Name: Śledzenie sygnalizacji niedotlenienia w zamkniętych agregatach komórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Poznaj metodę śledzenia sygnalizacji niedotlenienia w zamkniętych agregatach komórkowych mysich insulinomów przy użyciu fluorescencyjnych markerów w hydrogelu PEG. Technika ta umożliwia badanie odpowiedzi komórkowej na hipoksję w kulturach 3D.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Podziękowania dla laboratorium Kristi Anseth z University of Colorado, Boulder za hojne przekazanie komórek MIN6. Finansowanie tego projektu zostało zapewnione przez NSF.

1. Synteza PEGDM oraz przygotowanie fotoaktywnego roztworu makromeru PEGDM
<ol>
	<li>Odważ 2g PEG (liniowy, 10 000Da) do szklanej fiolki o pojemności 40mL z twardą plastikową zakrętką.</li>
	<li>Dodaj około 308μL bezwodnika metakrylowego i lekko zakręć fiolkę.</li>
	<li>Podgrzewaj fiolkę w standardowej kuchence mikrofalowej na wysokiej mocy przez 2 minuty. Mając na dłoniach rękawice odporne na wysoką temperaturę, dokładnie wymieszaj zawartość fiolki za pomocą wortexa, a następnie podgrzewaj na wysokiej mocy przez kolejne 5 minut.</li>
	<li>Odczekaj chwilę, aż fiolka ostygnie na tyle, aby można było ją bezpiecznie trzymać w rękawicach. Odkręć zakrętkę i powoli dodawaj chlorek metylenu, delikatnie obracając fiolkę. Dodaj taką ilość, aby roztwór stał się przejrzysty i jednorodny, w razie potrzeby mieszając próbkę na wortexie. Całkowita objętość użytego chlorku metylenu powinna wynosić 1,5 - 2 mL.</li>
	<li>Wytrąć PEGDM w 200 mL zimnego, mieszanego eteru dietylowego, dodając roztwór kroplami.</li>
	<li>Zbierz PEGDM za pomocą filtracji próżniowej i pozostaw do wyschnięcia.</li>
	<li>Rozpuść PEGDM w odpowiedniej ilości wody dejonizowanej (zazwyczaj 100 -150 mL).</li>
	<li>Dializuj roztwór przeciwko wodzie dejonizowanej przez 5 dni w tubach dializacyjnych o progu odcięcia masy cząsteczkowej 1 000 Da. Wymieniaj wodę raz dziennie.</li>
	<li>Rozdziel roztwór do odpowiednich pojemników i zamroź w temperaturze -80°C przez noc. Liofilizuj roztwór przez 4 dni, aby otrzymać oczyszczony biały proszek PEGDM. Przechowuj proszek w temperaturze 4°C, gdy nie jest używany.</li>
	<li>Aby przygotować fotoaktywny roztwór PEGDM, przygotuj najpierw 0,5% wagowo roztwór zapasowy fotoinicjatora, rozpuszczając Irgacure 2959 w wodzie dejonizowanej. Wymieszaj roztwór na wortexie i przechowuj w ciemności.</li>
	<li>Przygotuj roztwór 10% wagowo PEGDM i 0,025% wagowo Irgacure 2959 w zrównoważonym roztworze soli Hanksa (HBSS). Wymieszaj dokładnie na wortexie, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie PEGDM. Zazwyczaj przygotowujemy 1mL tego roztworu jednorazowo.</li>
	<li>Zesterylizuj roztwór, filtrując go przez filtr strzykawkowy 0,2 μm do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,8 mL. Owiń probówkę folią aluminiową i przechowuj w temperaturze 4°C.</li>
</ol>
2. Hodowla, zakażanie i agregacja komórek MIN6
<ol>
	<li>Komórki MIN6 hoduje się w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej o 10% FBS, 7mM glukozy, 100 jednostek/mL penicyliny/streptomycyny oraz 0,5 μg/mL amfoterycyny B w warunkach zwiększonej wilgotności w temperaturze 37°C i 5% CO2.</li>
	<li>Aby uwolnić komórki z powierzchni podłoża w kolbie hodowlanej, odessaj pożywkę, przemyj komórki roztworem HBSS bez wapnia i magnezu o temperaturze 37°C, odessaj HBSS, a następnie dodaj 2 mL roztworu trypsyny-EDTA o temperaturze 37°C i inkubuj komórki przez 3 minuty.</li>
	<li> energicznie uderz w bok kolby, aby odczepić komórki, a następnie dodaj 8 mL pożywki o temperaturze 37°C i intensywnie pipetuj zawiesinę komórkową w górę i w dół, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Przenieś komórki pipetą do sterylnej probówki do wirowania o pojemności 15 mL i wykonaj zliczenie komórek za pomocą hemocytometru lub innej procedury zliczania komórek.</li>
	<li>Przygotowując się do zakażenia komórek wirusem markerowym, najpierw określ całkowitą liczbę komórek do zakażenia i oblicz objętość zawiesiny wirusa niezbędną do uzyskania pożądanej wielokrotności zakażenia (MOI) (od 50 do 100 cząstek zakaźnych na komórkę).</li>
	<li>Rozcieńcz wirusa w HBSS, ostrożnie pipetując odpowiednią ilość zawiesiny wirusa do wcześniej odmierzonej objętości HBSS w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,8 mL. Odpowiednia ilość to 50 μL HBSS na dołek z agregującymi komórkami.</li>
	<li>Rozprosz komórki, pipetując je w górę i w dół w probówce, a następnie przenieś wymaganą objętość, aby uzyskać 400 000 komórek na dołek, do dołków 6-dołkowej płytki do hodowli w zawiesinie.</li>
	<li>Dodaj do każdego dołka odpowiednią objętość rozcieńczonego wirusa, aby uzyskać pożądane MOI.</li>
	<li>Dodaj pożywkę do każdego dołka, aby zwiększyć objętość całkowitą do 1,7 mL.</li>
	<li>Umieść płytkę na wytrząsarce orbitalnej wewnątrz inkubatora. Ustaw wytrząsarkę na niskie obroty, tak aby pożywka delikatnie opływała dołki (˜100 rpm). Pozostaw komórki do agregacji na 24-36 godzin. Powinny utworzyć się agregaty o przybliżonej średnicy 75-175 μm.</li>
</ol>
3. Enkapsulacja komórek w PEGDM
<ol>
	<li>Komórki mogą być enkapsulowane w formie dyspersji (krok 2.4) lub po agregacji (krok 2.10). Ponieważ roztwór prekursora hydrożelu PEGDM jest cieczą, komórki mogą mieć tendencję do osadzania się przed sieciowaniem i formowaniem hydrożelu. Jeśli oczekuje się szybkiego osadzania, na przykład w przypadku większych agregatów, korzystne może być wytworzenie hydrożelu w dwóch etapach, aby komórki osadziły się w centralnej płaszczyźnie żelu. Procedura jednoetapowej syntezy hydrożelu odpowiednia dla komórek w dyspersji została przedstawiona na (Rysunku 2), a procedura dwuetapowa została pokazana na (Rysunku 3) i szczegółowo opisana poniżej (3.2-3.9).</li>
	<li>Przygotuj naczynie, w którym zostanie uformowany hydrożel, odcinając zwężoną końcówkę plastikowej strzykawki 1 mL i umieszczając ją otwartym końcem do góry w statywie.</li>
	<li>Pipetuj 20 μL fotoaktywnego roztworu PEGDM do otwartego końca strzykawki, na tłok, upewniając się, że objętość pokrywa całą powierzchnię tłoka. Reguluj położenie tłoka w niewielkich przyrostach, aby uzyskać płaską powierzchnię cieczy.</li>
	<li>Umieść pipetę w statywie i ustaw statyw pod lampą UV (365nm, ˜7 mW/cm2) na około 8 minut, aby umożliwić sieciowanie hydrożelu. W tym czasie można rozpocząć przygotowanie komórek.</li>
	<li>Pipetuj objętość zawierającą pożądaną liczbę komórek/agregatów do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,8 mL, zakręć i wiruj probówkę przy 130 g przez 5 minut.</li>
	<li>Za pomocą mikropipety ostrożnie usuń medium, nie naruszając pelletu komórkowego na dnie probówki. Gdy poziom medium zbliży się do pelletu, pomocne może być użycie cieńszego końcówki do pipety 10 μL.</li>
	<li>Łagodnie resuspenduj pellet komórkowy w 20 μL fotoaktywnego roztworu PEGDM (w przypadku pracy z agregatami użyj końcówki do pipety o szerokim wylocie) i dodaj zawiesinę komórkową do strzykawki, na wierzch wcześniej usieciowanej części hydrożelu.</li>
	<li>Naświetlaj strzykawkę dodatkowymi 8 minutami światła UV, aby dokończyć formowanie hydrożelu. Po zakończeniu komórki powinny być w pełni zamknięte w cylindrycznym hydrożelu (Rysunek 3).</li>
	<li>Wysuń hydrożel ze strzykawki do 1 mL HBSS w studzience płytki 24-dołkowej, aby krótko wypłukać żel. Przenieś żel do 1 mL medium w studzience płytki 24-dołkowej i inkubuj w pożądanych warunkach.</li>
</ol>
4. Monitorowanie hipoksji
<ol>
	<li>Na dowolnym etapie hodowli obrazuj komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby śledzić rozpoczęcie sygnalizacji hipoksycznej. W zależności od tego, co jest obrazowane, można to robić bezpośrednio w płytce wielodołkowej lub przenieść żel na szkiełko przedmiotowe przed umieszczeniem go na stoliku mikroskopu. Maksymalne wzbudzenie Ds Red osiąga się przy 556nm, a maksymalna emisja występuje przy 586nm. Emisja jest dość intensywna, w związku z czym nie zaobserwowano problemów z fotoblakaniem. Czas opóźnienia między rozpoczęciem produkcji białka a pierwszą detekcją sygnału wynosi około 12 godzin. Sygnał jest na tyle specyficzny, że pozwala na identyfikację poszczególnych komórek sygnalizujących, jednak rozdzielczość może być niewystarczająca do określenia wewnątrzkomórkowej lokalizacji sygnału. W komórkach sygnalizujących sygnał jest zazwyczaj obserwowany równomiernie w całej cytoplazmie. Intensywność sygnału może również wzrastać przy przedłużonej ekspozycji na hipoksję, choć nie ustaliliśmy jeszcze w pełni, czy wynika to ze zwiększonej ekspresji białka, ogólnej akumulacji białka czy opóźnionego dojrzewania białka.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Reprezentatywny przykład agregatów MIN6 zamkniętych w hydrożelu PEG przedstawiono na Rysunku 4. Usieciowany żel będzie jednorodnie stały, przyjmując kształt naczynia, w którym przeprowadzono reakcję. W celu ułatwienia zapobiegania reakcji na ciało obce, do implantacji preferowany jest żel o gładkich powierzchniach zewnętrznych. Wewnątrz żelu agregaty komórkowe powinny być w pełni zamknięte w macierzy i rozmieszczone homogenicznie, aby umożliwić lepszy transport składników odżywczych.
Reprezentatywne obrazy sygnalizacji hipoksycznej w agregatach MIN6 przedstawiono na Rysunku 5. Identyczne agregaty MIN6 zainfekowane wirusem markerowym hodowano w atmosferze 20% O2 (5a) lub 1% O2 (5b) przez 44 godziny przed wykonaniem obrazowania.
<img alt="Diagram regulacji transkrypcji HIF-1, wiązanie trimeru HRE, ekspresja DsRED, edycja genów." src="/files/ftp_upload/3521/3521fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat działania naszego systemu markerów hipoksji. Adenowirusowa insercja genu Ds Red DR oraz położonego powyżej promotora HRE umożliwia indukowaną hipoksją produkcję białka fluorescencyjnego pod kontrolą HIF-1.
<img alt="Schemat równowagi statycznej; układ wirowania do rozdzielania próbki na warstwowe składniki." src="/files/ftp_upload/3521/3521fig2.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Schemat procedury jednotapowej enkapsulacji zdyspergowanych komórek MIN6 w sieciowanym hydrożelu PEGDM. W przypadku każdego żelu zdyspergowane komórki zawiesza się w 40μL fotoaktywnego roztworu makromeru PEGDM. Roztwór ten umieszcza się w odciętej strzykawce o pojemności 1mL, a hydrożel formuje się pod wpływem światła UV o długości fali 365nm przez 10-12 minut. Po zakończeniu procesu dysk hydrożelowy wyjmuje się ze strzykawki, przemywa i umieszcza w wypełnionej pożywką płytce wielodołkowej w celu inkubacji.
<img alt="Schemat procesu wirowania w celu rozdzielenia próbki, przedstawiający ustawienie probówek i szczegóły pomiarowe." src="/files/ftp_upload/3521/3521fig3.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Schemat procedury dwuetapowej enkapsulacji agregatów komórek MIN6 w sieciowanym hydrożelu PEGDM. W przypadku każdego żelu, najpierw tworzona jest połowa żelu poprzez sieciowanie UV 20μL fotoaktywnego roztworu makromeru PEGDM przez 8 minut. Agregaty MIN6 są ostrożnie zawieszone w dodatkowych 20μL fotoaktywnego roztworu makromeru, który nanosi się na wcześniej uformowaną połowę żelu. Pełny żel powstaje po kolejnych 8 minutach ekspozycji na promieniowanie UV, w wyniku czego agregaty zostają w pełni zamknięte w płaszczyźnie środkowej żelu.
<img alt="Wzrost kolonii bakteryjnych pod mikroskopem; szalka Petriego; eksperyment mikrobiologiczny; analiza hodowli komórkowej." src="/files/ftp_upload/3521/3521fig4.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Obraz 40μL hydrożelu przy 20-krotnym powiększeniu. Wewnątrz żelu wyraźnie widoczne są agregaty MIN6 (~400,000 komórek łącznie). Średnica hydrożelu wynosi około 6mm (pasek = 1mm).
<img alt="Test żywotności komórek, barwienie żywe/martwe; obraz z mikroskopii fluorescencyjnej; ocena stanu zdrowia komórek." src="/files/ftp_upload/3521/3521fig5.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Fluorescencyjne sygnalizowanie hipoksji w zagregowanych komórkach MIN6 w hydrożelu PEGDM. Komórki, które zostały enkapsulowane, a następnie inkubowane przy 20% O2 przez 44 godziny, nie wykazują sygnalizowania hipoksji (a), natomiast komórki enkapsulowane, a następnie inkubowane przy 2% O2 przez 44 godziny, wykazują wyraźny, powszechny sygnał (pasek skali = 100μm) (b).

<ol><li>Kelly, W., Lillehei, R., Merkel, F., Idezuki, Y., Goetz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allotransplantation+of+the+pancreas+and+duodenum+along+with+the+kidney+in+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Allotransplantation of the pancreas and duodenum along with the kidney in diabetic nephropathy.</a> Surgery. 61, 827-837 (1967).</li>
<li>Shapiro, J. A. M., Ricordi, C., Hering, B. J., Auchincloss, H., Lindblad, R., Robertson, R. P., Secchi, A., Brendel, M. D., Berney, T., Brennan, D. C., Cagliero, E., Alejandro, R., Ryan, E. A., DiMercurio, B., Morel, P., Polonsky, K. S., Reems, J., Bretzel, R. G., Bertuzzi, F., Froud, T., Kandaswamy, R., Sutherland, D. E. R., Eisenbarth, G., Segal, M., Preiksaitis, J., Korbutt, G. S., Barton, F. B., Viviano, L., Seyfert-Margolis, V., Bluestone, J., Lakey, J. R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+trial+of+the+Edmonton+Protocol+for+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Eng.+J.+Med.%22%5BJournal%5D)">International trial of the Edmonton Protocol for islet transplantation.</a> N. Eng. J. Med.. 355, 1318-1330 (2006).</li>
<li>Sun, A. M., O'Shea, G. M., Goosen, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+microencapsulated+islet+cells+as+a+bioartificial+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Appli.+Biochem.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Injectable microencapsulated islet cells as a bioartificial pancreas.</a> Appli. Biochem. Biotechnol. 10, 87-99 (1984).</li>
<li>Iwata, H., Amemiva, H., Matsuda, T., Takano, H., Hayashi, R., Akutsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+microencapsulated+islets+in+agarose+gel+as+bioartificial+pancreas+by+studies+of+hormone+secretion+in+culture+and+by+xenotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Evaluation of microencapsulated islets in agarose gel as bioartificial pancreas by studies of hormone secretion in culture and by xenotransplantation.</a> Diabetes. 39, 224-225 (1989).</li>
<li>Zhang, W. J., Laue, C., Hyder, A., Schrezenmeir, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purity+of+alginate+affects+the+viability+and+fibrotic+overgrowth+of+encapsulated+porcine+iselt+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Purity of alginate affects the viability and fibrotic overgrowth of encapsulated porcine iselt xenografts.</a> Transplant Proc. 33, 3517-3519 (2001).</li>
<li>Lin-Gibson, S., Bencherif, S., Cooper, J. A., Wetzel, S. J., Antonucci, J. M., Vogel, B. M., Horkay, F., Washburn, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+PEG+dimethacrylates+and+their+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of PEG dimethacrylates and their hydrogels.</a> Biomacromolecules. 5, 1280-1287 (2004).</li>
<li>Weber, L. M., He, J., Bradley, B., Haskins, K., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG-based+hydrogels+as+an+in+vitro+encapsulation+platform+for+testing+controlled+%CE%B2-cell+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Biomater%22%5BJournal%5D)">PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled β-cell microenvironments.</a> Acta. Biomater. 2, 1-8 (2006).</li>
<li>Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+PEG+hydrogel+crosslinking+density+on+protein+diffusion+and+encapsulated+islet+survival+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 90, 720-729 (2009).</li>
<li>Bryant, S. J., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+properties+influence+ECM+production+by+chondrocyte+photoencapsulated+in+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">Hydrogel properties influence ECM production by chondrocyte photoencapsulated in poly(ethylene glycol) hydrogels.</a> J. Biomed. Mater. Res. 59, 63-72 (2001).</li>
<li>Bryant, S. J., Nuttelman, C. R., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytocompatibility+of+UV+and+visible+light+photoinitiating+systems+on+cultured+NIH%2F3T3+fibroblasts+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomater.+Sci.+Polymer+Edn%22%5BJournal%5D)">Cytocompatibility of UV and visible light photoinitiating systems on cultured NIH/3T3 fibroblasts in vitro.</a> J. Biomater. Sci. Polymer Edn. 11, 439-457 (2000).</li>
<li>Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+oxygen+on+isolated+pancreatic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Trans.+Am.+Soc.+Artif.+Intern.+Organs%22%5BJournal%5D)">Effect of oxygen on isolated pancreatic tissue.</a> Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs. 35, 739-741 (1989).</li>
<li>Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+hypoxia+on+insulin+secretion+by+isolated+rat+and+canine+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Effect of hypoxia on insulin secretion by isolated rat and canine islets of Langerhans.</a> Diabetes. 42, 12-21 (1993).</li>
<li>De Groot, M., Schuurs, T. A., Keizer, P. P. M., Fekken, S., Leuvenink, H. G. D., van Schilfgaarde, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+encapsulated+rat+pancreatic+islets+to+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Response of encapsulated rat pancreatic islets to hypoxia.</a> Cell Transplant. 12, 867-875 (2003).</li>
<li>Fancy, M. L., Topiwala, R., Sahai, P., S,, Blanchette, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlating+hypoxia+with+insulin+secretion+using+a+fluorescent+hypoxia+detection+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+B%22%5BJournal%5D)">Correlating hypoxia with insulin secretion using a fluorescent hypoxia detection system.</a> J. Biomed. Mater. Res. B. 97, 148-155 (2011).</li>
<li>Webb, J. D., Coleman, M. L., Pugh, C. W. H. ypoxia <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hypoxia-inducible+factors+%28HIF%29%2C+HIF+hydroxylases+and+oxygen+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">hypoxia-inducible factors (HIF), HIF hydroxylases and oxygen sensing.</a> Cell. Mol. Life Sci. 66, 3539-3554 (2009).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Metoda zaprezentowana w niniejszym opracowaniu oferuje szybką i prostą technikę enkapsulacji komórek w hydrożelu PEG przy minimalnym wykorzystaniu warunków niefizjologicznych. PEG stanowi bardzo użyteczny materiał do enkapsulacji ze względu na swoją biokompatybilność i łatwość modyfikacji. Prosta zmiana procentowej zawartości PEG w roztworze fotoaktywnym może być na przykład wykorzystana do regulacji właściwości mechanicznych, takich jak moduł sprężystości przy ściskaniu, oraz właściwości transportowych poprzez wielkość porów. Ponadto PEG jest łatwo modyfikowalny poprzez dodawanie łańcuchów bocznych. Hydrożele PEG stanowią zatem zarówno obiecujące urządzenie kliniczne, jak i elastyczną platformę do badań in vitro
Przedstawiono również metodę śledzenia hipoksji w komórkach enkapsulowanych w PEG. Metoda ta jest użyteczna ze względu na prostotę detekcji hipoksji oraz brak konieczności poświęcania badanych komórek. Technikę tę można zastosować do wielu rodzajów komórek w różnych warunkach, co nadaje jej szerokie zastosowanie. Na przykład można śledzić hipoksję jako sygnał do różnicowania komórek macierzystych w kulturach mikromasy komórek macierzystych. Jednak metoda ta może być stosowana wyłącznie w systemach komórek rozproszonych lub w systemach, w których rozproszone komórki są później agregowane. Ponadto detekcja sygnału fluorescencyjnego może być utrudniona w tkankach większych lub gęstszych.

<table><tbody><tr><td>PEG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>309028-500G</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodnik metakrylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276685-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Kuchenka mikrofalowa</td><td>Emerson</td><td>MW8784SB</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Scientific Industries Inc.</td><td>SI-A236</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek metylenu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D65100-1L</td><td></td></tr><tr><td>Eter dietylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>346136-1L</td><td></td></tr><tr><td>Membrana do dializy</td><td>Spectrum</td><td>132640</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zamrażarka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liofilizator</td><td>Labconco Corp.</td><td>7670521</td><td></td></tr><tr><td>Pompa próżniowa</td><td>Welch Allyn</td><td>8917Z-01</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>Ciba-Geigy</td><td>029891301PS04</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>21-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy</td><td>VWR international</td><td>28145-477</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>*</td><td>*skład niestandardowy</td></tr><tr><td>FBS</td><td>PAA Laboratories</td><td>A15-351</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>30-003-CF</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>3597</td><td>Napco Series 8000 WJ z redukcją O2</td></tr><tr><td>Trypsyna EDTA</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło orbitalne</td><td>VWR international</td><td>12620-926</td><td></td></tr><tr><td>Lampa UV</td><td>Sanyo Denki</td><td>FLR40SBLB/M</td><td>Pomieszcza dwie niebieskie żarówki UV 40W, 365nm</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5811 000.010*</td><td>*numer zamówienia. &lt;br/&gt;Model 5810 R</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td>TI-ND6-PFS</td><td>Z zestawem filtrów dla wzbudzenia 556nm/ emisji 586nm</td></tr></tbody></table>

Śledzenie sygnalizacji hipoksycznej wewnątrz enkapsulowanych agregatów komórkowych

Tracking Hypoxic Signaling within Encapsulated Cell Aggregates

W cukrzycy typu 1 autoimmunologiczne zniszczenie komórek β trzustki prowadzi do utraty produkcji insuliny i potencjalnie śmiertelnej hiperglikemii. Jako alternatywną opcję leczenia w stosunku do egzogennych zastrzyków z insuliny badano transplantację funkcjonalnej tkanki trzustki1,2. Podejście to daje nadzieję na bardziej naturalne, długoterminowe przywrócenie normoglikemii. Aby zapobiec odrzuceniu przeszczepu, konieczna jest ochrona tkanki dawcy przed układem odpornościowym biorcy, a enkapsulacja jest metodą stosowaną w celu osiągnięcia tego celu.
Materiały pochodzenia biologicznego, takie jak alginian3 i agaroza4, były tradycyjnym wyborem do konstrukcji kapsułek, lecz mogą indukować stan zapalny lub przerost włóknisty5, co może utrudniać transport składników odżywczych i tlenu. Alternatywnie, syntetyczne hydrożele na bazie poli(glikolu etylenowego) (PEG) są nietrwałe, łatwo funkcjonalizowane, dostępne w wysokiej czystości, posiadają kontrolowaną wielkość porów i są niezwykle biokompatybilne6,7,8. Dodatkową zaletą jest to, że hydrożele PEG mogą być szybko tworzone w prostej reakcji fotousieciowania, która nie wymaga stosowania temperatur niefizjologicznych6,7. Taka procedura została tutaj opisana. W reakcji sieciowania degradacja UV fotoinicjatora, 1-[4-(2-hydroksyetoksy)-fenylo]-2-hydroksy-2-metylo-1-propanonu (Irgacure 2959), wytwarza wolne rodniki, które atakują winylowe podwójne wiązania węgiel-węgiel dimetakrylowanego PEG (PEGDM), indukując sieciowanie na końcach łańcuchów. Sieciowanie może zostać osiągnięte w ciągu 10 minut. Wykazano, że hydrożele PEG skonstruowane w ten sposób sprzyjają przeżywalności komórek7,9, a niskie stężenie fotoinicjatora i krótka ekspozycja na promieniowanie UV nie są szkodliwe dla żywotności i funkcji enkapsulowanej tkanki10. Chociaż przeprowadzamy metakrylowanie PEG metodą opisaną poniżej, PEGDM można również bezpośrednio zakupić u dostawców takich jak Sigma.
Nieuchronną konsekwencją enkapsulacji jest izolacja komórek od sieci naczyniowej. Dostawa substancji odżywczych, a w szczególności tlenu, jest zatem ograniczona i zależna od dyfuzji. Zmniejszona dostępność tlenu może w szczególności wpływać na komórki β, których funkcja wydzielania insuliny jest silnie zależna od tlenu11-13. Skład i geometria kapsułki będą również wpływać na szybkość i drogę dyfuzji tlenu. W związku z tym opisujemy również technikę identyfikacji komórek niedotlenionych w naszych kapsułkach z PEG. Infekcja komórek rekombinowanym adenowirusem umożliwia wygenerowanie sygnału fluorescencyjnego w momencie aktywacji wewnątrzkomórkowych szlaków czynnika indukowanego hipoksją (HIF)14. Ponieważ HIF-y są głównymi regulatorami odpowiedzi transkrypcyjnej na hipoksję, stanowią one idealny marker docelowy do wykrywania sygnalizacji hipoksycznej15. Podejście to pozwala na łatwe i szybkie wykrywanie komórek niedotlenionych. W skrócie, adenowirus posiada sekwencję czerwonego białka fluorescencyjnego (Ds Red DR z Clontech) pod kontrolą trimeru elementu odpowiadającego na hipoksję (HRE). Stabilizacja HIF-1 w warunkach niskiego poziomu tlenu będzie napędzać transkrypcję białka fluorescencyjnego (Rycina 1). Dodatkowe szczegóły dotyczące konstrukcji tego wirusa zostały opublikowane wcześniej15. Wirus jest przechowywany w 10% glicerolu w temperaturze -80° C w wielu alikwotach po 150 μL w probówkach wirówkowych 1,5 mL w stężeniu 3,4 x 1010 pfu/mL.
Poprzednie badania w naszym laboratorium wykazały, że komórki MIN6 enkapsulowane w formie agregatów zachowują żywotność przez 4 tygodnie hodowli w 20% tlenie. Agregaty MIN6 hodowane w 2% lub 1% tlenu wykazywały zarówno oznaki obecności komórek nekrotycznych (nadal około 85-90% żywotnych) w barwieniu bromkiem etydium, jak i zmiany morfologiczne w porównaniu z komórkami w 20% tlenie. Gładki, sferyczny kształt agregatów obserwowany przy 20% tlenu został utracony, a agregaty przypominały bardziej zdezorganizowane grupy komórek. Chociaż stres związany z niskim stężeniem tlenu nie powoduje gwałtownego spadku żywotności, wyraźnie wpływa on na agregację i funkcję komórek MIN6, co zmierzono za pomocą wydzielania insuliny stymulowanego glukozą15. Analiza Western blot enkapsulowanych komórek w 20% i 1% tlenie wykazała również istotny wzrost poziomu HIF-1α w komórkach hodowanych w warunkach niskiego stężenia tlenu, co koreluje z ekspresją białka DsRed DR.

Opisano metodę fotoenkapsulacji komórek w sieciowanym hydrożelu PEG. Sygnalizację hipoksji wewnątrz enkapsulowanych agregatów mysiego insulinoma (MIN6) śledzono przy użyciu fluorescencyjnego systemu markerów. System ten umożliwia seryjne badanie komórek wewnątrz rusztowania hydrożelowego oraz korelację sygnalizacji hipoksji ze zmianami fenotypu komórek.

W cukrzycy typu 1 autoimmunologiczne zniszczenie $\beta$-komórek trzustki prowadzi do utraty produkcji insuliny i potencjalnie śmiertelnego...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest monitorowanie odpowiedzi komórkowej na hipoksję w agregatach komórkowych enkapsulowanych w PEG. W pierwszym kroku rozproszone komórki są infekowane wirusem markerowym, a następnie hodowane na wytrząsarce w celu umożliwienia formowania się agregatów. Następnie przeprowadzana jest funkcjonalizacja liniowego PEG oraz oczyszczanie timera PEG DM.Następnie agregaty komórkowe są enkapsulowane w hydrożelu PEG DM. W końcowym etapie hydrożele są hodowane w różnych warunkach natlenienia, przy jednoczesnym monitorowaniu fluorescencyjnym sygnału markera hipoksji. W rezultacie lokalizacja i zakres aktywności czynnika indukowanego hipoksją w obrębie żywotnych, enkapsulowanych agregatów komórkowych mogą zostać zwizualizowane za pomocą zwykłej mikroskopii fluorescencyjnej.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinach enkapsulacji komórek oraz dostarczania terapii opartych na komórkach, takie jak: gdzie występuje hipoksja w kulturach 3D i jak wpływa ona na przeżywalność i funkcję komórek? Zastosowania tej techniki rozciągają się na podejścia medycyny regeneracyjnej oraz terapię niedoborów hormonalnych, takich jak cukrzyca, ze względu na znaczący wpływ hipoksji w tkankach agregowanych i enkapsulowanych. Wykazano, że aktywność czynnika indukowanego hipoksją 1 koreluje ze znacznie zmniejszonym wydzielaniem insuliny przez komórki beta, co motywuje próby dysocjacji wysepek pierwotnych i formowania ich ponownie w pseudo-wysepki.Agregaty o zredukowanej średnicy. Nasz marker może wskazywać aktywność czynnika indukowanego hipoksją w agregatach na poziomie komórkowym w obrębie dowolnego rozluźnionego materiału otaczającego. Jako materiał kapsułki wybrano PEG ze względu na jego korzystne właściwości transferowe, cytozgodność oraz łatwość modyfikacji funkcjonalnych.Po odważeniu dwóch gramów PEG w szklanej fiolce o pojemności 40 ml i dodaniu około 308 µl bezwodnika metakrylowego, należy lekko zamknąć fiolkę twardą plastikową zakrętką. Podgrzewaj fiolkę w standardowej kuchence mikrofalowej z maksymalną mocą przez dwie minuty. Następnie, używając rękawic odpornych na wysoką temperaturę, dokładnie wymieszaj zawartość fiolki w wirówce typu vortex i ponownie podgrzewaj roztwór w kuchence mikrofalowej z maksymalną mocą przez kolejne pięć minut.Pozostaw fiolkę na chwilę, aby ostygła do temperatury umożliwiającej bezpieczne dotykanie, a następnie otwórz ją, delikatnie obracając fiolką. Powoli dodaj chlorek metylenu, mieszając próbkę w vorteksie w razie potrzeby, aż roztwór stanie się klarowny i jednorodny. Następnie dodawaj roztwór kroplami do 200 mililitrów mieszanego, zimnego eteru datylowego, aby wyprecypitować PEG dm.Następnie zebrać PEG DM za pomocą filtracji próżniowej i pozostawić do wyschnięcia. Po wyschnięciu PEG DM rozpuścić go w około 100 do 150 mililitrach wody dejonizowanej. Następnie dializować roztwór przeciwko wodzie dejonizowanej przez pięć dni w tubach dializacyjnych o progu odcięcia masy cząsteczkowej 1000 Daltons po dializie.Rozlej roztwór do odpowiednich pojemników i zamroź je w temperaturze -80 °C przez noc. Następnie liofilizuj roztwór przez cztery dni, aby uzyskać oczyszczony biały proszek PEG DM służący do uwalniania komórek z powierzchni potraktowanej kolby hodowlanej. Najpierw odessaj medium, przemyj komórki HBSS bez jonów wapnia i magnezu o temperaturze 37 °C, a następnie odessaj HBSS.Następnie dodaj 2 mL podgrzanego do 37 °C roztworu Trypsyny i EDTA i inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez 3 minuty. Następnie energicznie uderz w bok kolby, aby odczepić komórki, dodaj do kolby 8 mL podgrzanego do 37 °C medium i intensywnie pipetuj zawiesinę komórkową w górę i w dół, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.Po przeniesieniu roztworu komórek do sterylnej probówki do wirowania o pojemności 15 mililitrów, należy policzyć komórki za pomocą hemocytometru, aby określić całkowitą liczbę komórek przeznaczonych do infekcji. Do dołków sześciodołkowej płytki do hodowli zawiesinowych należy dodać taką objętość zawiesiny komórkowej, aby uzyskać 400 000 komórek na dołek; następnie do probówki do mikrowirowania o pojemności 1,8 mililitra należy odpipetować 50 mikrolitrów HBSS na każdy dołek z komórkami przeznaczonymi do infekcji. Następnie należy ostrożnie pipetować odpowiednią ilość zawiesiny wirusa do przygotowanego HBSS.Następnie dodaj do każdej studzienki odpowiednią objętość rozcieńczonego wirusa, aby uzyskać pożądane MOI, a potem dolej pożywkę do każdej studzienki, tak aby objętość całkowita wyniosła 1,7 milliliters. Na koniec umieść płytkę na wytrząsarce orbitalnej wewnątrz inkubatora; ustaw wytrząsarkę na niską prędkość, około 100 RPM, aby pożywka delikatnie obmywała studzienkę, i pozostaw komórki do agregacji na 24 do 36 godzin. Rozpocznij od odcięcia stożkowej końcówki plastikowej strzykawki o pojemności one milliliter i umieszczenia jej otwartym końcem do góry w statywie, aby stworzyć naczynie, w którym zostanie uformowany hydrożel.Następnie pipetujemy 20 µL roztworu fotoaktywnego PEG DM do otwartego końca strzykawki, na tłok, upewniając się, że objętość cieczy pokrywa całą powierzchnię tłoka. Przesuwamy tłok w niewielkich przyrostach, aby uzyskać płaską powierzchnię cieczy. Teraz odstawiamy pipetę z powrotem do statywu i umieszczamy statyw pod lampą UV na około osiem minut, aby umożliwić sieciowanie hydrożelu.W tym czasie pipetuj objętość zawierającą pożądaną liczbę komórek i agregatów do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,8 ml. Zamknij probówkę i odwiruj komórki oraz agregaty przez pięć minut przy 130 g. Następnie za pomocą mikropipety ostrożnie usuń nadsącz, nie naruszając pelletu komórkowego znajdującego się na dnie probówki.Gdy głowica medium zbliża się do osadu, należy użyć precyzyjniejszej końcówki do pipety o pojemności 10 µL, aby równomiernie rozprzestrzenić agregaty komórkowe w roztworze prekursora żelu, upewniając się, że są one w pełni zamknięte w kapsułce. Jest to najtrudniejszy etap tej procedury. Podczas wykonywania tego kroku należy pamiętać o delikatnym resuspendoaniu i przenoszeniu osadu.Następnie delikatnie resuspenduj osad komórkowy w 20 µL fotoaktywnego roztworu PEG DM. Używając końcówki do pipety o szerokim wylocie, przenieś zawiesinę komórkową do strzykawki na powierzchnię usieciowanej części hydrożelu, a następnie naświetl strzykawkę światłem UV przez kolejne osiem minut, aby dokończyć proces tworzenia hydrożelu. Po zakończeniu operacji komórki powinny być w pełni zamknięte wewnątrz cylindrycznego hydrożelu.Na koniec do jednego dołka płytki 24-dołkowej dodaj jeden mililitr HBSS, a do innego jeden mililitr medium. Następnie wypchnij hydrożel z strzykawki do HBSS, aby krótko przemyć żel. Przenieś żel do medium i inkubuj płytkę w wybranych warunkach.Na dowolnym etapie hodowli komórki można obrazować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu śledzenia inicjacji sygnalizacji hipoksycznej; w tym celu należy umieścić płytkę 24-dołkową na stole mikroskopu, centrując dołek z hydrożelem pod obiektywem. Sygnał jest na tyle specyficzny, że pozwala na identyfikację poszczególnych komórek sygnalizujących, jednak rozdzielczość może być niewystarczająca do określenia wewnątrzkomórkowej lokalizacji sygnału. W komórkach sygnalizujących sygnał jest zazwyczaj obserwowany równomiernie w całej cytoplazmie.Na tej rycinie przedstawiono reprezentatywny przykład agregatów minx zamkniętych w hydrożelu PEG wewnątrz komórki żelowej. Agregaty powinny być całkowicie zamknięte w macierzy i rozmieszczone homogenicznie, aby umożliwić lepszy transport składników odżywczych, co widoczne jest na tym przykładzie. Należy zwrócić uwagę, że usieciowany żel jest jednorodnie stały i przyjmuje kształt naczynia, w którym przeprowadzono reakcję.Na tej rycinie przedstawiono reprezentatywną fluorescencyjną sygnalizację hipoksji w zagregowanych komórkach min six w hydrożelu PEG DM; komórki zostały enkapsulowane, a następnie inkubowane w 20% oxygen przez 44 godziny. Komórki przedstawione po lewej stronie nie wykazują sygnalizacji hipoksji, podczas gdy komórki, które zostały enkapsulowane, a następnie inkubowane w 2% oxygen przez 44 godziny, przedstawione po prawej stronie, wykazują wyraźny, powszechny sygnał; hipoksję można monitorować również w innych typach komórek.Rysunek ten przedstawia reprezentatywne przesyłanie sygnałów hipoksji w enkapsulowanych agregatach mezenchymalnych komórek macierzystych. Jak widać na lewym obrazie, sygnał fluorescencyjny nie jest wykrywalny po 12 godzinach przy 2% oxygen; następnie, jak pokazano na środkowym obrazie, staje się on bardziej wyraźny po 24 godzinach przy 2% oxygen. I wresce, jak widać na prawym obrazie, wykazuje on wysoką ekspresję po 96 godzinach przy 2% oxygen po zastosowaniu tej procedury.W celu powiązania sygnalizacji hipoksyjnej z fenotypem komórek można przeprowadzić inne metody, takie jak test ELISA, analizę białek wydzielanych oraz testy żywotności komórek. Dzięki temu rozwitkowi technika ta może utorować drogę badaczom z dziedziny inżynierii tkankowej i terapii opartych na komórkach do badania funkcji przeżycia oraz różnicowania się komórek wewnątrz rusztowań i materiałów enkapsulacyjnych.

tracking-hypoxic-signaling-within-encapsulated-cell-aggregates

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Śledzenie sygnalizacji niedotlenienia w zamkniętych agregatach komórkowych

Prezentujemy protokoły trójwymiarowej (3D) enkapsulacji komórek w syntetycznych hydrożelach. Procedura enkapsulacji została opisana dla dwóch powszechnie stosowanych metod sieciowania (addycji typu Michaela oraz mechanizmów wolnorodnikowych inicjowanych światłem), a także dla szeregu technik oceny zachowania enkapsulowanych komórek.

Enkapsulacja komórkowa w trójwymiarowych hydrożelach w inżynierii tkankowej

Obrazowanie żywych komórek w celu analizy apoptozy pośredniczonej przez kaspazę-3 w unieśmiertelnionych kulturach komórek oligodendrocytów N19 z wykorzystaniem substratu kaspazy-3 NucView 488. Technika ta znajduje zastosowanie w testach programowanej śmierci komórki w czasie rzeczywistym w różnych typach komórek i tkanek.

Monitorowanie aktywności rozszczepionej kaspazy-3 i apoptozy unieśmiertelnionych komórek oligodendroglialnych z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek oraz rozszczepialnych fluorescencyjnych substratów barwiących po indukowanej potasem depolaryzacji błony

Przedstawiamy prosty protokół wizualizacji obszarów programowanej śmierci komórek (PCD) w embrionach myszy oraz w hodowlach różnicujących się embrionalnych komórek macierzystych (ES) przy użyciu wysoce rozpuszczalnego barwnika o nazwie LysoTracker.

Zastosowanie LysoTracker do wykrywania programowanej śmierci komórki w embrionach i różnicujących się embrionalnych komórkach macierzystych

W tym filmie demonstrujemy technikę pomiaru interakcji międzykomórkowych między cząsteczkami adhezyjnymi komórek synaptycznych za pomocą testu agregacji komórek HEK. W tym teście równa liczba komórek HEK wyrażających pożądaną cząsteczkę adhezyjną komórek presynaptycznych i białko fluorescencyjne jest mieszana z komórkami HEK wyrażającymi postsynaptyczną cząsteczkę adhezyjną komórek i inne białko fluorescencyjne. Interakcja między cząsteczkami adhezyjnymi komórek zmusza komórki do agregacji, co...

Test agregacji komórek w celu wykrycia interakcji trans między cząsteczkami adhezyjnymi komórek

Termin anastasis odnosi się do zjawiska, w którym umierające komórki odwracają proces samobójstwa komórki na późnym etapie, naprawiają się i ostatecznie przeżywają. Tutaj pokazujemy protokoły wykrywania i śledzenia komórek, które przechodzą anastazę.

Strategie śledzenia anastazy, zjawiska przeżycia komórek, które odwraca apoptozę

Anastasis jest technicznie trudne do wykrycia in vivo, ponieważ komórki, które odwróciły proces śmierci komórki, mogą być morfologicznie nie do odróżnienia od normalnych zdrowych komórek. Poniżej opisujemy protokoły wykrywania i śledzenia komórek, które ulegają anastazie u żywych zwierząt, przy użyciu naszego nowo opracowanego systemu biosensorów CaspaseTracker in vivo.

Wykrywanie anastazy in vivo za pomocą biosensora CaspaseTracker

Dostosowaliśmy przepuszczalną mikroporowatą wkładkę membranową do naśladowania mikrośrodowiska guza (TME). Model składa się z mieszanej hodowli komórek, pozwala na uproszczone generowanie wysoce wzbogaconych pojedynczych populacji komórek bez użycia znakowania fluorescencyjnego lub sortowania komórek oraz pozwala na badanie komunikacji międzykomórkowej w obrębie TME w warunkach normalnych lub stresowych.

Naśladownictwo mikrośrodowiska guza: prosta metoda generowania wzbogaconych populacji komórek i badania komunikacji międzykomórkowej

Tutaj prezentujemy protokół do określania wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych indukowanych w żywotnych komórkach przez fizyczną interakcję z sąsiednimi martwymi lub umierającymi komórkami. Protokół koncentruje się na zdarzeniach sygnalizacyjnych wywołanych przez rozpoznawanie martwych komórek za pośrednictwem receptora, w przeciwieństwie do ich wychwytu fagocytarnego lub uwalniania rozpuszczalnych mediatorów.

Identyfikacja wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych indukowanych w żywotnych komórkach przez interakcję z sąsiednimi komórkami przechodzącymi apoptotyczną śmierć komórki

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół do szybkiego i półilościowego pomiaru interakcji ligand-receptor w trans w heterologicznym systemie komórkowym za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Pomiar interakcji międzykomórkowych poprzez agregację białek w heterologicznym systemie komórkowym

Obecny protokół rozwija technikę opartą na obrazie do szybkiego, nieniszczącego i bezznacznikowego regionalnego pomiaru gęstości komórek i żywotności w agregatach 3D guza. Wyniki ujawniły gradient gęstości komórek, z większą gęstością komórek w regionach rdzenia niż w warstwach zewnętrznych w rozwijających się agregatach i głównie śmiercią komórek obwodowych w agregatach HER2+ leczonych trastuzumabem.

Nieniszcząca ocena regionalnej gęstości komórek w agregatach nowotworowych po leczeniu farmakologicznym

Poznaj metodę śledzenia sygnalizacji niedotlenienia w zamkniętych agregatach komórkowych mysich insulinomów przy użyciu fluorescencyjnych markerów w hydrogelu PEG. Technika ta umożliwia badanie odpowiedzi komórkowej na hipoksję w kulturach 3D.

Śledzenie sygnalizacji hipoksycznej wewnątrz enkapsulowanych agregatów komórkowych

Przeglądaj więcej filmów