Śledzenie sygnalizacji niedotlenienia w zamkniętych agregatach komórkowych
December 16th, 2011
Opisano metodę fotoenkapsulacji komórek w usieciowanym hydrożelu PEG. Sygnalizacja niedotlenienia w zamkniętych w kapsułkach sim skupiskach insulinoma (MIN6) jest śledzona za pomocą systemu markerów fluorescencyjnych. System ten umożliwia seryjne badanie komórek w rusztowaniu hydrożelowym i korelację sygnalizacji hipoksyjnej ze zmianami fenotypu komórki.
Ogólnym celem tej procedury jest monitorowanie odpowiedzi komórkowej na niedotlenienie w agregatach komórkowych zamkniętych w PEG. W pierwszym etapie rozproszone komórki są zakażane wirusem markerowym, a następnie hodowane na wytrząsarce, aby umożliwić tworzenie agregatów. Następnie kołek liniowy jest funkcjonalizowany, a rimer PEG DM jest oczyszczany.
Następnie agregaty komórkowe są zamykane w hydrożelu PEG DM. Na koniec hydrożele są hodowane w różnych warunkach tlenowych, podczas gdy są monitorowane fluorescencyjnie pod kątem sygnału markera hipoksji. Ostatecznie lokalizację i zakres aktywności czynnika indukowanego hipoksją w żywotnych zamkniętych w kapsułkach agregatach komórek można uwidocznić za pomocą prostej mikroskopii fluorescencyjnej.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące enkapsulacji komórek i dostarczania terapeutycznego opartego na komórkach, takie jak: Gdzie występuje niedotlenienie w hodowlach 3D i jak wpływa na przeżycie i funkcjonowanie komórek? Implikacje tej techniki rozciągają się na podejścia medycyny regeneracyjnej i terapię niedoborów hormonalnych, takich jak cukrzyca stypendialna, ze względu na duży wpływ niedotlenienia w zagregowanych i zamkniętych tkankach. Wykazano, że aktywność czynnika pierwszego indukowanego hipoksją koreluje ze znacznie zmniejszonym wydzielaniem insuliny z komórek beta, motywując próby dysocjacji oczek pierwotnych i przekształcenia ich w oczko rzekome.
Agregaty o zmniejszonej średnicy. Nasz marker może wskazywać na aktywność czynnika indukowanego hipoksją za pomocą agregatów na poziomie komórkowym w dowolnym poluzowanym materiale otaczającym. PEG został wybrany jako materiał na kapsułki ze względu na jego korzystne właściwości przenoszenia, kompatybilność z cyto i łatwość, z jaką można go funkcjonalnie modyfikować.
Po zważeniu dwóch gramów PEG w 40-mililitrowej szklanej fiolce o zawartości około 308 mikrolitrów metamfetaminy, akrylu, bezwodnika i luźno zamknij fiolkę twardą plastikową nakrętką. Podgrzewaj fiolkę na wysokich obrotach w kuchence mikrofalowej przez dwie minuty w standardowej domowej kuchence mikrofalowej. Następnie, w rękawicach żaroodpornych, dokładnie zmieszaj fiolkę i podgrzewaj roztwór w kuchence mikrofalowej na wysokich obrotach przez dodatkowe pięć minut.
Na krótko odczekać, aż fiolka ostygnie na tyle, aby można było ją dotknąć, a następnie odkręcić korek, obracając fiolkę. Powoli mieszać z chlorkiem metylenu, wirując próbkę w razie potrzeby, aż roztwór stanie się klarowny i jednorodny. Następnie dodaj roztwór kroplami do 200 mililitrów zmieszanego zimnego eteru dathyl, aby wytrącić PEG dm.
Następnie zbierz PEG DM przez filtrację próżniową i pozostaw do wyschnięcia. Po wyschnięciu PEG DM rozpuść go w około 100 do 150 mililitrach wody dejonizowanej. Następnie dializuj roztwór z wodą dejonizowaną przez pięć dni w rurkach dializacyjnych z odciętą masą cząsteczkową 1000 daltonów po dializie.
Elokwentny roztwór przelej do odpowiednich pojemników i zamroź je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez noc. Następnie liofilizuj roztwór przez cztery dni, aby wytworzyć oczyszczony biały proszek PEG DM w celu uwolnienia komórek z powierzchni kolby hodowlanej poddanej działaniu substancji. Najpierw odessać pożywkę, przepłukać komórki 37 stopniami CELs HBSS bez wapnia, magnezu i odessać HBSS.
Teraz dodaj dwa mililitry 37 stopni Celsjusza i roztwór EDTA i pozwól komórkom inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Następnie mocno uderz w bok kolby, aby uwolnić komórki w temperaturze ośmiu mililitrów 37 stopni Celsjusza, pożywką do kolby i energicznie pipetować zawiesinę komórek w górę iw dół. Uważając, aby nie wprowadzać bąbelków.
Po przeniesieniu roztworu komórkowego do sterylnej 15-mililitrowej probówki wirówkowej, policz komórki za pomocą hemocytometru, aby określić całkowitą liczbę komórek, które mają zostać zainfekowane. Dodaj niezbędną objętość zawiesiny komórek, aby uzyskać 400 000 komórek na studzienkę, do studzienek sześciodołkowej płytki hodowlanej zawiesiny, podwielokrotność 50 mikrolitrów HBSS na studzienkę komórek, które mają być zakażone, do 1,8 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Następnie ostrożnie odpipetować odpowiednią ilość zawiesiny wirusa do przygotowanego HBSS.
Teraz dodaj odpowiednią objętość rozcieńczonego wirusa do każdej studzienki, aby osiągnąć pożądany MOI, a następnie dodaj pożywkę do każdej studzienki, aby uzyskać całkowitą objętość do 1,7 mililitra. Na koniec umieść płytkę na wytrząsarce orbitalnej Wewnątrz inkubatora ustaw wytrząsarkę na niskie ustawienie około 100 obr./min, aby pożywka delikatnie przemyła się wokół studzienki i pozwoliła komórkom agregować się przez 24 do 36 godzin. Zacznij od odcięcia stożkowej końcówki plastikowej strzykawki o pojemności jednego mililitra i umieszczenia jej otwartej, a następnie umieszczonej w stojaku, aby utworzyć naczynie, w którym powstanie hydrożel.
Następnie odpipetować 20 mikrolitrów fotoaktywnego roztworu PEG DM do otwartego końca strzykawki na tłok, upewniając się, że objętość pokrywa całą powierzchnię tłoka. Regulować tłok małymi krokami, aby uzyskać płaską powierzchnię płynu. Teraz umieść pipetę z powrotem w stojaku i umieść stojak pod lampą UV na około osiem minut, aby umożliwić sieciowanie hydrożelu.
W tym czasie objętość pipety zawierającej żądaną liczbę komórek i agreguje się w mikroprobówce wirówkowej o pojemności 1,8 mililitra. Zakryj probówkę, a następnie odwiruj komórki i agregaty przez pięć minut w temperaturze 130 g. Następnie za pomocą mikropipetera ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając osadu komórkowego na końcu probówki.
Gdy głowica pożywki zbliża się do granulki, użyj drobniejszej końcówki do pipety o pojemności 10 mikrolitrów, równomiernie rozpraszając agregaty komórek w roztworze prekursora żelu, upewniając się, że są one w pełni zamknięte. To najtrudniejsza część tej procedury. Wykonując ten krok, należy uważać, aby ponownie przeszlifować i delikatnie przenieść pellet.
Teraz delikatnie ponownie zawieś osad komórkowy w 20 mikrolitrach fotoaktywnego roztworu PEG DM. Używając końcówki pipety z szerokim otworem i dodaj zawiesinę komórek do strzykawki na wierzchu usieciowanej części hydrożelu, wystaw strzykawkę na działanie dodatkowych ośmiu minut światła UV, aby zakończyć budowę hydrożelu. Po zakończeniu ogniwa powinny być całkowicie zamknięte w cylindrycznym hydrożelu.
Na koniec dodaj jeden mililitr HBSS do jednego dołka 24-dołkowej płytki i jeden mililitr pożywki do drugiego. Następnie wysuń hydrożel ze strzykawki do HBSS, aby krótko umyć żel. Przenieś żel na pożywkę i posaz płytkę w pożądanych warunkach.
W dowolnym momencie hodowli komórki można obrazować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby śledzić inicjację miejsca sygnalizacji hipoksyjnej, płytki 24-dołkowej na stolik mikroskopu, centrując studzienkę z hydrożelem pod obiektywem. Sygnał jest wystarczająco specyficzny, aby zidentyfikować poszczególne komórki sygnalizacyjne, ale rozdzielczość może być niewystarczająca do określenia lokalizacji sygnału wewnątrzkomórkowego. W komórkach sygnalizacyjnych sygnał jest zwykle obserwowany równomiernie w całej cytoplazmie.
Rysunek ten przedstawia reprezentatywny przykład agregatów minx zamkniętych w hydrożelu PEG w komórce żelowej. Agregaty powinny być całkowicie zamknięte w matrycy i równomiernie rozłożone, aby umożliwić lepszy transport składników odżywczych, jak pokazano tutaj. Zwróć uwagę, jak żel sieciujący jest stały przez cały czas, przyjmując kształt naczynia, w którym przeprowadzono reakcję.
Na tym rysunku pokazano reprezentatywną sygnalizację hipoksji fluorescencyjnej w zagregowanych min sześciu komórkach w hydrożelu PEG DM, które zostały zamknięte, a następnie umieszczone w inkubacji w 20% tlenu przez 44 godziny. Na zdjęciu po lewej stronie nie wykazują sygnalizacji niedotlenienia, podczas gdy komórki, które zostały zamknięte, a następnie inkubowane w 2% tlenu przez 44 godziny. Jak pokazano na prawym wyświetlaczu, wyraźne wszechobecne niedotlenienie sygnału można również śledzić w innych typach komórek.
Rysunek ten przedstawia reprezentatywną sygnalizację hipoksyjną w zamkniętych mezenchymalnych agregatach komórek macierzystych. Jak widać na skrajnym lewym rysunku, sygnał fluorescencyjny nie jest wykrywalny po 12 godzinach w 2% tlenu, to, jak widać na środkowym rysunku, jest bardziej widoczny po 24 godzinach i 2% tlenu. I wreszcie, jak widać po prawej stronie, jest wysoce wyrażony po 96 godzinach i 2% tlenu Po tej procedurze.
Inne metody, takie jak Eliza, analiza wydzielanych białek i testy żywotności komórek, mogą być wykonywane w celu skorelowania sygnalizacji hipoksyjnej z fenotypem komórki. Dzięki temu rozwojowi technika ta może utorować drogę naukowcom zajmującym się inżynierią tkankową i dostarczaniem terapii opartej na komórkach w celu zbadania funkcji przetrwania i różnicowania komórek w rusztowaniach i materiałach obudowujących.
Przegląd
Ten artykuł opisuje metodę fotoenkapsulacji komórek w żelu PEG, umożliwiającą śledzenie sygnalizacji hipoksycznej w uopakowanych agregatach insulinoma mysiego. Technika ta pozwala na seryjne badanie komórek wewnątrz szkieletu żelu hydrożelowego i koreluję sygnalizację hipoksyczną ze zmianami fenotypu komórki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Enkapsulacja komórek
- Sygnalizacja hipoksyczna
- Medycyna regeneracyjna
Tło
- Hipoksja wpływa na przeżywalność i funkcję komórek w kulturach 3D.
- PEG jest wybierany ze względu na korzystne właściwości transferowe i cytokompatybilność.
- Rozumienie hipoksji jest kluczowe dla terapii ukierunkowanych na niedobory hormonalne.
- Aktywność czynnika indukowanego hipoksją koreluję z sekrecją insuliny przez komórki beta.
Cel badania
- Monitorowanie reakcji komórkowych na hipoksję w agregatach uopakowanych w PEG.
- Wizualizacja aktywności czynnika indukowanego hipoksją wewnątrz żywych agregatów komórkowych.
- Zbadanie implikacji dla terapii opartych na komórkach.
Zastosowane metody
- Infekcja rozproszonych komórek wirusem markera fluorescencyjnego.
- Hodowla komórek w celu utworzenia agregatów na shakerze.
- Funkcjonalizacja i oczyszczanie liniowego PEG.
- Uopakowywanie agregatów komórek w żelu PEG DM.
Główne wyniki
- Skuteczna enkapsulacja komórek w żelu.
- Fluorescencyjne monitorowanie sygnału markera hipoksji w różnych warunkach tlenowych.
- Wizualizacja aktywności czynnika indukowanego hipoksją na poziomie komórkowym.
- Wgląd w wpływ hipoksji na przeżywalność i funkcję komórek.
Wnioski
- Metoda zapewnia cenną metodę badań nad hipoksją w kulturach 3D.
- Ma potencjalne zastosowania w medycynie regeneracyjnej i terapii cukrzycy.
- Dalsze badania mogą poprawić zrozumienie terapii opartych na komórkach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Monitoring hypoxic signaling in encapsulated cell aggregates addresses a critical challenge in cell-based therapies: ensuring functional viability of transplanted tissues under diffusion-limited conditions. This method enables early detection of oxygen deprivation impacts on insulin-producing cells, supporting predictive confidence in therapeutic efficacy. By correlating HIF-1α activity with functional readouts, it aids in de-risking encapsulation strategies for diabetes and regenerative medicine applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking hypoxia-inducible factor activation to functional decline in insulin secretion.
- Operational Value: Provides a quantifiable fluorescent readout for pathway clarification in encapsulated beta-cell models.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by identifying oxygen thresholds that compromise cell function prior to in vivo testing.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized hydrogels with encapsulated aggregates for reproducible oxygen-gradient screening.
- Quantitative Output: Enables spatial and temporal mapping of hypoxic signaling via fluorescence microscopy.
- Platform Utility: Facilitates assay standardization across oxygen conditions to evaluate encapsulation material performance.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models the avascular microenvironment encountered by encapsulated pancreatic islets in type 1 diabetes therapy.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase hypoxia assessment to preclinical validation of graft survival and function.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs material selection and geometric design to mitigate hypoxia-induced functional loss in therapeutic candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling hypoxia assessment after aggregate formation and prior to functional screening, supporting lead identification of encapsulation formulations.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on oxygen-dependent pathways in encapsulated beta-cell aggregates.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible hydrogels for evaluating compound or material effects under controlled hypoxia.
- Analytics: Provides HIF-1α-driven fluorescence as a quantitative biomarker for comparing oxygen conditions and encapsulation efficacy.
- Translational Research: Connects in vitro hypoxia signaling to preclinical outcomes by correlating marker activity with insulin secretion data.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular platform for evaluating encapsulation materials across cell types and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by reducing ambiguity in hypoxia-mediated functional decline.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined encapsulation and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying hypoxia-related risks early in development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of encapsulation strategies based on functional preservation under low oxygen.
Implementation Considerations
- Requires expertise in virology, cell culture, and hydrogel fabrication.
- Depends on UV crosslinking infrastructure and fluorescent microscopy capabilities.
- Necessitates standardization of oxygen-controlled culture systems for cross-team comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the hypoxia reporter to primary or stem cell-derived aggregates.
- Practical limitations include signal resolution constraints for subcellular localization and dependency on viral transduction efficiency.
