Name: Modelowanie i obrazowanie trójwymiarowej zbiorowej inwazji komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Poznaj technikę modelowania inwazji komórek nowotworowych w trójwymiarowej macierzy białkowej Matrigel przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Ta metoda pozwala uzyskać ilościowe i jakościowe dane o zachowaniu komórek prowadzących i podążających.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie niniejszych badań pochodzi z Cancer Research UK.

1. Retrowirusowe znakowanie komórek białkami fluorescencyjnymi
<ol>
	<li>wysiać komórki do pakowania retrowirusów (np. Phoenix) przy 0,25 x 106 liczba komórek na dołek w płytce 6-dołkowej szalkę z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS)/DMEM.</li>
	<li>Po 48 godzinach przeprowadzić transfekcję komórek retrowirusowym DNA przy użyciu Effectene zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Po 24 godzinach przepłukać dołki dwukrotnie pożywką, a następnie dodać 1,5 ml 10% FBS/DMEM do każdego dołka.</li>
	<li>Zapakowany wirus w pożywce do hodowli tkankowych należy zebrać po 48 godzinach, pipetując go i przenosząc do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Wirować przy 1600 obr./min przez 5 min w celu osadzenia komórek.</li>
	<li>Przenieść supernatant do czystej probówki i przechowywać w temperaturze -80°C.</li>
	<li>Komórki przeznaczone do transdukcji retrowirusowej wysiewa się w zagęszczeniu 1,5 x 105 komórek na dołek w płytce 6-dołkowej i umieszczone w inkubatorze z nawilżaniem przy 37°C przez noc.</li>
	<li>Następnego dnia usunąć medium z komórek i dodać 1 ml zapasu wirusa uzupełnionego o 4 μl polybrene (2 mg/mL) do każdej dołki. Umieścić płytki z powrotem w inkubatorze.</li>
	<li>Po inkubacji trwającej 5–6 godzin do każdej studzienki należy dodać 2 ml 10% FBS/DMEM, a następnie ponownie umieścić płytki w 37°C inkubować przez noc.</li>
	<li>Następnego dnia wymienić pożywkę i odczekać 24 godziny przed dodaniem odpowiedniej pożywki selekcyjnej.</li>
	<li>Po osiągnięciu konfluencji (co zależy od szybkości wzrostu komórek oraz wydajności transdukcji retrowirusowej, lecz zazwyczaj trwa od 4 do 14 dni), należy poddać komórki trypsynizacji, a następnie przeprowadzić sortowanie pod kątem fluorescencji, wykorzystując komórki nietransdukowane jako punkt odniesienia; zebrać i połączyć komórki wykazujące fluorescencję wyższą niż komórki nietransdukowane, a następnie zamrozić aliquoty w temperaturze -80° C do przyszłego użytku.</li>
</ol>
2. Odwrócony test inwazji w Matrigelu
<ol>
	<li>Powoli rozmroź na lodzie alikwot kompletnego Matrigelu (tzn. zawierającego czynniki wzrostu) (Rycina 1A).</li>
	<li>Po rozmrożeniu rozcieńczyć Matrigel w stosunku 1:1 w schłodzonym w lodzie PBS (dodając wszelkie pozostałe odczynniki w stężeniu 2x do PBS przed rozcieńczeniem; Rysunek 1B). Aby ułatwić manipulowanie Matrigelem przed polimeryzacją, wszystkie elementy plastikowe (np. końcówki, probówki itp.) powinny być schłodzone w lodzie.</li>
	<li>Wstaw do dołków płytki hodowlanej o 24 dołkach odpowiednią liczbę niepowlekanych Transwelli o średnicy 6,5 mm i rozmiarze porów 8 μm, a następnie ostrożnie nanieś pipetą 100 μl rozcieńczonego Matrigelu do dołków i pozostawić do inkubacji przez około 30 min w temperaturze 37°C aby stężało (Rycina 1C).</li>
	<li>W tym czasie należy przygotować jedną lub więcej zawiesin komórek znakowanych fluorescencyjnie o stężeniu od 1 do 4 x 105 komórek na ml, w zależności od linii komórkowej, dla każdego warunku wstępnego traktowania (np.g. siRNA, traktowanie lekiem) w ich standardowej pożywce wzrostowej (Rycina 1D).</li>
	<li>Po zestaleniu Matrigelu należy odwrócić wkładki Transwell i nanieść pipetą 100 μl zawiesiny komórkowej na skierowaną ku górze dolną stronę filtra (Rysunek 1E).</li>
	<li>Ostrożnie przykryj Transwelle dnem płytki hodowlaną do 24 dołków, tak aby zetknęła się ona z każdą kropelką zawiesiny komórkowej (Rycina 1F).</li>
	<li>Inkubuj płytkę w pozycji odwróconej przez 4 godziny, aby umożliwić adhezję komórek (Rycina 1G).</li>
	<li>Po upływie tego czasu odwróć płytki i przemyj każdy Transwell, zanurzając go sekwencyjnie dwukrotnie w 1 ml pożywki bezsurowiczej (Rysunek 2A).</li>
	<li>Pozostaw Transwell-e w trzecim dołku zawierającym wszelkie wymagane leki lub substancje terapeutyczne (Ryc. 2B).</li>
	<li>Ostrożnie nanieś pipetą 100 μl z 10% FBS/DMEM z dodatkiem chemoatraktanta (np.g. EGF w stężeniu 25 ng/ml) do wkładki Transwell na zastygłą mieszaninę Matrigelu i PBS, zamknąć pokrywkę i inkubować przez 3–5 dni w temperaturze 37°C z dodatkiem 5% CO2 (Ryc. 2C).</li>
</ol>
3. Barwienie i wizualizacja
<ol>
	<li>Komórki wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych mogą pominąć poniższe kroki przed wykonaniem mikroskopii konfokalnej.</li>
	<li>W celu obrazowania komórek niefluorescencyjnych naciekających Matrigel, należy umieścić Transwelle w nowych płytkach 24-dołkowych i nanieść pipetą 1 ml roztworu barwiącego Calcein AM o stężeniu 4 μM na wierzch każdego wkładu Matrigel, pozwalając barwnikowi spłynąć po bokach i zabarwić próbkę od góry i od dołu. Calcein AM (estry acetoksymetylowe kalceiny) jest barwnikiem do żywych komórek, który barwi całe komórki na zielono i nie wymaga fiksacji.</li>
	<li>Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2; po tym czasie komórki są w pełni zabarwione i gotowe do obrazowania za pomocą mikroskopii konfokalnej.</li>
	<li>Alternatywnie, komórki niefluorescencyjne naciekające Matrigel mogą zostać ufiksowane i zabarwione zgodnie z opisem w punktach 3.5–3.9 poniżej.</li>
	<li>Przenieść każdy Transwell do nowej płytki 24-dołkowej. Przykryć 1 ml roztworu 4% paraformaldehydu/0,2% Triton-X 100.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 0,5 godziny.</li>
	<li>Usunąć utrwalacz i przemyć 3 razy 1 ml PBS.</li>
	<li>Usunąć RNA cytoplazmatyczne poprzez 30-minutową obróbkę RNazą w stężeniu 100 μg/ml. Przemyć 2 razy PBS.</li>
	<li>W celu wizualizacji dodać 0,01 mg/ml jodku propidyny (PI) rozcieńczonego w PBS i pozostawić w temperaturze pokojowej w ciemności przez 0,5 godziny. Przemyć 3 razy PBS. Na tym etapie zabarwione PI transwelle można przechowywać w temperaturze pokojowej w ciemności przez co najmniej 1 miesiąc.</li>
	<li>Dokładne metody obrazowania za pomocą mikroskopii konfokalnej zależą od dostępnych zasobów. Używając odwróconego mikroskopu konfokalnego, należy umieścić Transwell z niewielką ilością pozostałego PBS na dużym szkiełku nakrywkowym (upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza) nad nieimersyjnym obiektywem 20 X i rejestrować przekroje optyczne co 10-15 μm od dna wkładu matrigelu. Pojedyncze przekroje optyczne mogą służyć do ilościowego określenia zakresu naciekania (Rysunek 3A) lub do budowy obiektów trójwymiarowych przy użyciu odpowiedniego oprogramowania, takiego jak Volocity (Rysunek 3B).</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Przykład serii Z przekrojów optycznych przedstawiono na rysunku 3A. W tym przypadku komórki zabarwiono Calcein AM i można zauważyć, że liczba komórek naciekających w górę z filtra maleje wraz z odległością. Ilościową ocenę inwazji można przeprowadzić, analizując stosunek pikseli pozytywnych dla Calcein AM do pikseli negatywnych w każdym interwale, lub stosując opisaną powyżej metodę fiksacji i barwienia oraz licząc jądra pozytywne dla PI w każdej pozycji. Jedną z zalet barwienia Calcein AM jest możliwość stworzenia trójwymiarowych rekonstrukcji inwazji komórkowej przy użyciu oprogramowania takiego jak Volocity, co pozwala na wizualne przedstawienie sposobu inwazji (rysunek 3B). Jeśli komórki są znakowane ekspresją białek fluorescencyjnych, pozycje komórek każdego koloru można zwizualizować w rekonstrukcjach 3D, oglądając je z boku (rysunek 3C) lub wykonując przekroje przez rekonstrukcję (rysunek 3D).
<img alt="Schemat procedury chromatograficznej; przygotowanie fiolek, aplikacja rozpuszczalnika, proces rozdzielania." src="/files/ftp_upload/3525/3525fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schematyczny rysunek etapów przygotowania testu odwrotnej inwazji. A) Matrigel ECM rozmrożony na lodzie. B) Matrigel rozcieńczony w stosunku 1:1 z PBS zawierającym leki w dwukrotnym stężeniu końcowym. C) Wkładki Transwell umieszczone w płytkach wielodołkowych, a następnie do każdej z nich naniesiono Matrigel za pomocą pipety. D) Przygotowanie zawiesiny komórkowej o pożądanym stężeniu. E) Po zastygnięciu Matrigelu płytka zostaje odwrócona i wyjęta, a komórki są wysiewane na dolną stronę filtra wkładki Transwell. F) W pozycji odwróconej płytka wielodołkowa zostaje ostrożnie umieszczona nad wkładkami Transwell, zapewniając kontakt z zawiesiną komórkową. G) Komórkom pozostawiono 4 godziny na przywieranie do filtra.
<img alt="Schemat przygotowania hodowli komórkowej; przedstawiona pipeta; proces obejmuje etapy pipetowania cieczy." src="/files/ftp_upload/3525/3525fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Kontynuacja schematu blokowego testu odwrotnej inwazji. A) Po adhezji komórek należy dwukrotnie zanurzyć każdy Transwell w pożywce bez surowicy, aby usunąć luźne komórki. B) Przemyty Transwell należy umieścić w docelowej studzience zawierającej pożywkę oraz ewentualne substancje testowe. C) Pożywkę zawierającą chemoatraktant (np. 10% fetal bovine serum) wraz z ewentualnymi substancjami testowymi należy ostrożnie nanieść warstwą na Matrigel.
<img alt="Schemat sekcjonowania optycznego; analiza inwazji przez Matrigel w odstępach 15 µm, obrazowanie fluorescencyjne." src="/files/ftp_upload/3525/3525fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Reprezentatywne obrazy wyników testu inwazji odwrotnej. A) Sekcje optyczne komórek barwionych Calcein AM naciekających Matrigel, wykonane w odstępach 15 μm za pomocą mikroskopii konfokalnej. B) Rekonstrukcja trójwymiarowa inwazji komórek z serii obrazów konfokalnych Z, widziana z boku. Przedruk z referencji 10. C) Rekonstrukcja trójwymiarowa komórek znakowanych GFP i RFP naciekających Matrigel, widziana z boku. D) Przekrój optyczny przez rekonstrukcję trójwymiarową komórek znakowanych GFP i RFP. Przedruk z referencji 10.

<ol><li>Olson, M. F., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin+cytoskeleton+in+cancer+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">The actin cytoskeleton in cancer cell motility.</a> Clin. Exp. Metastasis. 26, 273-287 (2008).</li>
<li>Hoelzinger, D. B., Demuth, T., Berens, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine+factors+that+sustain+glioma+invasion+and+paracrine+biology+in+the+brain+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer.+Inst%22%5BJournal%5D)">Autocrine factors that sustain glioma invasion and paracrine biology in the brain microenvironment.</a> J. Natl. Cancer. Inst. 99, 1583-1593 (2007).</li>
<li>Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perspective+on+cancer+cell+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A perspective on cancer cell metastasis.</a> Science. 331, 1559-1564 (2011).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hallmarks+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Hallmarks of Cancer.</a> Cell. 100, 57-70 (2000).</li>
<li>Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+advanced+spontaneous+metastasis+for+experimental+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics.</a> Nat. Rev. Cancer. 11, 135-141 (2011).</li>
<li>Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+migration+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Tumor cell migration in three dimensions.</a> Methods. Enzymol. 406, 625-643 (2006).</li>
<li>Croft, D. R., Olson, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulating+the+conversion+between+rounded+and+elongated+modes+of+cancer+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulating the conversion between rounded and elongated modes of cancer cell movement.</a> Cancer Cell. 14, 349-351 (2008).</li>
<li>Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-step+pericellular+proteolysis+controls+the+transition+from+individual+to+collective+cancer+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion.</a> Nat. Cell. Biol. 9, 893-904 (2007).</li>
<li>Hennigan, R. F., Hawker, K. L., Ozanne, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fos-transformation+activates+genes+associated+with+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Fos-transformation activates genes associated with invasion.</a> Oncogene. 9, 3591-3600 (1994).</li>
<li>Scott, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIM+kinases+are+required+for+invasive+path+generation+by+tumor+and+tumor-associated+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">LIM kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells.</a> J. Cell. Biol. 191, 169-185 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.

Testy inwazji na Matrigelu tradycyjnie przeprowadzano poprzez umieszczenie komórek na warstwie białek macierzy zewnątrzkomórkowej, gdzie motywność indukowana chemoatraktantem kierowała je w stronę filtra znajdującego się na dnie i przez niego. Stopień inwazyjności oceniano na podstawie liczby komórek policzonych na spodniej stronie filtra. Choć w praktyce różnica w porównaniu z opisanym powyżej „odwróconym” testem inwazji jest niewielka, wizualizacja komórek inwazyjnych podczas ich przemieszczania się w górę i przez Matr...

<table><tbody><tr><td>DMEM (podłoże Eagle modyfikowane przez Dulbecco&amp;rsquo;&amp;rsquo;)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21969</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>PAA Laboratories</td><td>A15-101</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-glutamina (100x)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25050-032</td><td></td></tr><tr><td>Puromycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>0.05% trypsyna EDTA</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AL-118</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Transwell 6.5mm, rozmiar porów 8.0 &amp;mu;m</td><td>Corning</td><td>3422</td><td></td></tr><tr><td>Complete Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Invitrogen</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>RNaza</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP2MP</td><td></td></tr></tbody></table>

modelowanie i obrazowanie trójwymiarowej zbiorowej inwazji komórek

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

Kluczową cechą złośliwości nowotworu jest inwazja i przerzutowanie 1W niektórych nowotworach (np.gglejak 2), miejscowa inwazja do otaczających zdrowych tkanek jest główną przyczyną choroby i zgonu. W przypadku innych nowotworów (np.gpierś, płuco, itp..), to proces przerzutowania, w którym komórki nowotworowe przemieszczają się z pierwotnej masy guza, kolonizują odległe miejsca i ostatecznie przyczyniają się do niewydolności narządów, co w konsekwencji prowadzi do zachorowalności i śmiertelności 3Szacuje się, że inwazja i przerzuty odpowiadają za 90% zgonów z powodu nowotworów. 4W rezultacie pojawiło się ogromne zainteresowanie identyfikacją procesów molekularnych oraz kluczowych białkowych mediatorów inwazji i przerzutowania w celu usprawnienia diagnostyki i leczenia. 5.
Wyzwaniem dla naukowców zajmujących się nowotworami jest opracowanie testów inwazji, które w wystarczającym stopniu przypominają sytuację in vivo, aby umożliwić dokładne modelowanie choroby 6. Dwuwymiarowe testy motywności komórek dostarczają informacji tylko o jednym aspekcie inwazji i nie uwzględniają przebudowy białek macierzy pozakomórkowej (ECM), która również jest kluczowym elementem. Niedawne badania doprecyzowały naszą wiedzę na temat inwazji komórek nowotworowych i wykazały, że poszczególne komórki mogą przemieszczać się w trybie wydłużonym lub zaokrąglonym 7. Ponadto większą wagę przywiązano do roli inwazji zbiorczej, w której komórki naciekają w postaci pasm, płatów i skupisk, szczególnie w nowotworach wysoko zróżnicowanych, zachowujących cechy nabłonkowe, w rozprzestrzenianiu się raka 8.
Przedstawiamy udoskonaloną metodę 9 badania wpływu białek kandydackich na inwazję zbiorczą 10. W szczególności, poprzez zaprojektowanie oddzielnych pul komórek eksprymujących różne białka fluorescencyjne, możliwe jest molekularne rozdzielenie aktywności i białek wymaganych w komórkach prowadzących w porównaniu z tymi wymaganymi w komórkach podążających. Zastosowanie RNAi dostarcza narzędzi molekularnych do eksperymentalnego rozbicia procesów zaangażowanych w inwazję pojedynczych komórek, jak również w różnych pozycjach inwazji zbiorczej. W tej procedurze mieszaniny komórek znakowanych fluorescencyjnie wysiewa się na dno wkładki Transwell, którą wcześniej wypełniono białkiem ECM Matrigel, a następnie pozwala się im na inwazję „w górę” przez filtr do wnętrza Matrigelu. Rekonstrukcja stosów obrazów z serii z, uzyskanych za pomocą obrazowania konfokalnego, w reprezentacje trójwymiarowe pozwala na wizualizację zbiorczo inwadujących pasm oraz analizę rozmieszczenia komórek znakowanych fluorescencyjnie w pozycjach prowadzących w stosunku do podążających.

Modele inwazji komórek nowotworowych do trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej lepiej odzwierciedlają sytuację in vivo niż dwuwymiarowe testy motylości. Dzięki zastosowaniu testów inwazji do macierzy w połączeniu z obrazowaniem konfokalnym komórek znakowanych fluorescencyjnie można uzyskać szczegółowe informacje na temat trybów inwazji oraz odrębnego wkładu komórek prowadzących i podążających.

Modelowanie i obrazowanie trójwymiarowej zbiorowej inwazji komórek

Określającą cechą złośliwości nowotworu jest naciekanie i przerzutowanie 1. W niektórych nowotworach (np. w glejakach 2) lokalne naciekanie do otaczających zdrowych...

Celem niniejszego układu eksperymentalnego jest charakterystyka udziału konkretnych białek w procesie inwazji. Należy rozpocząć od transdukcji retrowirusowej komórek z zastosowaniem interesującego nas białka fluorescencyjnego. Należy również utworzyć trójwymiarową macierz białka matrigel w insertach transwell oraz przygotować zawiesinę komórkową o odpowiednim rozcieńczeniu.Wykorzystując system transwell z Matrigelem, należy zmierzyć odpowiedź transmigracyjną na chemoatraktant w obecności badanych leków lub preparatów, a następnie przejść do wizualizacji i analizy inwazji komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej. Ostatecznie wyniki te pozwalają określić skalę i sposób inwazji komórek w trójwymiarową macierz białkową. Przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak tradycyjny test inwazji Transwell, jest możliwość uzyskania danych zarówno ilościowych, jak i jakościowych na temat inwazji komórek w trójwymiarową macierz białkową.Moja współpracowniczka, Diane Creighton, zaprezentuje teraz metodę hodowli komórek pakujących retrowirusy w DMEM zawierającym 10% FBS przez 48 godzin. Następnie należy przeprowadzić transfekcję komórek DNA retrowirusowym zgodnie z instrukcjami producenta. Po inkubacji przez 24 godziny studzienki należy dwukrotnie wypłukać medium, a następnie dodać 1.5 milliliters 10% FBS-DMEM na studzienkę i inkubować przez 48 godzin w celu zebrania spakowanego retrowirusa.Przenieś pożywkę do hodowli tkankowych do probówek do mikrocentryfugi o pojemności dwóch mililitrów, odwiruj w celu osadzenia komórek i zbierz nadsącz do czystej probówki. Przechowuj ten zapas retrowirusa w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby przeprowadzić transdukcję retrowirusową komórek, usuń pożywkę z hodowli inkubowanej przez noc i dodaj jeden mililitr zapasu retrowirusa z dodatkiem poly green.Po sześciogodzinnej inkubacji do dołka należy dodać 2 mL 10% F-B-S-D-M-E-M, a następnie umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C. W ciągu nocy należy uzupełnić pożywkę, a po 24 godzinach dodać odpowiednią pożywkę selekcyjną; po osiągnięciu konfluencji należy zebrać komórki i przeprowadzić sortowanie pod kątem fluorescencji, używając komórek nietransdukowanych jako referencji. Należy wyizolować komórki o fluorescencji wyższej niż w przypadku komórek nietransdukowanych i zamrozić alikwoty w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.Metoda ta opiera się na ekspresji białek fluorescencyjnych w celu wizualizacji i pozwala na okreśenie wkładu poszczególnych komórek. Rozmrozić Matrigel na lodzie, a następnie rozcieńczyć w stosunku jeden do jednego w lodowatym PBS. Teraz umieścić niepowlekane transwelle w 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej.Następnie ostrożnie pipetuj 100 µL rozcieńczonego matri gel do dołków i pozostaw do stężenia w temperaturze 37 °C. W międzyczasie przygotuj zawiesiny komórek znakowanych fluorescencyjnie w ich standardowej pożywce wzrostowej. Po stężeniu matri gel odwróć transwelle i pipetuj 100 µL zawiesiny komórek na skierowaną w dół stronę wylotową filtra.Ostrożnie przykryj transwellle dnem 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej, tak aby stykała się ona z każdą kroplą zawiesiny komórkowej. Inkubuj płytkę w pozycji odwróconej przez cztery godziny, aby umożliwić adhezję komórek. Następnie odwróć płytki do pozycji prawidłowej i przemyj każdy transwell, zanurzając go dwukrotnie w 1 mL medium bezsurowiczego.Następnie umieść transwell w trzecim dołku zawierającym leki lub odczynniki terapeutyczne. Ostrożnie nanieś pipetą 100 µL medium zawierającego chemoatraktant do transwellu, na powierzchnię zestalonej mieszaniny matrigelu i PBS. Inkubuj przez trzy do pięciu dni w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2, aby zobrazować niefluorescencyjne komórki naciekające Matrigel.Umieścić transwellle w nowych płytkach 24-dołkowych i nanieść pipetą 1 mL 4 µM roztworu Calcein AM na wierzch każdej wkładki z Matrigelu, pozwalając mu spłynąć po bokach i barwić próbkę od góry oraz od dołu. Inkubować przez godzinę w temperaturze 37 °C w uwilgotnionej atmosferze zawierającej 5% CO2. Następnie wykonać obrazowanie za pomocą mikroskopii konfokalnej.Ta pierwsza metoda barwienia stylu życia pozwala na wizualizację trybów inwazji. Przenieś każdy transwell na nową płytkę 24-dołkową, nałóż 1 mL 4%paraform aldehydu i 0,2%triton X 100, a następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez pół godziny. Po trzykrotnym przemyciu 1 mL PBS dodaj RNAs A na 30 minut, a następnie przemyj dwukrotnie PBS w celu wizualizacji w stężeniu 0,01 mg/mL.Jodek propidyny rozcieńczono w PBS i pozostawiono w temperaturze pokojowej w ciemności na 30 minut. Przemyto trzy razy PBS. Na tym etapie transwell w barwniku z jodkiem propidyny można przechowywać w temperaturze pokojowej w ciemności przez co najmniej miesiąc.Druga metoda barwienia komórek wymaga utrwalenia, ale pozwala na szybszą kwantyfikację inwazji. Używając odwróconego mikroskopu konfokalnego, umieść transwell z niewielką ilością pozostałego PBS na dużym szkiełku nakrywnym, stosując obiektyw 20x bez imersji, a następnie wykonaj przekroje optyczne co 10 do 15 mikronów od dołu zatyczki z Matrigelu. Określ stopień inwazji, analizując poszczególne przekroje optyczne. Stwórz również obiekty trójwymiarowe przy użyciu odpowiedniego oprogramowania, takiego jak Velocity, na podstawie wspomnianej serii przekrojów optycznych. Komórki zabarwiono za pomocą calcium AM.Zgodnie z oczekiwaniami, liczba komórek migrujących w górę z filtra zmniejsza się wraz z odległością. Inwazję tę można poddać kwantyfikacji. Trójwymiarowe rekonstrukcje inwazji komórkowej zapewniają wizualne przedstawienie sposobu tej inwazji.Jeśli komórki zostaną oznakowane poprzez ekspresję białek fluorescencyjnych, pozycje komórek każdego koloru można zwizualizować w rekonstrukcjach trójwymiarowych, jak pokazano na tym widoku z boku. Ponadto przekroje przez rekonstrukcję mogą dostarczyć informacji na temat mechanizmów molekularnych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat tego, jak wykorzystać ten test inwazji komórkowej, aby uzyskać więcej informacji o procesie ucieczki, niż jest to możliwe przy zastosowaniu standardowych metod.

modeling-and-imaging-3-dimensional-collective-cell-invasion

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Modelowanie i obrazowanie 3-wymiarowej inwazji komórkowej

Przepływ płynu śródmiąższowego jest zwiększony w guzach litych i może modulować inwazję komórek nowotworowych. W niniejszej pracy opisujemy technikę nakładania przepływu płynu śródmiąższowego na komórki zatopione w macierzy, a następnie pomiaru jego wpływu na inwazję komórek. Technika ta może być łatwo zaadaptowana do badania innych układów.

Trójwymiarowy model hodowli komórkowej do pomiaru wpływu przepływu płynu śródmiąższowego na inwazję komórek nowotworowych

Źródło: Guyon, J., et al. Model sferoidalny 3D glejaka. J. Vis. Exp. (2020)Film demonstruje generowanie trójwymiarowego sferoidalnego modelu inwazji komórek nowotworowych. Sferoidy są tworzone z ludzkich komórek nowotworowych mózgu i osadzone w macierzy kolagenowej. Komórki nowotworowe na obrzeżach sferoidy przyjmują fenotyp inwazyjny, wydzielając proteazy w celu degradacji kolagenu i posuwając się do inwazji na otaczającą macierz.

Generowanie trójwymiarowego sferoidalnego modelu inwazji komórek nowotworowych

Ten artykuł przedstawia metodę fluorescencyjnego znakowania kolagenu, która może być dalej wykorzystywana zarówno do obrazowania na żywo, jak i do obrazowania na żywo kultur komórkowych 3D. Zapewniamy również zoptymalizowany protokół wizualizacji endogennych białek cytoszkieletu komórek hodowanych w środowiskach 3D.

Odkrywanie organizacji cytoszkieletu inwazyjnych komórek nowotworowych w 3D

Ten artykuł zawiera szczegółowe metodologie wykorzystania testów trójwymiarowych (3D) do ilościowego określenia inwazji komórek raka piersi. W szczególności omawiamy procedury wymagane do skonfigurowania, takie jak testy, kwantyfikacja i analiza danych, a także metody badania utraty integralności błony, która ma miejsce podczas inwazji komórek.

Kwantyfikacja inwazyjności komórek raka piersi za pomocą modelu trójwymiarowego (3D)

Ta metoda ocenia inwazję komórek rakowych ze sferoid na otaczającą matrycę 3D.  Sferoidy są generowane metodą hodowli wiszącej kropli, a następnie osadzane w matrycy składającej się z materiałów błonowych i kolagenu typu I.  Inwazja sferoid jest następnie monitorowana.

Test sferoidalny komórek rakowych do oceny inwazji w warunkach 3D

Ten protokół opisuje odwrócony test inwazji pionowej, który może być użyty do ilościowego określenia zdolności migracji i inwazji komórek w trójwymiarowym otoczeniu, przy jednoczesnym zachowaniu mikrośrodowiska komórki. Ten test jest odpowiedni dla rzadkich i/lub wrażliwych komórek.

Ruch w górę: prosty i elastyczny protokół trójwymiarowego testu inwazyjnego in vitro

Procesy rządzące inwazją raka pęcherza moczowego stanowią okazję do rozwoju biomarkerów i terapii. Poniżej przedstawiamy model inwazji raka pęcherza moczowego, który obejmuje hodowlę 3D sferoid guza, obrazowanie poklatkowe i mikroskopię konfokalną. Technika ta jest przydatna do definiowania cech procesu inwazyjnego oraz do badań przesiewowych środków terapeutycznych.

System hodowli komórkowych 3D do badania inwazji i oceny terapii w raku pęcherza moczowego

Obecny protokół opisuje zintegrowaną metodę badania migracji i inwazji komórek rakowych na jednej platformie w czasie rzeczywistym, zapewniając łatwą do odtworzenia i efektywną czasowo opcję badania mobilności i morfologii komórek.

Prosty przepływ pracy migracji/inwazji przy użyciu zautomatyzowanego imagera Live Cell

Mikrośrodowisko guza jest istotną częścią wzrostu i inwazji raka. Aby naśladować postęp raka, potrzebna jest biologicznie istotna ludzka matryca. Protokół ten wprowadza ulepszenie trójwymiarowego testu inwazji sferoidalnej in vitro poprzez zastosowanie ludzkiej matrycy opartej na mięśniaku gładkokomórkowym. Protokół wprowadza również komputerową analizę inwazji komórek.

W pełni ludzka matryca oparta na guzie w trójwymiarowym teście inwazji sferoidów

Prezentowany tutaj jest protokół produkcji urządzenia do obrazowania sferoidowego. Urządzenie to umożliwia dynamiczne lub podłużne obrazowanie fluorescencyjne sferoid komórek nowotworowych. Protokół oferuje również prostą procedurę przetwarzania obrazu do analizy inwazji komórek rakowych.

Czasowo-rozdzielcze obrazowanie fluorescencyjne i analiza inwazji komórek nowotworowych w modelu sferoidalnym 3D

Inwazja jest głównym zjawiskiem biologicznym w rozwoju i postępie raka. Na proces ten mają wpływ komórki nienowotworowe i składniki mikrośrodowiska guza. Celem pracy jest opisanie alternatywnej metody analizy inwazji komórek nowotworowych in vitro z wykorzystaniem kultur trójwymiarowych (3D).

Alternatywna strategia analizy inwazji komórek in vitro w kulturach 3D

Poznaj technikę modelowania inwazji komórek nowotworowych w trójwymiarowej macierzy białkowej Matrigel przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Ta metoda pozwala uzyskać ilościowe i jakościowe dane o zachowaniu komórek prowadzących i podążających.

Modelowanie i obrazowanie trójwymiarowej zbiorowej inwazji komórek

Przeglądaj więcej filmów