Ściąganie białek wiążących kalmodulinę

Ogólnym celem tej procedury jest przetestowanie białek, które wiążą się z Cal Modlin w sposób zależny od wapnia. Osiąga się to poprzez pierwsze zebranie interesujących nas białek. Następnie przygotowywane są prędkości sero kalmoduliny do wiązania białek.

Następnie białka są inkubowane z prędkościami serologicznymi kalmoduliny. Na koniec wspomina się o białkach, które wiążą się w sposób zależny od wapnia. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują białka, które wiążą się z kalmoduliną w obecności lub braku wapnia poprzez zachodnią analizę krwi.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi istniejącymi metodami, takimi jak chromatografia uspokojowa i strącanie immunologiczne, jest to, że wymaga mniej białka i mniej czasu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w polu sygnalizacyjnym modlin krowi, takie jak to, jakie białka wiążą się z modrynem krowim w sposób zależny od wapnia i jak modyfikacje potranslacyjne mogą wpływać na ich wiązanie z modryną krowią. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy obsługi koralików są niezbędne, a opis resusu i retencji koralików jest trudny do naśladowania bez jego zobaczenia.

Aby przygotować tkankę do jednorodnego wstrzyknięcia, należy wstrzyknąć organotypowe wycinki hipokampa z wirusem zawierającym plazmid wyrażający rekombinowane białko będące przedmiotem zainteresowania. W tym przykładzie rekombinowanym białkiem jest GFP oznaczone jako Neuro Grandin. Pozwól tkance na ekspresję białka przez noc około 12 do 18 godzin po wstrzyknięciu wirusa, dodaj jeden mililitr buforu preparacyjnego do szalki Petriego.

Przenieść wyhodowaną tkankę z wkładką na szalkę Petriego i dodać dwa mililitry buforu preparacyjnego do wkładki, aby zanurzyć tkankę za pomocą skalpela. Zbierz od pięciu do 10 organotypowych wycinków tkanki hipokampa, delikatnie zeskrobując tkankę z błony wkładki za pomocą odwróconej pipety pastwiskowej. Przenieś zawieszoną tkankę do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej.

Następnie odwirować próbki w temperaturze 1500 RCF przez jedną minutę. Aby oddzielić tkankę od buforu preparacyjnego, ostrożnie usunąć supernatant przez aspirację. Uważaj, aby nie naruszyć pelletu.

Dla każdego użytego plasterka dodaj tkankę do 30 do 60 mikrolitrów buforu homogenizacyjnego za pomocą jednomililitrowej pipety z odciętą końcówką, a następnie dokładnie homogenizuj ją za pomocą tłuczka przed powrotem homogenatu do oryginalnej probówki. W celu usunięcia resztek komórkowych należy odwirować pozostały homogenat w temperaturze 1100 RCF przez 10 minut i ostrożnie zebrać snat przez aspirację, unikając zanieczyszczenia z osadu. Podwielokrotność 10% supernatantu jako próbki wsadu.

Pozostałą supernatant należy przechowywać na lodzie podczas przygotowywania kulek cal sero do użycia. Później, dla każdej pipety ciągnionej w dół, 400 mikrolitrów zawieszonego cal Modlin Sero prędkości do dwumililitrowej mikroprobówki wirówkowej ze stosunkowo płaskim dnem, aby zmaksymalizować powierzchnię i interakcję roztworów z kulkami podczas inkubacji, obrócić rurkę mikrowirówki na bok, aby zwilżyć kulki, a następnie odwirować kulki przy 21, 000. RCF przez 30 sekund.

I ostrożnie usuń supernatant przez aspirację. Upewnij się, że nie przeszkadzasz kulkom w myciu kulek w 100 mikrolitrach odpowiedniego buforu homogenizacyjnego zawierającego dwa milimolowe chlorki wapnia do kulek używanych do ściągania białek wiążących wapń cal modlin. Lub dwa milimolowe E-D-T-A-A znany chelator wapnia do kulek używany do ściągania białek wiążących apo cal modlin.

Delikatnie postukaj rurką w Resus. Zawiesić kulki i odwirować w temperaturze 1500 RCF na jedną minutę. Ostrożnie usunąć supernatant przez aspirację, uważając, aby nie naruszyć kulek w celu związania białek ze sferami kalmoduliny w celu ściągnięcia.

Zacznij od podzielenia translatora adresów sieciowych na dwa równe woluminy. W zależności od warunku na podwielokrotność, dodać odpowiednią ilość chlorku wapnia lub EDTA do supernatu do końcowego stężenia dwóch milimolów. Dodać supernatant do przemytych kulek w odpowiednim buforze homogenizacyjnym.

Delikatnie postukaj w tubkę, aby wymieszać. Inkubować próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy godziny na shakerze. Koraliki zawieszamy mniej więcej co 30 minut, aby zwiększyć efektywność wiązania.

Następnie odwirować próbki w temperaturze 1500 RC F przez trzy minuty. Usunąć 50 mikrolitrów supernatantu jako próbkę niezwiązanego białka i ostrożnie usunąć pozostały snat przez aspirację i wyrzucić. Przemyć kulki trzykrotnie jak poprzednio 100 mikrolitrami odpowiedniego buforu homogenizacyjnego.

Najtrudniejszym krokiem w tej procedurze jest wyjaśnienie docelowych białek w skuteczny sposób. Najlepszym sposobem na zapewnienie sukcesu jest użycie odpowiedniego rodzaju probówki, aby zminimalizować straty kulek i odpowiednio zawiesić je w ogrzewaniu buforu elucyjnego. Wcześniejszy bufor elucyjny może również znacznie pomóc w elucji białka w 50 mikrolitrach buforu elucyjnego do kulek.

Próbki, które zostały zhomogenizowane i związane w buforze zawierającym wapń, są wymienione w buforze zawierającym EDTA, a próbki, które miały bufor zawierający EDTA, są powiązane z wapniem. Inkubuj koraliki w temperaturze pokojowej przez 30 minut na shakerze. Wymieszaj kulki, delikatnie stukając w rurkę co około pięć minut.

Odwirować kulki w temperaturze 1500 RCF przez trzy minuty i ostrożnie usunąć 50 mikrolitrów SNAT dla związanej próbki białka przez aspirację. Uważaj, aby nie naruszyć koralików. Przeprowadź stronę SDS i western blot, aby zidentyfikować interesujące białko jako kontrolę pozytywną w przeciwnym stanie.

Białko Prop Pro, o którym wiadomo, że wiąże Cal Modlin. Rysunek ten przedstawia przykład testu Cal Modlin pull down testującego wiązanie Cal MODLIN GFP TAG Neuro Grandin w porównaniu z endogennym neuro Grandinem. Jednorodne dane wejściowe pokazują, że GFP neuro Grandin ulegał ekspresji oprócz endogennej neurograndiny i kinazy zależnej od kalmoduliny wapniowej dwóch, zgodnie z oczekiwaniami w oparciu o znane wiązanie endogennego neuro Grandin.

Neuro Grandin oznaczone GFP było nawiązane do braku wapnia i nie wiązało się w obecności wapnia. W przeciwieństwie do tego, kontrolna kinaza zależna od kalmoduliny wapnia dwa była wymieniana tylko w obecności wapnia i nie była związana w przypadku jego braku. Świadczy to o tym, że kulki kalmoduliny funkcjonowały prawidłowo, a EEU były wydajne.

Co najważniejsze, pokazuje to, że GFP neuro grin wiąże się z Apoch Cal Modlin w podobny sposób jak forma endogenna, co sugeruje, że znacznik GFP nie zmienia funkcji białka rekombinowanego. Po opanowaniu tej techniki, bez strony SDS i zachodniej analizy krwi, można zakończyć w ciągu sześciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo Podczas próby tej procedury ważne jest, aby pamiętać, aby oznaczyć wszystkie próbki i probówki pod kątem odpowiedniego stanu, ponieważ każda zmiana stężenia wapnia może zagrozić całemu eksperymentowi. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie określić zdolność poszczególnych białek do wiązania modułu CAL w sposób zależny od wapnia.

Zbierając interesujące nas białka, inkubując je z odpowiednio przygotowanymi prędkościami komodulantu SRO, unikając związanych białek i testując je za pomocą zachodniej analizy krwi.