. Ich zdolność do wiązania i uwalniania CaM w obecności lub przy braku Ca2+ ma kluczowe znaczenie dla ich funkcjonowania. Z kolei wiele białek wiąże wyłącznie Ca2+-CaM i wymaga tego wiązania do swojej aktywacji. Przykłady obejmują kinazę lekkich łańcuchów miozyny10, kinazy (CaMKs)11 i fosfatazy (np. kalcyneurynę)12 zależne od Ca2+/CaM oraz kinazę spektryny13, które wywołują szereg bezpośrednich i wtórnych efektów14.
Wpływ tych białek na funkcje komórkowe często zależy od ich zdolności do wiązania się z CaM w sposób zależny od Ca2+. Na przykład badaliśmy znaczenie wiązania Ng-CaM w funkcji synaptycznej oraz to, jak różne mutacje wpływają na to wiązanie. Stworzyliśmy konstrukt Ng z tagiem GFP z konkretnymi mutacjami w domenie IQ, które zmieniały zdolność Ng do wiązania CaM w sposób zależny od Ca2+. Badanie tych różnych mutacji pozwoliło nam uzyskać cenny wgląd w istotne procesy zaangażowane w funkcję synaptyczną8,15. Jednak w tego typu badaniach niezbędne jest wykazanie, że zmutowane białka wykazują oczekiwaną zmianę powinowactwa do CaM.
W niniejszej pracy przedstawiamy metodę badania zdolności białek do wiązania się z CaM w obecności lub przy braku Ca2+, wykorzystując CaMKII i Ng jako przykłady. Metoda ta jest formą chromatografii powinowactwa, określaną jako test pull-down z wykorzystaniem CaM. Wykorzystuje ona kuleczki CaM-Sepharose do badania białek wiążących się z CaM oraz wpływu Ca2+ na to wiązanie. Jest ona znacznie bardziej wydajna pod względem czasu i wymaga mniejszej ilości białka w porównaniu do chromatografii kolumnowej oraz innych testów. W całości stanowi to cenne narzędzie do badania sygnalizacji Ca2+/CaM oraz białek oddziałujących z CaM.

Test pull-down kalmoduliny (CaM) jest skutecznym sposobem badania oddziaływań CaM z różnymi białkami. Metoda ta wykorzystuje paciorki sefarozowe z CaM do wydajnej i specyficznej analizy białek wiążących CaM. Stanowi ona istotne narzędzie do badania sygnalizacji CaM w funkcjach komórkowych.

Wytrącanie białek wiążących kalmoduliną (pull-down)

Wapń (Ca2+) jest jonem kluczowym w regulacji funkcji komórkowych za pomocą szeregu mechanizmów. Znaczna część sygnalizacji wapniowej odbywa się za pośrednictwem...

Ogólnym celem tej procedury jest badanie białek, które wiążą się z kalmoduliną w sposób zależny od wapnia. Osiąga się to najpierw poprzez wyizolowanie interesujących białek. Następnie przygotowuje się koraliki z kalmoduliną w celu związania białek.Następnie białka inkubuje się z kuleczkami z przeciwciałami przeciwko kalmodulinie. W końcowym etapie eluuje się białka, które wiążą się w sposób zależny od wapnia. Ostatecznie, za pomocą analizy western blot można uzyskać wyniki wskazujące białka wiążące się z kalmoduliną w obecności lub w nieobecności wapnia.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi istniejącymi metodami, takimi jak chromatografia powinowactwa i immunoprecypitacja, jest to, że wymaga ona mniejszej ilości białka i mniej czasu. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu sygnalizacji cow modlin, takie jak to, jakie białka wiążą się z cow modlin w sposób zależny od wapnia oraz w jaki sposób modyfikacje potranslacyjne mogą wpływać na ich wiązanie z cow modlin. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy manipulacji koralikami są niezbędne, a opis ich resuspensji i zatrzymania jest trudny do zrozumienia bez możliwości obejrzenia tego procesu.Aby przygotować tkankę do homogenizacji, należy wstrzyknąć w organotypowe skrawki hipokampa wirusa zawierającego plazmid kodujący interesujące białko rekombinowane. W tym przykładzie białkiem rekombinowanym jest Neuro Grandin znakowane GFP. Po wstrzyknięciu wirusa należy pozostawić tkankę na noc w celu ekspresji białka (około 12 do 18 godzin), a następnie dodać jeden mililitr buforu do sekcji do szalki Petriego.Przenieść hodowaną tkankę wraz z wkładką do szalki Petriego, a następnie za pomocą skalpela dodać do wkładki dwa mililitry buforu do sekcji, aby zanurzyć tkankę. Zebrać od pięciu do 10 organotypowych plastrów tkanki hipokampa, delikatnie oddzielając tkankę od membrany wkładki za pomocą odwróconej pipety Pasteura. Przenieść zawiesinę tkankową do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mililitra.Następnie odwiruj próbki z prędkością 1500 RCF przez jedną minutę. Aby oddzielić tkankę od buforu do sekcji, ostrożnie usuń nadsącz za pomocą aspiratora. Należy uważać, aby nie naruszyć osadu.Dla każdego użytego skrawka przenieść tkankę do 30 do 60 µL buforu do homogenizacji za pomocą pipety 1 ml z odciętą końcówką, a następnie dokładnie zhomogenizować ją za pomocą tłuczka przed przeniesieniem homogenatu z powrotem do oryginalnej probówki. W celu usunięcia zanieczyszczeń komórkowych odwiruj pozostały homogenat przy 1100 RCF przez 10 minut i ostrożnie pobierz nadsącz poprzez aspirację, unikając zanieczyszczenia osadem. Odlej 10% nadsączu jako próbkę wejściową.Pozostały nadsącz przechowywać w lodzie podczas przygotowania kulek cal sero do użycia. Następnie, dla każdego etapu wyodrębniania (pull down), pipetować 400 µL zawiesiny kulek cal Modlin Sero do probówki do mikrowirówki o pojemności 2 mL z relatywnie płaskim dnem, aby zmaksymalizować powierzchnię kontaktu i oddziaływanie roztworów z kuleczkami podczas inkubacji, obrócić probówkę na bok, aby zwilżyć kuleczki, a następnie wirować je przy 21 000 RCF przez 30 sekund.Następnie ostrożnie usuń nadsącz za pomocą aspiracji. Upewnij się, że nie poruszyłeś kulek, a następnie przemyj je 100 µL odpowiedniego buforu homogenizacyjnego zawierającego albo 2 mM chlorku wapnia (w przypadku kulek używanych do wyciskania białek wiążących wapniową kalmodulinę), albo 2 mM EDTA, znanego chelatora wapnia (w przypadku kulek używanych do wyciskania białek wiążących apo-kalmodulinę).Delikatnie opukiwać probówkę, aby resuspender kulki. Zawiesić kulki i wirować przy 1500 RCF przez jedną minutę. Ostrożnie usunąć nadsącz poprzez aspirację, dbając o to, aby nie poruszyć kulek, w celu związania białek z sferami kalmoduliny do immunoprecypitacji.Zacznij od podzielenia SNAT na dwie równe objętości. W zależności od warunków dla danej aliquoty, dodaj do supernatantu odpowiednią ilość chlorku wapnia lub EDTA do stężenia końcowego 2 mM. Przenieś supernatnat do wypłukanych kulek w odpowiednim buforze homogenizacyjnym.Delikatnie opukaj probówkę, aby wymieszać zawartość. Inkubuj próbki w temperaturze 4 °C przez trzy godziny na wytrząsarce. Co około 30 minut resuspendujemy kuleczki w celu zwiększenia wydajności wiązania.Następnie odwiruj próbki przy 1500 RC F przez trzy minuty. Pobierz 50 µL supernatantu jako próbkę nieprzypisanego białka, a pozostałą część supernatantu ostrożnie usuń za pomocą aspiratora i odrzuć. Przemyj kuleczki trzy razy, tak jak poprzednio, stosując 100 µL odpowiedniego buforu do homogenizacji.Najtrudniejszym etapem tej procedury jest efektywna elucja białek docelowych. Aby zapewnić powodzenie procesu, należy zastosować odpowiedni rodzaj probówki, aby zminimalizować stratę kulek, oraz właściwie resuspender kulki w podgrzanym buforze do elucji. Wcześniejsze podgrzanie buforu do elucji może również znacząco pomóc. Do kulek należy dodać 50 µL buforu do elucji, aby przeprowadzić elucję białka.Próbki, które zostały zhomogenizowane i związane w buforze zawierającym wapń, rozpuszczono w buforze zawierającym EDTA, natomiast próbki w buforze zawierającym EDTA uzupełniono wapniem. Inkubować kuleczki w temperaturze pokojowej przez 30 minut na wytrząsarce. Mieszać kuleczki, delikatnie opukując probówkę mniej więcej co pięć minut.Odwiruj kuleczki z prędkością 1500 RCF przez trzy minuty, a następnie ostrożnie usuń aspiracją 50 µL SNAT z próbki białka związanego. Należy uważać, aby nie poruszyć osadu kuleczek. Przeprowadź elektroforezę SDS-PAGE i western blotting, aby zidentyfikować poszukiwane białko jako kontrolę pozytywną w przeciwstawnym wariancie badawczym.Białko Prop Pro znane jest z wiązania Cal Modlin. Rysunek ten przedstawia przykład testu pull-down Cal Modlin sprawdzającego wiązanie Cal MODLIN przez GFP TAG Neuro Grandin w porównaniu z endogenną neuro Grandin. Homogeniczny wkład wykazuje, że GFP neuro Grandin była ekspresowana dodatkowo do endogennej neuro grandin oraz kinazy zależnej od wapnia i kalmoduliny 2, zgodnie z oczekiwaniami opartymi na znanym wiązaniu endogennej neuro Grandin.Neurograndina znakowana GFP została wyelutowana w warunkach braku wapnia i nie wiązała się w obecności wapnia. Z kolei kontrolna kinaza dwa zależna od wapnia i kalmoduliny została wyelutowana wyłącznie w obecności wapnia i nie wiązała się w jego nieobecności. Dowodzi to, że kulki z kalmoduliną działały prawidłowo, a jednostki EEU były wydajne.Co najważniejsze, wykazuje to, że GFP neuro grin wiąże się z Apoch Cal Modlin w sposób podobny do formy endogennej, co sugeruje, że znacznik GFP nie zmienił funkcji białka rekombinowanego. Po opanowaniu tej techniki, nie wliczając w to analizy SDS page i Western blood, procedurę można ukończyć w ciągu sześciu godzin, jeśli jest ona przeprowadzona prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o odpowiednim oznakowaniu wszystkich próbek i probówek dla danej warunku, ponieważ każda zmiana stężenia wapnia może zdyskwalifikować cały eksperyment. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak efektywnie określić zdolność konkretnych białek do wiązania CAL modułu w sposób zależny od wapnia.Poprzez wyizolowanie białek docelowych, inkubację z odpowiednio przygotowanymi ko-modulantami SRO, elucję związanych białek i ich analizę za pomocą metody Western blot.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wyświetlenie białek wiążących kalmodulinę

Siatkowka śródplazmatyczna odgrywa kluczową rolę w biogenezie białek oraz w homeostazie wapnia. Opracowaliśmy system eksperymentalny, który pozwala nam zbadać rolę kanałów przecieku Ca2+ oraz scharakteryzować ich domniemane mechanizmy regulacyjne. System ten obejmuje wyciszanie genów za pomocą siRNA oraz obrazowanie Ca2+ w żywych komórkach.

Obrazowanie poziomu wapnia w żywych komórkach połączone z wyciszaniem genów za pomocą siRNA identyfikuje kanały przecieku Ca2+ w błonie ER i ich mechanizmy regulacyjne

Wykazano, że regulator przewodnictwa przezbłonowego w mukowiscydozie (CFTR), będący nabłonkowym kanałem chlorkowym, oddziałuje z różnymi białkami i reguluje istotne procesy komórkowe; wśród nich dobrze udokumentowano oddziaływania pośredniczone przez motyw PDZ białka CFTR. Niniejszy protokół opisuje opracowane przez nas metody składania kompleksu sygnalizacyjnego makromolekularnego CFTR zależnego od domeny PDZ in vitro.

In vitro analiza makromolekularnych kompleksów sygnałowych CFTR zależnych od domen PDZ

Prezentujemy protokoły zastosowania naszego ukierunkowanego, genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia (GECI) CatchER+ do monitorowania szybkich stanów przejściowych wapnia w retikulum endoplazmatycznym/sarkoplazmatycznym (ER/SR) HEK293 i komórkach C2C12 mięśni szkieletowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w czasie rzeczywistym. Omówiono również protokół pomiaru i kalibracji in situ Kd.

Monitorowanie uwalniania wapnia ER/SR za pomocą ukierunkowanego czujnika Ca2+ CatchER+

Opisany test komórkowy jest przeznaczony do identyfikacji czynników oddziałujących z receptorem chemokiny 4 (CXCR4) CXC, które hamują lub stymulują, konkurencyjnie lub allosterycznie, wewnątrzkomórkowe uwalnianie Ca2+ zainicjowane przez aktywację CXCR4.

Test mobilizacji Ca2 + oparty na fluorescencji kinetycznej w celu identyfikacji agonistów, antagonistów i modulatorów allosterycznych sprzężonych z białkiem G

Różnicowe promieniste działanie kapilarne testu ligandowego (DRaCALA) może być wykorzystane do identyfikacji małych białek wiążących ligand organizmu za pomocą biblioteki ORFeome.

Identyfikacja białek wiążących małe ligandy za pomocą zróżnicowanego promieniowego działania kapilarnego testu ligandowego (DRaCALA)

Obecny protokół opisuje przygotowanie próbki i analizę danych w celu ilościowego określenia fosforylacji białek za pomocą ulepszonego testu ściągania pojedynczych cząsteczek (SiMPull).

Zoptymalizowany test typu pull-down dla pojedynczych cząsteczek do ilościowego oznaczania fosforylacji białek

Tutaj opisujemy metodę bakteryjnej koekspresji różnie znakowanych białek za pomocą zestawu kompatybilnych wektorów, a następnie konwencjonalne techniki pulldown do badania kompleksów białkowych, które nie mogą się składać in vitro.

Test pulldown w połączeniu z koekspresją w komórkach bakteryjnych jako efektywne czasowo narzędzie do testowania trudnych interakcji białko-białko

Opracowano ulepszony protokół testu mobilizacji wapnia z komórkami śródbłonka, używanego do identyfikacji ligandów receptorów aktywowanych proteazą (PAR). Nowy protokół skraca całkowity czas oznaczania o 90-120 minut i pozwala uzyskać powtarzalne krzywe stężenie-odpowiedź.

Charakterystyka modulatorów receptorów aktywowanych proteazą za pomocą testu mobilizacji wapnia za pomocą czytnika płytek

W tym filmie prezentujemy metodę elektroforetycznego rozdzielania białek z wykorzystaniem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE).

Elektroforetyczne rozdział białek

Po rozdzieleniu metodami elektroforetycznymi białka w żelu można wykryć za pomocą kilku metod barwienia. W niniejszym filmie zaprezentowano barwienie białek błękitem Coomassie, barwienie srebrem, SYPRO Orange oraz SYPRO Ruby.

Barwienie białek w żelach

Poznaj metodę ściągania białek wiążących kalmodulinę w zależności od wapnia. Technika wykorzystuje koraliki CaM-sepharose do identyfikacji interakcji białkowych w komórkach.

Wytrącanie białek wiążących kalmoduliną (pull-down)

Przeglądaj więcej filmów