Wytrącanie białek wiążących kalmoduliną (pull-down)

Ogólnym celem tej procedury jest badanie białek, które wiążą się z kalmoduliną w sposób zależny od wapnia. Osiąga się to najpierw poprzez wyizolowanie interesujących białek. Następnie przygotowuje się koraliki z kalmoduliną w celu związania białek.

Następnie białka inkubuje się z kuleczkami z przeciwciałami przeciwko kalmodulinie. W końcowym etapie eluuje się białka, które wiążą się w sposób zależny od wapnia. Ostatecznie, za pomocą analizy western blot można uzyskać wyniki wskazujące białka wiążące się z kalmoduliną w obecności lub w nieobecności wapnia.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi istniejącymi metodami, takimi jak chromatografia powinowactwa i immunoprecypitacja, jest to, że wymaga ona mniejszej ilości białka i mniej czasu. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu sygnalizacji cow modlin, takie jak to, jakie białka wiążą się z cow modlin w sposób zależny od wapnia oraz w jaki sposób modyfikacje potranslacyjne mogą wpływać na ich wiązanie z cow modlin. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy manipulacji koralikami są niezbędne, a opis ich resuspensji i zatrzymania jest trudny do zrozumienia bez możliwości obejrzenia tego procesu.

Aby przygotować tkankę do homogenizacji, należy wstrzyknąć w organotypowe skrawki hipokampa wirusa zawierającego plazmid kodujący interesujące białko rekombinowane. W tym przykładzie białkiem rekombinowanym jest Neuro Grandin znakowane GFP. Po wstrzyknięciu wirusa należy pozostawić tkankę na noc w celu ekspresji białka (około 12 do 18 godzin), a następnie dodać jeden mililitr buforu do sekcji do szalki Petriego.

Przenieść hodowaną tkankę wraz z wkładką do szalki Petriego, a następnie za pomocą skalpela dodać do wkładki dwa mililitry buforu do sekcji, aby zanurzyć tkankę. Zebrać od pięciu do 10 organotypowych plastrów tkanki hipokampa, delikatnie oddzielając tkankę od membrany wkładki za pomocą odwróconej pipety Pasteura. Przenieść zawiesinę tkankową do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mililitra.

Następnie odwiruj próbki z prędkością 1500 RCF przez jedną minutę. Aby oddzielić tkankę od buforu do sekcji, ostrożnie usuń nadsącz za pomocą aspiratora. Należy uważać, aby nie naruszyć osadu.

Dla każdego użytego skrawka przenieść tkankę do 30 do 60 µL buforu do homogenizacji za pomocą pipety 1 ml z odciętą końcówką, a następnie dokładnie zhomogenizować ją za pomocą tłuczka przed przeniesieniem homogenatu z powrotem do oryginalnej probówki. W celu usunięcia zanieczyszczeń komórkowych odwiruj pozostały homogenat przy 1100 RCF przez 10 minut i ostrożnie pobierz nadsącz poprzez aspirację, unikając zanieczyszczenia osadem. Odlej 10% nadsączu jako próbkę wejściową.

Pozostały nadsącz przechowywać w lodzie podczas przygotowania kulek cal sero do użycia. Następnie, dla każdego etapu wyodrębniania (pull down), pipetować 400 µL zawiesiny kulek cal Modlin Sero do probówki do mikrowirówki o pojemności 2 mL z relatywnie płaskim dnem, aby zmaksymalizować powierzchnię kontaktu i oddziaływanie roztworów z kuleczkami podczas inkubacji, obrócić probówkę na bok, aby zwilżyć kuleczki, a następnie wirować je przy 21 000 RCF przez 30 sekund.

Następnie ostrożnie usuń nadsącz za pomocą aspiracji. Upewnij się, że nie poruszyłeś kulek, a następnie przemyj je 100 µL odpowiedniego buforu homogenizacyjnego zawierającego albo 2 mM chlorku wapnia (w przypadku kulek używanych do wyciskania białek wiążących wapniową kalmodulinę), albo 2 mM EDTA, znanego chelatora wapnia (w przypadku kulek używanych do wyciskania białek wiążących apo-kalmodulinę).

Delikatnie opukiwać probówkę, aby resuspender kulki. Zawiesić kulki i wirować przy 1500 RCF przez jedną minutę. Ostrożnie usunąć nadsącz poprzez aspirację, dbając o to, aby nie poruszyć kulek, w celu związania białek z sferami kalmoduliny do immunoprecypitacji.

Zacznij od podzielenia SNAT na dwie równe objętości. W zależności od warunków dla danej aliquoty, dodaj do supernatantu odpowiednią ilość chlorku wapnia lub EDTA do stężenia końcowego 2 mM. Przenieś supernatnat do wypłukanych kulek w odpowiednim buforze homogenizacyjnym.

Delikatnie opukaj probówkę, aby wymieszać zawartość. Inkubuj próbki w temperaturze 4 °C przez trzy godziny na wytrząsarce. Co około 30 minut resuspendujemy kuleczki w celu zwiększenia wydajności wiązania.

Następnie odwiruj próbki przy 1500 RC F przez trzy minuty. Pobierz 50 µL supernatantu jako próbkę nieprzypisanego białka, a pozostałą część supernatantu ostrożnie usuń za pomocą aspiratora i odrzuć. Przemyj kuleczki trzy razy, tak jak poprzednio, stosując 100 µL odpowiedniego buforu do homogenizacji.

Najtrudniejszym etapem tej procedury jest efektywna elucja białek docelowych. Aby zapewnić powodzenie procesu, należy zastosować odpowiedni rodzaj probówki, aby zminimalizować stratę kulek, oraz właściwie resuspender kulki w podgrzanym buforze do elucji. Wcześniejsze podgrzanie buforu do elucji może również znacząco pomóc. Do kulek należy dodać 50 µL buforu do elucji, aby przeprowadzić elucję białka.

Próbki, które zostały zhomogenizowane i związane w buforze zawierającym wapń, rozpuszczono w buforze zawierającym EDTA, natomiast próbki w buforze zawierającym EDTA uzupełniono wapniem. Inkubować kuleczki w temperaturze pokojowej przez 30 minut na wytrząsarce. Mieszać kuleczki, delikatnie opukując probówkę mniej więcej co pięć minut.

Odwiruj kuleczki z prędkością 1500 RCF przez trzy minuty, a następnie ostrożnie usuń aspiracją 50 µL SNAT z próbki białka związanego. Należy uważać, aby nie poruszyć osadu kuleczek. Przeprowadź elektroforezę SDS-PAGE i western blotting, aby zidentyfikować poszukiwane białko jako kontrolę pozytywną w przeciwstawnym wariancie badawczym.

Białko Prop Pro znane jest z wiązania Cal Modlin. Rysunek ten przedstawia przykład testu pull-down Cal Modlin sprawdzającego wiązanie Cal MODLIN przez GFP TAG Neuro Grandin w porównaniu z endogenną neuro Grandin. Homogeniczny wkład wykazuje, że GFP neuro Grandin była ekspresowana dodatkowo do endogennej neuro grandin oraz kinazy zależnej od wapnia i kalmoduliny 2, zgodnie z oczekiwaniami opartymi na znanym wiązaniu endogennej neuro Grandin.

Neurograndina znakowana GFP została wyelutowana w warunkach braku wapnia i nie wiązała się w obecności wapnia. Z kolei kontrolna kinaza dwa zależna od wapnia i kalmoduliny została wyelutowana wyłącznie w obecności wapnia i nie wiązała się w jego nieobecności. Dowodzi to, że kulki z kalmoduliną działały prawidłowo, a jednostki EEU były wydajne.

Co najważniejsze, wykazuje to, że GFP neuro grin wiąże się z Apoch Cal Modlin w sposób podobny do formy endogennej, co sugeruje, że znacznik GFP nie zmienił funkcji białka rekombinowanego. Po opanowaniu tej techniki, nie wliczając w to analizy SDS page i Western blood, procedurę można ukończyć w ciągu sześciu godzin, jeśli jest ona przeprowadzona prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o odpowiednim oznakowaniu wszystkich próbek i probówek dla danej warunku, ponieważ każda zmiana stężenia wapnia może zdyskwalifikować cały eksperyment. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak efektywnie określić zdolność konkretnych białek do wiązania CAL modułu w sposób zależny od wapnia.

Poprzez wyizolowanie białek docelowych, inkubację z odpowiednio przygotowanymi ko-modulantami SRO, elucję związanych białek i ich analizę za pomocą metody Western blot.