Name: Barwienie immunologiczne wypreparowanego serca embrionalnego danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: Naucz się szybkiej metody barwienia immunologicznego wypreparowanych serc embrionalnych Danio rerio. Technika zapewnia lepszą penetrację przeciwciał i wysoką rozdzielczość obrazów w krótszym czasie niż tradycyjne metody.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Beninio Jomok za pomoc w hodowli danio prążkowanych. Praca ta była finansowana przez NIH HL81753.

1. Przygotowanie szkiełek i komory nawilżanej
<ol>
	<li>Komorę nawilżania można wykonać z pudełka, np. z pustego pudełka na końcówki. Zarówno komorę, jak i pokrywę należy owinąć folią aluminiową, aby chronić próbki przed światłem.</li>
	<li>Do wnętrza komory włóż stos mokrych ręczników papierowych w celu utrzymania wilgotności, co zapobiegnie wysychaniu próbek serca. Na wierzchu ręcznika papierowego ustaw małą płytkę mikrotitracyjną, która posłuży jako podstawka dla szkiełek.</li>
	<li>Za pomocą pisaka immEdge narysuj na powierzchni szkiełka mikroskopowego linie lub okręgi, tworząc wgłębienia dla próbek serca o wymiarach około 5x5 mm. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia.</li>
	<li>Umieść szkiełka w komorze nawilżania i dodaj 50ul świeżego 4% formaldehydu do każdego wgłębienia.</li>
</ol>
2. Disekcja embrionalnego serca
<ol>
	<li>Zanurzyć zarodek ryby w wodzie do jaj E3 7 zawierającej 0,4% trikainy na około 1 minutę, aż ryba przestanie wykonywać ruchy ciała, lecz zachowa prawidłowe tętno serca.</li>
	<li>Umieścić wklęsłe szkło przedmiotowe na stole mikroskopu stereoskopowego. Przenieść zarodki do wklęsłego wgłębienia.</li>
	<li>Dostosować oświetlenie mikroskopu stereoskopowego tak, aby serce było wyraźnie widoczne. W zależności od preferencji może to być oświetlenie w ciemnym polu lub polaryzowane światło typu DIC.</li>
	<li>Oczyścić dwie strzykawki insulinowe 75% etanolem, a następnie osuszyć.</li>
	<li>Ustawić mikroskop stereoskopowy na większym powiększeniu i skupić ostrość na sercu. Unieruchomić mechanicznie zarodek, wbijając końcówkę jednej igły w granicę między żółtkiem a somytami w pobliżu głowy. Wbić drugą igłę w pobliżu obszaru serca i szybko je wyciągnąć. Jeśli serce nie zostało całkowicie oddzielone od zarodka, odciąć pozostałą tkankę łączącą serce z żółtkiem.</li>
	<li>Ustawić mikroskop na mniejszym powiększeniu i skupić ostrość na wyizolowanym sercu. Użyć pipety automatycznej 10 µl ustawionej na objętość 1 µl. Przyłożyć końcówkę pipety, aby wessać lub dotknąć próbki serca, tak aby wyizolowane serce znalazło się wewnątrz końcówki lub przywarło do jej powierzchni.</li>
	<li>Zanurzyć końcówkę pipety w 4% roztworze formaldehydu na przygotowanych szkiełkach i nacisnąć tłok pipety, aby uwolnić serce do roztworu. Napięcie powierzchniowe wody również wspomaga uwalnianie serca z końcówki pipety do roztworu. Umieścić mniej niż 3 serca w każdym wgłębieniu.</li>
</ol>
3. Immunobarwienie
<ol>
	<li>Zamknąć komorę i umieścić ją na wytrząsarce z łagodnym ruchem kołyszącym. Utrwalić próbkę serca przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Osuszyć wodę z tyłu szkiełek i umieścić je na stole mikroskopu sekcyjnego w celu wymiany buforu.</li>
	<li>Zanurzyć końcówkę pipety 10μl w pustym obszarze każdej studzienki, utrzymując ją jak najdalej od próbek serca. Należy zachować ostrożność, aby serce nie przywarło do końcówki, ponieważ organy mogą przemieszczać się wraz z przepływem wody podczas pobierania roztworu. W razie potrzeby zmienić położenie końcówki.</li>
	<li>Usunąć roztwór na chusteczkę, unikając powstawania pęcherzyków powietrza w końcówce, ponieważ w ich obecności próbka serca może zostać łatwo utracona. Krótkotrwałe utrzymywanie próbek serca w stanie częściowego wysuszenia może pomóc w ich przyleganiu do szkiełek.</li>
	<li>Dodać 50μl PBST, aby pokryć próbkę serca, i inkubować w nawilżonej komorze przy powolnym ruchu kołyszącym przez 5 min. Powtórzyć płukanie jeszcze raz. Po tym etapie próbki serca można przechowywać w nawilżonej komorze do 1 tygodnia w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Zablokować próbkę serca za pomocą 10% surowicy owczej w PBST przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować próbkę serca z przeciwciałami pierwszorzędowymi, np. w rozcieńczeniu 1:200 dla przeciwciał przeciwko β-catenin oraz 1:200 dla przeciwciał specyficznych przeciwko mef2, w 10% surowicy owczej/PBST przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć próbkę serca buforem PBST trzy razy (po 5 min. każde) w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować próbkę z przeciwciałami wtórnymi, np. w rozcieńczeniu 1:1000 dla przeciwciał antymysich i/lub antykróliczych znakowanych Alexa, w PBST przez 0,5 godziny.</li>
	<li>Przemyć próbki serca buforem PBST trzy razy (po 5 min. każde) w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
4. Obrazowanie
<ol>
	<li>Usunąć PBST i dodać 10 μl medium montażowego do każdej studni. Kołysać komorą przez kilka minut, aż roztwór stanie się klarowny.</li>
	<li>Usunąć większość medium montażowego i przykryć wszystkie studnie na jednym szkiełku przedmiotowym szkiełkiem nakrywkowym (24x50).</li>
	<li>Wykonać obrazowanie serca ryby przy użyciu mikroskopu Zeiss Axioplan 2 wyposażonego w system ApoTome (Carl Zeiss).</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Przykład obrazu ukazującego błony i jądra wszystkich kardiomiocytów danio pręgowanego przedstawiono na Rys. 1. Do barwienia próbek serca wypreparowanych z zarodków danio pręgowanego w 52 hpf zastosowano przeciwciała przeciwko mef2c oraz β-kateninie. Podczas gdy przeciwciało mef2c barwi jądra kardiomiocytów, przeciwciało przeciwko β-kateninie uwidacznia granice poszczególnych komórek 8-10. Poprzez regulację stolika mikroskopu złożonego można ustawić obrazy próbek serca w tej samej orientacji, co umożliwi obserwację krzywizny zewnętrznej i wewnętrznej serca 11. Następnie można zmierzyć całkowitą liczbę kardiomiocytów, wielkość komórek kardiomiocytów oraz ich kolistość.
Kolejny przykład ukazujący strukturę sarkomeryczną serca embrionalnego przedstawiono na Ryc. 2. Przeprowadzono barwienie immunocytochemiczne z użyciem F59, przeciwciała przeciwko miozynie, w przekroju serca embrionalnego. Sieć miofibryli w całym sercu embrionalnym jest wyraźnie widoczna przy niskim powiększeniu, natomiast prążkowany układ grubych filamentów można zaobserwować przy większym powiększeniu (Ryc. 2) 6.
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej pokazujący strukturę komórek z markerami zielonymi i czerwonymi, analiza komórkowa." src="/files/ftp_upload/3510/3510fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Immunobarwienie mef2 (czerwony) i β-catenin (zielony) w celu wykazania jąder i konturów kardiomiocytów w komorze serca rybki zebrafish. Pasek skali = 10μm
<img alt="Obraz z mikroskopii histologicznej przekrojów tkanek A i B, przedstawiający struktury komórkowe i morfologię." src="/files/ftp_upload/3510/3510fig2.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Immunobarwienie miozyny w celu wykazania grubych filamentów w komorze serca ryby zebrafish przy małym powiększeniu (A) lub dużym powiększeniu (B). pasek skali=10μm

<ol><li>Shin, J. T., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Zebrafish+to+human%3A+modular+medical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genomics+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">From Zebrafish to human: modular medical models.</a> Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3, 311-340 (2002).</li>
<li>Beis, D., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cell+biology%3A+following+the+zebrafish+trend%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo cell biology: following the zebrafish trend.</a> Trends. Cell. Biol. 16, 105-112 (2006).</li>
<li>Schoenebeck, J. J., Yelon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+cardiac+development%3A+Advances+in+imaging+add+new+dimensions+to+the+utility+of+zebrafish+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics.</a> Semin. Cell. Dev. Biol. 18, 27-35 (2007).</li>
<li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeted+gene+%27knockdown%27+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li>
<li>Dahme, T., Katus, H. A., Rottbauer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fishing+for+the+genetic+basis+of+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Fishing for the genetic basis of cardiovascular disease.</a> Dis. Model Mech. 2, 18-22 (2009).</li>
<li>Huang, W., Zhang, R., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofibrillogenesis+in+the+developing+zebrafish+heart%3A+A+functional+study+of+tnnt2%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Myofibrillogenesis in the developing zebrafish heart: A functional study of tnnt2.</a> Dev. Biol. 331, 237-249 (2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , (2007).</li>
<li>Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle%3A+the+regulation+of+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Muscle: the regulation of myogenesis.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 4, 745-751 (1994).</li>
<li>Wheelock, M. J., Knudsen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadherins+and+associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Vivo%22%5BJournal%5D)">Cadherins and associated proteins.</a> Vivo. 5, 505-513 (1991).</li>
<li>Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+hypertrophy+involves+both+myocyte+hypertrophy+and+hyperplasia+in+anemic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish.</a> PLoS One. 4, e6596-e6596 (2009).</li>
<li>Auman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+modulation+of+cardiac+form+through+regionally+confined+cell+shape+changes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional modulation of cardiac form through regionally confined cell shape changes.</a> PLoS Biol. 5, e53-e53 (2007).</li>
<li>Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+zebrafish+essential+and+regulatory+myosin+light+chains+reduces+cardiac+function+through+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Depletion of zebrafish essential and regulatory myosin light chains reduces cardiac function through distinct mechanisms.</a> Cardiovasc. Res. 79, 97-108 (2008).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

W porównaniu do klasycznych metod immunobarwienia całych preparatów (whole mount), nasza metoda oferuje następujące zalety. Po pierwsze, dzięki poprawie penetracji można konsekwentnie uzyskiwać znacznie silniejsze sygnały fluorescencyjne. W metodzie immunobarwienia całych preparatów gęsta tkanka skóry otaczająca serce znacznie ograniczała penetrację wielu przeciwciał, co prowadziło do wysokiego poziomu tła w całym organizmie. Problem ten jest szczególnie dotkliwy w przypadku embrionów starszych niż 3 dni od zapłodnienia ...

<table><tbody><tr><td>trikaina</td><td>Research organics</td><td>3007T</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>04018</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa</td><td>BD Biosciences</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko &amp;#946;-kateninie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7207</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko Mef2c</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC313</td><td></td></tr><tr><td>F59</td><td>Zfin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko &amp;alpha;-aktininie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko Ilk</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#3862</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 568 kozie przeciwciało przeciwko królikiemu IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11011</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 kozie przeciwciało przeciwko mysiemu IgG1</td><td>Invitrogen</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe do fluorescencji</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Pisak ImmEdge</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Laminaty pokryte poli-L-lizyną</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63410-01</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe do mikroskopu</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-543-D</td><td></td></tr><tr><td>Wklęsłe szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>7-1305-8</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop sekcyjny</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop złożony</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Axioplan2</td><td></td></tr><tr><td>ApoTome</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">PBST:&lt;br/&gt;1 x PBS&lt;br/&gt;0,5% Triton-X 100</td></tr><tr><td colspan="4">25X Trikaina:&lt;br/&gt;400 mg trikainy&lt;br/&gt;97,9 mL ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt;2,1 mL (1M Tris pH9)&lt;br/&gt;Dostosować pH do 7,0</td></tr></tbody></table>

immunobarwienie wypreparowanego serca embrionalnego ryby danio

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart 

Zarodek danio pręgowanego stał się popularnym modelem kręgowca in vivo do badania rozwoju serca oraz ludzkich chorób serca ze względu na korzystną embriologię i genetykę 1,2. Każdego tygodnia od jednej pary dorosłych ryb można łatwo uzyskać około 100-200 zarodków. Przezroczyste zarodki rozwijające się ex utero sprawiają, że są one idealne do oceny wad serca 3. Ekspresję dowolnego genu można manipulować za pomocą technologii morfolino lub wstrzykiwania RNA 4. Ponadto, badania genetyki forward doprowadziły już do stworzenia listy mutantów, które wpływają na różne aspekty kardiogenezy 5.
Immunobarwienie całego preparatu (whole mount immunostaining) jest ważną techniką w tym modelu zwierzęcym, pozwalającą na ujawnienie wzorca ekspresji docelowego białka w konkretnej tkance 6. Jednakże uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości, które mogłyby ukazać struktury komórkowe lub podkomórkowe, było trudne, głównie ze względu na fizyczne położenie serca oraz słabą penetrację przeciwciał. 
 W niniejszej pracy przedstawiamy metodę rozwiązania tych ograniczeń poprzez wstępne rozcięcie serca, a następnie przeprowadzenie procesu barwienia na powierzchni szkiełka przedmiotowego. Aby zapobiec utracie małych próbek serca i ułatwić manipulację roztworami, próbki serca ograniczono do obszaru koła narysowanego na powierzchni szkiełek przedmiotowych za pomocą pisaka immEdge. Po barwieniu sygnały fluorescencyjne można bezpośrednio obserwować za pomocą mikroskopu złożonego. 
Nasza nowa metoda znacznie poprawia penetrację przeciwciał, ponieważ serce zarodka ryby składa się tylko z kilku warstw komórek. Wysokiej jakości obrazy z nienaruszonych serc można uzyskać w znacznie krótszym czasie przetwarzania dla embrionów zebrafish w wieku od 2. do 6. dnia. Naszą metodę można potencjalnie rozszerzyć na barwienie innych narządów wyizolowanych z zebrafish lub innych małych zwierząt.

Opisano szybką metodę immunobarwienia embrionalnego serca danio pręgowanego. W porównaniu z metodą immunobarwienia całych preparatów, metoda ta znacznie zwiększa penetrację przeciwciał, co pozwala na uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości, ujawniających struktury komórkowe i podkomórkowe w sercu przy znacznie krótszym czasie przetwarzania.

Immunobarwienie wypreparowanego serca embrionalnego ryby danio

Zarodek zebrafisha staje się popularnym kręgowym modelem in vivo do badania rozwoju serca oraz ludzkich chorób serca ze względu na korzystną embriologię...

Ogólnym celem tej procedury jest wykonanie immunostainingu na wypreparowanych sercach embrionów ryb zebrafish, aby z wysoką rozdzielczością uwidocznić struktury komórkowe lub podkomórkowe. Osiąga się to poprzez przygotowanie uprzednio szkiełek w komorze nawilżanej do immunostainingu. Następnie serce zostaje wypreparowane z znieczulonego embrionu zebrafish, po czym przeprowadzany jest immunostaining serca embrionalnego z wykorzystaniem specyficznego przeciwciała.Następnie obrazy serc ryb są dokumentowane za pomocą mikroskopu wyposażonego w dome. Na koniec, dzięki znacznie zwiększonej penetracji, ujawnione zostają struktury komórkowe lub subkomórkowe w embrionalnym sercu zebrafish przy użyciu mikroskopii immunofluorescencyjnej. Główną zaletą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak barwienie immunologiczne całych preparatów, jest możliwość uzyskania wysokiej jakości obrazów standardowego serca zebrafish. Aby przygotować komorę nawilżania i chronić próbki przed światłem, należy użyć folii aluminiowej do owinięcia komory oraz pokrywki pustego pudełka na końcówki.Zapobiegać wysychaniu próbek poprzez umieszczenie stosu mokrych ręczników papierowych na dnie komory, a następnie ustawienie na nich małej mikropłytki, która posłuży jako podstawka dla szkiełek. Za pomocą pisaka do obrazowania nanieść na powierzchnię szkiełka mikroskopowego kółka lub linie o wymiarach około pięciu na pięć milimetrów, tworząc w ten sposób dołki. Pozostawić szkiełka do wyschnięcia.Umieścić preparaty w komorze nawilżającej i dodać 50 µL formaldehydu do każdego otworu. Aby przeprowadzić sekcję serca zarodkowego, znieczulić zarodek ryby w wodzie z jaj E3 zawierającej 0,4% tricażonu, aż ryba przestanie wykonywać wszelkie ruchy ciała, zachowując jednocześnie prawidłową pracę serca. Trwa to około jednej minuty.Przenieś embriony do wgłębienia. Umieść wgłębne szkiełko mikroskopowe na stole mikroskopu sekcyjnego, wykorzystując oświetlenie w ciemnym polu lub polaryzacyjne typu DIC. Dostosuj oświetlenie mikroskopu tak, aby serce było wyraźnie widoczne.Następnie należy oczyścić dwie strzykawki insulinowe 75% etanolem. Po wysuszeniu zwiększyć powiększenie mikroskopu, aby skupić się na sercu. Następnie fizycznie unieruchomić zarodek, wkładając końcówkę jednej igły w żółtko, tak aby krawędź znajdowała się blisko głowy.Następnie wprowadź drugą igłę w pobliżu obszaru serca i szybko wyciągnij serce. Jeśli serce nie zostało całkowicie oddzielone od embrionu, odetnij pozostałą tkankę łączącą serce z żółtkiem. Skup się na sercu przy mniejszym powiększeniu.Używając pipety 10 µL ustawionej na objętość 1 µL, należy przyłożyć końcówkę pipety, aby zassać lub dotknąć próbki serca, tak aby wyizolowane serce znalazło się wewnątrz końcówki lub przylgnęło do jej powierzchni. Następnie należy zanurzyć końcówkę pipety w roztworze formaldehydu na przygotowanych szkiełkach i nacisnąć tłok pipety, aby uwolnić serce do roztworu.Po umieszczeniu serc w formaldehydzie na szkiełkach z wgłębnikami, należy zamknąć komorę i umieścić ją na wytrząsarce, delikatnie kołysząc przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie należy wytrzeć wodę z tyłu szkiełek i umieścić je na stoliku mikroskopu sekcyjnego w celu wymiany buforu. Za pomocą pipety 10 µL należy ostrożnie odessać formaldehyd ze szkiełka, nie naruszając próbek serc. Następnie dodać 50 µL PBST, aby pokryć próbki serc, i inkubować w komorze nawilżanej przez pięć minut.Ponownie przemyj serca w PBST. Następnie zablokuj próbki serca, stosując 10% surowicy owczej w PBST przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Potem inkubuj próbki serca z przeciwciałami pierwszorzędowymi specyficznymi dla beta catenin oraz F w rozcieńczeniu 1:200 w 10% surowicy owczej w PBST przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.Próbki serca płukać trzy razy w PBST przez pięć minut każdorazowo w temperaturze pokojowej. Próbki inkubować przez 30 minut w PBST z przeciwciałami wtórnymi anty-mysimi i/lub anty-króliczymi znakowanymi Alexa tag w rozcieńczeniu 1:1000. Próbki ponownie płukać trzy razy w PBST przed obrazowaniem.Usunąć PBST i dodać jeden mikrolitr medium montażowego do każdej próbki. Delikatnie kołysać komorą przez kilka minut, aż roztwór stanie się przejrzysty. Wykonać obrazowanie serca ryby za pomocą mikroskopu Zeiss Axio Plan 2 wyposażonego w moduł Aome. Na tym obrazie jądra i błony komórkowe kardiomiocytów ryby danio pręgowanej z zarodka w 52. godzinie po zapłodnieniu zostały zidentyfikowane odpowiednio za pomocą przeciwciał przeciwko MEF2C i beta-kateninie.Poprzez regulację stolika mikroskopu złożonego można ustawić obrazy próbek serca w tej samej orientacji, co umożliwia obserwację krzywizny zewnętrznej i wewnętrznej serca. Następnie można zmierzyć całkowitą liczbę kardiomiocytów, wielkość komórek kardiomiocytów oraz ich kolistość. Tutaj przedstawiono strukturę sarkomerową wypreparowanego serca zarodkowego z zastosowaniem przeciwciała przeciwko miozynie F 59. Sieć miofibrylarna w całym komorze serca zarodkowego jest wyraźnie widoczna przy mniejszym powiększeniu, natomiast prążkowane pasma grubych filamentów są widoczne przy większym powiększeniu.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić immunostynowanie wypreparowanego serca dorosłego danio pręgowanego, w szczególności jak wypreparować serce z danio pręgowanego oraz jak obchodzić się z sercem podczas procesu immunostynowania.

immunostaining-of-dissected-zebrafish-embryonic-heart

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Barwienie immunologiczne wypreparowanego serca embrionalnego danio pręgowanego 

Opisano przejrzystą, zestandaryzowaną metodę sekcji i izolacji serca danio pręgowanego na wielu etapach rozwoju. Omówiono również techniki adnotacji i kwantyfikacji.

Sekcja serca w larwalnym, młodzieżowym i dorosłym zebrafish, Danio rerio

Zebrafish stanowią cenny model do badania mechanizmów regeneracji serca u kręgowców. W niniejszym protokole przedstawiamy metodę indukcji zawału serca u dorosłych osobników tego gatunku z wykorzystaniem kriourazu. Metoda ta prowadzi do masowej śmierci komórek w obrębie 20% ściany komory, co przypomina zmiany obserwowane w zawałach u ssaków.

Indukcja zawału mięśnia sercowego u dorosłych rybek danio-osterskich z wykorzystaniem kriourazu

Ten film opisuje technikę izolowania serca od danio pręgowanego na wielu etapach rozwoju w celu zbadania rozwoju, dojrzewania i starzenia się serca.

Sekcja serca: metoda obserwacji rozwoju serca danio pręgowanego

Aby przeanalizować profile ekspresji genów sercowych podczas rozwoju serca danio pręgowanego, należy wyekstrahować całkowite RNA z izolowanych serc. W tym miejscu przedstawiamy protokół pobierania funkcjonalnych/bijących serc poprzez szybką ręczną sekcję z zarodków danio pręgowanego w celu uzyskania mRNA specyficznego dla serca.

Wielkoskalowa sekcja embrionalnego serca danio pręgowanego do analizy transkrypcyjnej

Wykorzystanie danio pręgowanego do badań sercowo-naczyniowych rozszerza się w kierunku badań nad dorosłymi sercami. W przypadku tych zastosowań szybka i prosta izolacja tkanek serca ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia zmian pośmiertnych i uzyskania odpowiedniej liczby próbek. Tutaj opisujemy szybką i powtarzalną metodę preparowania serc dorosłych danio pręgowanego.

Odzyskiwanie serc dorosłych ryb danio pręgowanego do zastosowań o wysokiej przepustowości

Mutacje, które prowadzą do wrodzonych wad serca, korzystają z badań in vivo struktury serca podczas rozwoju, ale badania strukturalne w wysokiej rozdzielczości na embrionalnym sercu myszy są technicznie trudne. W tym miejscu przedstawiamy solidną metodę immunofluorescencji i analizy obrazu w celu oceny struktur specyficznych dla kardiomiocytów w rozwijającym się sercu myszy.

Analiza rozwoju kardiomiocytów za pomocą immunofluorescencji w embrionalnym sercu myszy

Ten protokół demonstruje sekwencyjną immunofluorescencję i immunohistochemię na kriosekcjach z wczesnych stadiów zarodków danio pręgowanego, umożliwiając precyzyjne analizy kolokalizacji w określonych populacjach komórek.

Sekwencyjna immunofluorescencja i immunohistochemia na kriowyciętych zarodkach danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania białek za pośrednictwem przeciwciał fluorescencyjnych w całych preparatach zarodków i larw danio pręgowanego.

Immunohistochemia całego wierzchowca w zarodkach i larwach danio pręgowanego

Ten protokół wykorzystuje test immunofluorescencyjny do wykrywania uszkodzeń DNA wywołanych PM2.5 w wypreparowanych sercach zarodków danio pręgowanego.

Wykorzystanie immunofluorescencji do wykrywania uszkodzeń DNA wywołanych przez PM2,5 w sercach zarodków danio pręgowanego

Opisujemy zoptymalizowane narzędzia do badania serca danio pręgowanego in vivo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą arkusza świetlnego. W szczególności sugerujemy jasne transgeniczne linie serca i prezentujemy nowe techniki delikatnego osadzania i unieruchamiania, które pozwalają uniknąć wad rozwojowych i wad serca. Przewidziano również możliwy potok pozyskiwania i analizy danych dostosowany do obrazowania serca.

Mikroskopia świetlna szybkiej dynamiki serca w zarodkach danio pręgowanego

Badanie to ustanawia czułą metodę obrazowania opartą na immunofluorescencji do ilościowego określenia globalnej metylacji DNA w pojedynczych zarodkach danio pręgowanych. To podejście pokonuje wyzwanie ograniczonej ilości tkanek i pomija konieczność konwersji bisulfytów.

Wykrywanie globalnej metylacji DNA w sercach larw danio pręgowanych

Naucz się szybkiej metody barwienia immunologicznego wypreparowanych serc embrionalnych Danio rerio. Technika zapewnia lepszą penetrację przeciwciał i wysoką rozdzielczość obrazów w krótszym czasie niż tradycyjne metody.

Immunobarwienie wypreparowanego serca embrionalnego ryby danio

Przeglądaj więcej filmów