Śledzenie sygnalizacji hipoksycznej wewnątrz enkapsulowanych agregatów komórkowych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest monitorowanie odpowiedzi komórkowej na hipoksję w agregatach komórkowych enkapsulowanych w PEG. W pierwszym kroku rozproszone komórki są infekowane wirusem markerowym, a następnie hodowane na wytrząsarce w celu umożliwienia formowania się agregatów. Następnie przeprowadzana jest funkcjonalizacja liniowego PEG oraz oczyszczanie timera PEG DM.

Następnie agregaty komórkowe są enkapsulowane w hydrożelu PEG DM. W końcowym etapie hydrożele są hodowane w różnych warunkach natlenienia, przy jednoczesnym monitorowaniu fluorescencyjnym sygnału markera hipoksji. W rezultacie lokalizacja i zakres aktywności czynnika indukowanego hipoksją w obrębie żywotnych, enkapsulowanych agregatów komórkowych mogą zostać zwizualizowane za pomocą zwykłej mikroskopii fluorescencyjnej.

Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinach enkapsulacji komórek oraz dostarczania terapii opartych na komórkach, takie jak: gdzie występuje hipoksja w kulturach 3D i jak wpływa ona na przeżywalność i funkcję komórek? Zastosowania tej techniki rozciągają się na podejścia medycyny regeneracyjnej oraz terapię niedoborów hormonalnych, takich jak cukrzyca, ze względu na znaczący wpływ hipoksji w tkankach agregowanych i enkapsulowanych. Wykazano, że aktywność czynnika indukowanego hipoksją 1 koreluje ze znacznie zmniejszonym wydzielaniem insuliny przez komórki beta, co motywuje próby dysocjacji wysepek pierwotnych i formowania ich ponownie w pseudo-wysepki.

Agregaty o zredukowanej średnicy. Nasz marker może wskazywać aktywność czynnika indukowanego hipoksją w agregatach na poziomie komórkowym w obrębie dowolnego rozluźnionego materiału otaczającego. Jako materiał kapsułki wybrano PEG ze względu na jego korzystne właściwości transferowe, cytozgodność oraz łatwość modyfikacji funkcjonalnych.

Po odważeniu dwóch gramów PEG w szklanej fiolce o pojemności 40 ml i dodaniu około 308 µl bezwodnika metakrylowego, należy lekko zamknąć fiolkę twardą plastikową zakrętką. Podgrzewaj fiolkę w standardowej kuchence mikrofalowej z maksymalną mocą przez dwie minuty. Następnie, używając rękawic odpornych na wysoką temperaturę, dokładnie wymieszaj zawartość fiolki w wirówce typu vortex i ponownie podgrzewaj roztwór w kuchence mikrofalowej z maksymalną mocą przez kolejne pięć minut.

Pozostaw fiolkę na chwilę, aby ostygła do temperatury umożliwiającej bezpieczne dotykanie, a następnie otwórz ją, delikatnie obracając fiolką. Powoli dodaj chlorek metylenu, mieszając próbkę w vorteksie w razie potrzeby, aż roztwór stanie się klarowny i jednorodny. Następnie dodawaj roztwór kroplami do 200 mililitrów mieszanego, zimnego eteru datylowego, aby wyprecypitować PEG dm.

Następnie zebrać PEG DM za pomocą filtracji próżniowej i pozostawić do wyschnięcia. Po wyschnięciu PEG DM rozpuścić go w około 100 do 150 mililitrach wody dejonizowanej. Następnie dializować roztwór przeciwko wodzie dejonizowanej przez pięć dni w tubach dializacyjnych o progu odcięcia masy cząsteczkowej 1000 Daltons po dializie.

Rozlej roztwór do odpowiednich pojemników i zamroź je w temperaturze -80 °C przez noc. Następnie liofilizuj roztwór przez cztery dni, aby uzyskać oczyszczony biały proszek PEG DM służący do uwalniania komórek z powierzchni potraktowanej kolby hodowlanej. Najpierw odessaj medium, przemyj komórki HBSS bez jonów wapnia i magnezu o temperaturze 37 °C, a następnie odessaj HBSS.

Następnie dodaj 2 mL podgrzanego do 37 °C roztworu Trypsyny i EDTA i inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez 3 minuty. Następnie energicznie uderz w bok kolby, aby odczepić komórki, dodaj do kolby 8 mL podgrzanego do 37 °C medium i intensywnie pipetuj zawiesinę komórkową w górę i w dół, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.

Po przeniesieniu roztworu komórek do sterylnej probówki do wirowania o pojemności 15 mililitrów, należy policzyć komórki za pomocą hemocytometru, aby określić całkowitą liczbę komórek przeznaczonych do infekcji. Do dołków sześciodołkowej płytki do hodowli zawiesinowych należy dodać taką objętość zawiesiny komórkowej, aby uzyskać 400 000 komórek na dołek; następnie do probówki do mikrowirowania o pojemności 1,8 mililitra należy odpipetować 50 mikrolitrów HBSS na każdy dołek z komórkami przeznaczonymi do infekcji. Następnie należy ostrożnie pipetować odpowiednią ilość zawiesiny wirusa do przygotowanego HBSS.

Następnie dodaj do każdej studzienki odpowiednią objętość rozcieńczonego wirusa, aby uzyskać pożądane MOI, a potem dolej pożywkę do każdej studzienki, tak aby objętość całkowita wyniosła 1,7 milliliters. Na koniec umieść płytkę na wytrząsarce orbitalnej wewnątrz inkubatora; ustaw wytrząsarkę na niską prędkość, około 100 RPM, aby pożywka delikatnie obmywała studzienkę, i pozostaw komórki do agregacji na 24 do 36 godzin. Rozpocznij od odcięcia stożkowej końcówki plastikowej strzykawki o pojemności one milliliter i umieszczenia jej otwartym końcem do góry w statywie, aby stworzyć naczynie, w którym zostanie uformowany hydrożel.

Następnie pipetujemy 20 µL roztworu fotoaktywnego PEG DM do otwartego końca strzykawki, na tłok, upewniając się, że objętość cieczy pokrywa całą powierzchnię tłoka. Przesuwamy tłok w niewielkich przyrostach, aby uzyskać płaską powierzchnię cieczy. Teraz odstawiamy pipetę z powrotem do statywu i umieszczamy statyw pod lampą UV na około osiem minut, aby umożliwić sieciowanie hydrożelu.

W tym czasie pipetuj objętość zawierającą pożądaną liczbę komórek i agregatów do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,8 ml. Zamknij probówkę i odwiruj komórki oraz agregaty przez pięć minut przy 130 g. Następnie za pomocą mikropipety ostrożnie usuń nadsącz, nie naruszając pelletu komórkowego znajdującego się na dnie probówki.

Gdy głowica medium zbliża się do osadu, należy użyć precyzyjniejszej końcówki do pipety o pojemności 10 µL, aby równomiernie rozprzestrzenić agregaty komórkowe w roztworze prekursora żelu, upewniając się, że są one w pełni zamknięte w kapsułce. Jest to najtrudniejszy etap tej procedury. Podczas wykonywania tego kroku należy pamiętać o delikatnym resuspendoaniu i przenoszeniu osadu.

Następnie delikatnie resuspenduj osad komórkowy w 20 µL fotoaktywnego roztworu PEG DM. Używając końcówki do pipety o szerokim wylocie, przenieś zawiesinę komórkową do strzykawki na powierzchnię usieciowanej części hydrożelu, a następnie naświetl strzykawkę światłem UV przez kolejne osiem minut, aby dokończyć proces tworzenia hydrożelu. Po zakończeniu operacji komórki powinny być w pełni zamknięte wewnątrz cylindrycznego hydrożelu.

Na koniec do jednego dołka płytki 24-dołkowej dodaj jeden mililitr HBSS, a do innego jeden mililitr medium. Następnie wypchnij hydrożel z strzykawki do HBSS, aby krótko przemyć żel. Przenieś żel do medium i inkubuj płytkę w wybranych warunkach.

Na dowolnym etapie hodowli komórki można obrazować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu śledzenia inicjacji sygnalizacji hipoksycznej; w tym celu należy umieścić płytkę 24-dołkową na stole mikroskopu, centrując dołek z hydrożelem pod obiektywem. Sygnał jest na tyle specyficzny, że pozwala na identyfikację poszczególnych komórek sygnalizujących, jednak rozdzielczość może być niewystarczająca do określenia wewnątrzkomórkowej lokalizacji sygnału. W komórkach sygnalizujących sygnał jest zazwyczaj obserwowany równomiernie w całej cytoplazmie.

Na tej rycinie przedstawiono reprezentatywny przykład agregatów minx zamkniętych w hydrożelu PEG wewnątrz komórki żelowej. Agregaty powinny być całkowicie zamknięte w macierzy i rozmieszczone homogenicznie, aby umożliwić lepszy transport składników odżywczych, co widoczne jest na tym przykładzie. Należy zwrócić uwagę, że usieciowany żel jest jednorodnie stały i przyjmuje kształt naczynia, w którym przeprowadzono reakcję.

Na tej rycinie przedstawiono reprezentatywną fluorescencyjną sygnalizację hipoksji w zagregowanych komórkach min six w hydrożelu PEG DM; komórki zostały enkapsulowane, a następnie inkubowane w 20% oxygen przez 44 godziny. Komórki przedstawione po lewej stronie nie wykazują sygnalizacji hipoksji, podczas gdy komórki, które zostały enkapsulowane, a następnie inkubowane w 2% oxygen przez 44 godziny, przedstawione po prawej stronie, wykazują wyraźny, powszechny sygnał; hipoksję można monitorować również w innych typach komórek.

Rysunek ten przedstawia reprezentatywne przesyłanie sygnałów hipoksji w enkapsulowanych agregatach mezenchymalnych komórek macierzystych. Jak widać na lewym obrazie, sygnał fluorescencyjny nie jest wykrywalny po 12 godzinach przy 2% oxygen; następnie, jak pokazano na środkowym obrazie, staje się on bardziej wyraźny po 24 godzinach przy 2% oxygen. I wresce, jak widać na prawym obrazie, wykazuje on wysoką ekspresję po 96 godzinach przy 2% oxygen po zastosowaniu tej procedury.

W celu powiązania sygnalizacji hipoksyjnej z fenotypem komórek można przeprowadzić inne metody, takie jak test ELISA, analizę białek wydzielanych oraz testy żywotności komórek. Dzięki temu rozwitkowi technika ta może utorować drogę badaczom z dziedziny inżynierii tkankowej i terapii opartych na komórkach do badania funkcji przeżycia oraz różnicowania się komórek wewnątrz rusztowań i materiałów enkapsulacyjnych.