Modelowanie i obrazowanie trójwymiarowej zbiorowej inwazji komórek

Celem niniejszego układu eksperymentalnego jest charakterystyka wkładu konkretnych białek w proces inwazji. Należy rozpocząć od transdukcji retrowirusowej komórek z wykorzystaniem odpowiedniego białka fluorescencyjnego. Należy również wytworzyć macierz 3D z białka matrigel w insertach transwell oraz przygotować zawiesinę komórek o odpowiednim rozcieńczeniu.

Wykorzystując system transwell z Matrigelem, należy zmierzyć odpowiedź transmigracyjną na chemoatraktant w obecności badanych leków lub preparatów, a następnie przystąpić do wizualizacji i analizy inwazji komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej. W efekcie wyniki mogą określić skalę i sposób inwazji komórek w trójwymiarową macierz białkową. Przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak tradycyjny test inwazji Transwell, jest możliwość uzyskania zarówno danych ilościowych, jak i jakościowych dotyczących inwazji komórek w trójwymiarową macierz białkową.

Moja współpracowniczka, Diane Creighton, zademonstruje teraz metodę hodowli komórek pakujących retrowirusy w DMEM zawierającym 10%FBS przez 48 godzin. Należy przeprowadzić transfekcję komórek retrowirusowym DNA zgodnie z instrukcjami producenta. Po inkubacji przez 24 godziny studzienki należy dwukrotnie wypłukać medium, a następnie dodać 1,5 milliliters 10%FBS-DMEM na studzienkę i inkubować przez 48 godzin w celu zebrania zapakowanych retrowirusów.

Przenieść pożywkę do hodowli tkankowej do probówek do mikrocentryfugi o pojemności dwóch mililitrów, odwirować w celu osadzenia komórek, a następnie zebrać nadsącz do czystej probówki. Przechowywać ten zapas retrowirusa w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby przeprowadzić transdukcję retrowirusową komórek, usunąć pożywkę z kultury inkubowanej przez noc i dodać jeden mililitr zapasu retrowirusa z dodatkiem poly green.

Po sześciogodzinnej inkubacji do dołka należy dodać 2 mL 10% F-B-S-D-M-E-M i umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C. W nocy należy uzupełnić medium, a po 24 h dodać odpowiednie medium selekcyjne; po osiągnięciu konfluencji należy zebrać komórki i przeprowadzić sortowanie pod kątem fluorescencji, używając komórek nietransdukowanych jako referencji. Należy zebrać komórki o fluorescencji wyższej niż w przypadku komórek nietransdukowanych i zamrozić alikwoty w temperaturze -80 °C do późniejszego użycia.

Metoda ta opiera się na ekspresji białek fluorescencyjnych w celu wizualizacji i pozwala na określenie wkładu poszczególnych komórek. Rozmrozić Matrigel na lodzie, a następnie rozcieńczyć w stosunku 1:1 w lodowatym PBS. Następnie umieścić niepowlekane inserty transwell w 24-dołkowej płytce do hodowli tkanek.

Następnie ostrożnie pipetuj 100 µL rozcieńczonego Matrigelu do dołków i pozostaw do zestalenia w temperaturze 37 °C. W tym czasie przygotuj zawiesiny komórek znakowanych fluorescencyjnie w ich standardowej pożywce wzrostowej. Po zestaleniu Matrigelu odwróć transwell i pipetuj 100 µL zawiesiny komórek na dolną stronę filtra, skierowaną w stronę wylotu.

Ostrożnie przykryj transwell-e dnem 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej, tak aby stykała się ona z każdą kroplą zawiesiny komórek. Inkubuj płytkę w pozycji odwróconej przez cztery godziny, aby umożliwić adhezję komórek. Następnie odwróć płytki do pozycji prawidłowej i przemyj każdy transwell, zanurzając go dwukrotnie w jednym mililitrze pożywki bez surowicy.

Następnie umieść transwell w trzecim dołku zawierającym odpowiednie leki lub odczynniki terapeutyczne. Ostrożnie nanieś pipetą 100 µL medium zawierającego chemoatraktant do transwellu, na powierzchnię zastygłej mieszaniny matrigelu i PBS. Inkubuj przez trzy do pięciu dni w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2, aby obrazować niefluorescencyjne komórki naciekające Matrigel.

Umieść transwelllowe wkładniki w nowych płytkach 24-dołkowych i pipetuj 1 mL 4 µM roztworu Calcium AM na każdy zatyczek z Matrigel, pozwalając mu spłynąć po bokach i zabarwić próbkę od góry i od dołu. Inkubuj przez godzinę w temperaturze 37 °C w uwilgotnionej atmosferze zawierającej 5% CO2. Następnie wykonaj obrazowanie za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Ta pierwsza metoda barwienia obrazująca styl życia pozwala na wizualizację trybów inwazji. Przenieś każdy transwell na nową płytkę 24-dołkową, nałóż 1 mL 4% paraformaldehydu i 0,2% Triton X 100, a następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez pół godziny. Po trzykrotnym przemyciu 1 mL PBS dodaj RNase A w stężeniu 0,01 mg/mL na 30 minut, a następnie przemyj dwukrotnie PBS w celu wizualizacji.

Jodek propidyny należy rozcieńczyć w PBS i pozostawić w temperaturze pokojowej w ciemności na 30 minut. Następnie należy przemyć próbki trzykrotnie za pomocą PBS. Na tym etapie transwellowe inserty z barwieniem jodkiem propidyny można przechowywać w temperaturze pokojowej w ciemności przez co najmniej miesiąc.

Druga metoda barwienia komórek wymaga fiksacji, ale umożliwia szybszą kwantyfikację inwazji. Przy użyciu odwróconego mikroskopu konfokalnego należy umieścić transwell z niewielką ilością pozostałego PBS na dużym szkiełku nakrywkowym, użyć obiektywu 20x bez imersji i rejestrować przekroje optyczne co 10 do 15 mikronów od spodu wtyczki z Matrigelu. Stopień inwazji należy określić ilościowo, analizując poszczególne warstwy optyczne. Należy również stworzyć obiekty trójwymiarowe przy użyciu odpowiedniego oprogramowania, takiego jak Velocity, na podstawie wspomnianej serii przekrojów optycznych; komórki zabarwiono Calcium AM.

Zgodnie z oczekiwaniami, liczba komórek naciekających w górę z filtra zmniejsza się wraz z odległością. Inwazję tę można poddać kwantyfikacji. Trójwymiarowe rekonstrukcje inwazji komórkowej oferują wizualne przedstawienie sposobu naciekania.

Jeśli komórki są znakowane ekspresją białek fluorescencyjnych, pozycje komórek każdego koloru można zwizualizować w rekonstrukcjach trójwymiarowych, jak pokazano na tym widoku z boku. Ponadto przekroje przez rekonstrukcję mogą dostarczyć informacji na temat mechanizmów molekularnych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak wykorzystać ten test inwazji komórkowej, aby uzyskać więcej informacji o procesie ucieczki, niż jest to możliwe przy użyciu standardowych metod.