Name: Dymorfizm płci mięśni szkieletowych z proteomiki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Poznaj metodę analizy proteomicznej mięśni szkieletowych u myszy w celu identyfikacji różnic ekspresji białek między płciami. Technika ta wykorzystuje dwuwymiarową elektroforezę żelową i spektrometrię masową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Yutian Gan za udostępnienie Ryciny 3. Praca ta była wspierana przez National Science Foundation 0420971; fundusze Blakeslee, Wilens i Holmes w Smith College oraz Howard Hughes Medical Institute.

1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Jako materiał wyjściowy należy wykorzystać świeżą, zamrożoną błyskawicznie lub potraktowaną preparatem RNAlater tkankę mysią. Przed przystąpieniem do dalszych prac należy odsączyć nadmiar konserwantu za pomocą chusteczki Kimwipe.</li>
	<li>Usunąć wszystkie ścięgna i powięzi wokół mięśnia, a następnie rozdrobnić tkankę za pomocą jednokrawędziowych żyletek przez 2 min na schłodzonych szklanych płytkach w pomieszczeniu chłodniczym (4°C), aż tkanka zostanie dobrze rozdrobniona lub uzyska postać proszku. Próbkę zebrać do uprzednio zważonej probówki do wirówki i określić masę tkanki. Jako materiał wyjściowy należy użyć nie więcej niż 10 mg tkanki.</li>
	<li>W temperaturze pokojowej dodać 45 μL buforu do ekstrakcji (8 M mocznika, 50 mM DTT, 4% CHAPS, 0,2% amfolitów nośnikowych 5/8, 0,0002% błękitu bromofenolowego) na 1 mg rozdrobnionej tkanki. Jeśli objętość przekracza 350 μL, należy początkowo dodać 350 μL i homogenizować (krok 1.4), a następnie dodać resztę buforu, aby zminimalizować rozpryskiwanie.</li>
	<li>Homogenizować tkankę siedem razy za pomocą zmechanizowanego tłuczka (Kontes Corp) przez 15 sekund w temperaturze 4°C, z dwuminutowym chłodzeniem na lodzie pomiędzy każdą homogenizacją.</li>
	<li>Próbki wirować przy 15 600 x g przez 30 minut w temperaturze 4°C. Zebrać nadsącz i zmierzyć jego objętość. Osad z debris komórkowych należy odrzucić.</li>
	<li>Wytrącić białka z nadsączu za pomocą lodowatego acetonu czystości reagentowej (stosunek objętościowy 3:1). Mieszać próbki na wirówce Vortex przez 15 sekund. Wirować przy 15 600 x g przez 10 sekund w celu utworzenia osadu, a następnie resuspendować w buforze do ekstrakcji przy użyciu silnika Kontes i polipropylenowych prętów mieszających (BioSpec Prod).</li>
	<li>Powtórzyć krok 1.6.</li>
	<li>Przejść do oznaczania stężenia białek w próbkach lub przechowywać je w temperaturze -20°C.</li>
</ol>
2. Oznaczanie stężenia białka
Należy zastosować metodę Lowry'ego7 lub metodę BCA8 (Pierce); dążyć do uzyskania stężenia około 4.5 mg ml-1.
3. Fokusowanie izoelektryczne
<ol>
	<li>Wyjąć pasek IPG ReadyStrip (11 cm, pH 5-8, Bio-Rad) z temperatury -20°C i pozostawić do wyrównania temperatury w RT przez 10-15 min.</li>
	<li>Zamieszać próbkę w wirówce typu vortex i nanieść pipetą 600-800 μg (całkowita objętość 200 μL) próbki białka w linii prostej przy tylnej krawędzi kanału w kuwecie do rehydratacji próbek, pozostawiając około 1 cm wolnego miejsca na każdym końcu.</li>
	<li>Używając pęsety, zdjąć plastikową osłonę paska IPG – należy chwytać pasek wyłącznie za końce i unikać kontaktu z żelem. Zidentyfikować koniec zasadowy paska i umieścić go po lewej stronie kuwety. Położyć pasek IPG stroną z żelem do dołu na próbce, unikając uwięzienia pęcherzyków powietrza pod spodem. Pozostawić do rehydratacji na jedną godzinę.</li>
	<li>Przykryć 2,5 mL oleju mineralnego (BioRad). Przykryć kuwetę pokrywką i pozostawić do rehydratacji przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umieścić knot papierowy na obu końcach kanału kuwety do ogniskowania i zwilżyć każdy z nich 10 μL wody Millipore.</li>
	<li>Wyjąć pasek IPG i trzymać go pionowo przez około 10 sekund, aby odlać olej. Osuszyć plastikową podkładkę za pomocą chusteczki Kimwipe.</li>
	<li>Umieścić pasek IPG stroną z żelem do dołu, z końcem zasadowym po lewej stronie, w kuwecie do ogniskowania. Przykryć pasek 2,5 mL oleju mineralnego.</li>
	<li>Umieścić kuwetę w komorze PROTEAN IEF (Bio-Rad) i zaprogramować 3-stopniowy protokół (Tabela 1) przy domyślnej temperaturze komory 20°C, maksymalnym natężeniu prądu 50 μA/pasek i bez czasu rehydratacji.
	<table border="1">
		<tbody>
			<tr>
				<td> </td>
				<td>Napięcie</td>
				<td>Czas</td>
				<td>Wolto-godziny</td>
				<td>Rampa</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>Krok 1</td>
				<td>250</td>
				<td>20 min</td>
				<td> </td>
				<td>Liniowa</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>Krok 2</td>
				<td>8,000</td>
				<td>2,5 h</td>
				<td> </td>
				<td>Liniowa</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>Krok 3</td>
				<td>8,000</td>
				<td> </td>
				<td>40,000</td>
				<td>Szybka</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>Suma</td>
				<td> </td>
				<td>6,5 h</td>
				<td>40,000</td>
				<td> </td>
			</tr>
		</tbody>
	</table>
	 Tabela 1. Trzystopniowy protokół komory PROTEAN IEF dla pasków IPG 11 cm.</li>
	<li>Wyjąć paski IPG z komory IEF za pomocą pęsety. Osuszyć plastikową podkładkę chusteczką Kimwipe i umieścić pasek IPG stroną z żelem do góry w czystej kuwecie do rehydratacji. Można przykryć kuwetę do rehydratacji, owinąć ją folią spożywczą i przechowywać w -80°C lub kontynuować procedurę.</li>
</ol>
4. Elektroforeza białek w żelu poliakrylamidowym w obecności SDS
<ol>
	<li>Przenieś pasek (stroną z żelem do góry) do 11-centymetrowej kuwety do równoważenia.</li>
	<li>Do kanału należy dodać 4 ml buforu redukującego (mocznik 6 M, SDS 2%, Tris/HCl 0,05 M pH 8,8, glicerol 20%, DTT 2%) i inkubować pasek przez 10 min przy łagodnym wstrząsaniu w celu osiągnięcia stanu równowagi.</li>
	<li>Usunąć bufor redukujący, dodać 4 ml buforu do alkilacji (mocznik 6 M, SDS 2%, Tris/HCl 0,05 M pH 8,8, glicerol 20%, jodoacetamid 2,5%) i inkubować pasek przez 10 minut przy łagodnym wstrząsaniu w celu wyrównania stężeń.</li>
	<li>Opłucz pasek IPG, zanurzając go krótko w 1X buforze do elektroforezy SDS (25 mM Tris, 192 mM glicyny, 0,1% SDS, pH 8,2).</li>
	<li>Połóż pasek stroną żelu do góry na tylnej płytce 11-centymetrowego gotowego żelu poliakryloamidowego Criterion SDS Tris-HCl o stężeniu 10,5%–14% (Bio-Rad) i delikatnie dociśnij go, aby zapewnić pełny kontakt z żelem SDS; upewnij się, że pomiędzy powierzchniami żeli nie pozostały pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Przykryj pasek IPG 1 ml stopionego roztworu agarozy (0,5% agarozy, 25 mM Tris, 192 mM glicyny, 0,1% SDS, błękit bromofenolowy) i pozostaw agarozę do stężenia przez 5 minut.</li>
	<li>Załaduj 5 μL znacznika białek 10-225 kDa (USB, P/N: 76740) do pojedynczej studzienki jako standardów masy cząsteczkowej.</li>
	<li>Przeprowadź elektroforezę żelu w buforze SDS (25 mM Tris, 192 mM glicyny, 0,1% SDS, pH 8,2) przy napięciu 200 V w temperaturze pokojowej lub w pomieszczeniu chłodniczym (4°C) monitorując elektroforezę za pomocą migracji czoła barwnika błękitu bromofenolowego.</li>
	<li>Wyjmij żel z plastikowej formy i barw przez noc, delikatnie wstrząsając w barwniku Coomassie Brilliant Blue R-250 (45,5% metanolu, 45,5% dH2O, 9,0% kwasu octowego, 0,25% Coomassie Brilliant Blue R-250).</li>
	<li>Wstrząśnij żel w roztworze do odbarwiania Destain 1 (45,5% metanolu, 45,5% dH2O, 9,0% kwas octowy) dwukrotnie po 3 godziny, a następnie w roztworze Destain 2 (5% metanol, 90% dH2O)2(O, 5% kwas octowy) przez noc. Żel przechowywać w 7% kwasie octowym do czasu analizy.</li>
</ol>
5. Obrazowanie i analiza żelu
<ol>
	<li>Należy wykonać obrazy żeli za pomocą programu Quantity One obsługującego system obrazowania VersaDoc (BioRad). Obszary obrazów dla wszystkich żeli w eksperymencie należy przyciąć w jednolity sposób.</li>
	<li>Przycięte obrazy należy wczytać do programu PDQuest 8.0 w celu utworzenia zestawu eksperymentalnego. Należy postępować zgodnie z kreatorem konfiguracji eksperymentu (Experiment setup wizard), aby zdefiniować parametry detekcji plamek oraz dopasowania plamek pomiędzy żelami. W razie potrzeby wyniki dopasowania plamek należy sprawdzić i skorygować ręcznie.</li>
	<li>Należy przeprowadzić analizę ilościową i statystyczną żeli w celu wykrycia dopasowanych plamek białkowych, wykazujących dwukrotną lub wyższą statystycznie istotną różnicę w ekspresji pomiędzy dwiema grupami żeli. Z plamek tych należy utworzyć zestaw analizy, a następnie wyciąć je za pomocą wycinarki plamek EXQuest (BioRad) w celu przeprowadzenia trawienia trypsyną i identyfikacji białek metodą LC-MS.</li>
</ol>
6. Trawienie trypsynowe w żelu
W tym kroku zastosowano zmodyfikowany protokół z zestawu Pierce In-Gel Tryptic Digest Kit (#89871X, Pierce).
<ol>
	<li>Do wycinków żelu dodać 200 μL roztworu odbarwiającego (25 mM wodorowęglanu amonu, 50% acetonitrylu). Przemieszać na wirówce typu vortex i inkubować próbki w temperaturze 37°C przez 30 minut z wytrząsaniem. Ostrożnie usunąć i odrzucić roztwór.</li>
	<li>Powtórzyć krok 6.1.</li>
	<li>Do probówek zawierających wycinki żelu dodać 30 μL świeżo przygotowanego buforu redukującego (50 mM Tris[2-karboksyetylo]fosfiny, 22,5 mM wodorowęglanu amonu) i inkubować w temperaturze 60°C przez 10 minut.</li>
	<li>Pozostawić próbki do ostygnięcia, a następnie usunąć i odrzucić bufor redukujący.</li>
	<li>Dodać 30 μL buforu alkilującego (100 mM jodoacetamidu, 20 mM wodorowęglanu amonu, przygotowanego bezpośrednio przed użyciem w probówkach owiniętych folią aluminiową). Inkubować próbki w ciemności w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Usunąć i odrzucić bufor alkilujący. Przemyć wycinki żelu, dodając do każdej probówki 200 μL roztworu odbarwiającego. Inkubować próbki w temperaturze 37°C przez 15 minut.</li>
	<li>Usunąć i odrzucić roztwór odbarwiający i powtórzyć płukanie.</li>
	<li>Do wycinków żelu dodać 50 μL acetonitrylu i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby uległy skurczeniu i wysuszeniu, a następnie ostrożnie usunąć acetonitryl.</li>
	<li>Powtórzyć krok 6.8 jeszcze raz. Fragmenty żelu powinny być białe i małe.</li>
	<li>Pozostawić fragmenty żelu do wyschnięcia w koncentratorze Centrivap (Labconco, model EX1245) przez 10 minut.</li>
	<li>Napęcznieć fragmenty żelu, dodając 10 μL roztworu aktywowanej trypsyny (10 ng/μL trypsyny, 25 mM wodorowęglanu amonu). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Do probówek dodać 25 μL buforu trawiennego (25 mM wodorowęglanu amonu). Inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez noc z wytrząsaniem.</li>
	<li>Sonicować próbki przez 10 minut (Branson, sonikator kąpielowy model 2510) i odwiruwać przed przeniesieniem supernatantu do nowej probówki. Zachować supernatant.</li>
	<li>Aby dodatkowo wyekstrahować peptydy, dodać 10 μL 0,1% kwasu mrówkowego i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem. Sonicować próbki przez 10 minut, zebrać supernatant i połączyć go z supernatantem zachowanym w kroku 6.13.</li>
</ol>
7. Mikroskalowe odsalanie ekstraktów peptydowych
<ol>
	<li>Usunąć wodorowęglan amonu oraz inne sole z ekstraktów peptydowych za pomocą kolumienek PepClean C-18 Spin Columns (ThermoFisher) zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Wyeluować peptydy dwukrotnie, używając 20 μL 70% acetonitrylu, odparować próbki do suchości w koncentratorze Centrivap przez 1 godzinę, a następnie ponownie zawiesić peptydy w 10 μL 0,1% kwasu mrówkowego do analizy MS.</li>
</ol>
8. Identyfikacja białek za pomocą spektrometrii mas sprzężonej z HPLC
<ol>
	<li>Rozdziel 5 μL mieszaniny peptydów za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) w czasie 40 minut, stosując liniowy gradient acetonitrylu 2-50% z 0,2% kwasem mrówkowym na monolitycznej kolumnie Pepswift PS-DVB (Dionex) sprzężonej ze źródłem Nanospray I i pułapką jonową spektrometru mas (LCQ Deca XP Max, Thermo Fisher Scientific) przy szybkości przepływu 400 nL/min na końcówce.</li>
	<li>Wykrywaj sygnały MS1 peptydów w zakresie 400 - 1400 m/z i izoluj 3 najintensywniejsze piki jonowe w celu sekwencjonowania MS2 metodą CID z zastosowaniem dynamicznej ekskluzji.</li>
	<li>W celu identyfikacji białek przeanalizuj wyniki peptydowe poprzez przeszukanie mysiej bazy referencyjnej Sequest (oprogramowanie BioWorks, Thermo-Fisher Scientific) z uwzględnieniem statycznej modyfikacji alkilowanej cysteiny oraz modyfikacji dynamicznych dla fosforylacji (seryna, treonina, tyrozyna), metylacji (histydyna), utleniania (metionina), ADP-rybozylowania (arginina) i acetylacji N-końca. Zastosuj konserwatywne kryteria dopasowania (np. tolerancja peptydów ustawiona na 2 AMU i tolerancja fragmentów na 1,00, białka zawierające co najmniej 2 peptydy przechodzące przez filtr Xcorr vs Charge State [z=1/x=1,5, z=2/x=2,00, z=3/x=2,50, z=4/x=3,00] oraz prawdopodobieństwo p &lt; 0,05)5 i dokonaj ręcznej inspekcji widm MS w celu pewnej identyfikacji białek.</li>
</ol>
9. Reprezentatywne wyniki:
Wyizolowano mięśnie szkieletowe (biceps brachii) od niećwiczących samców i samic myszy, a następnie rozdzielono je na mapie dwuwymiarowej5, stanowiącej pierwszy poziom porównawczego proteomu mięśniowego (rycina 2). Po wizualizacji przy użyciu cyfrowego obrazowania o wysokiej rozdzielczości w każdym przypadku wykryto około 800 plamek białkowych. Przyjmując mapę proteomu samca jako punkt odniesienia, wyraźnie widać liczne plamki, których obfitość zmienia się w proteomie samicy. Intensywność plamek jest miarą zmiany ilości białek (rycina 3). Tożsamość plamek białkowych, których obfitość zmieniła się ponad dwukrotnie (wzrost lub spadek) i które są istotne statystycznie (p &lt; 0,05) przy n=5 myszy, określono poprzez analizę sekwencji aminokwasów z wykorzystaniem chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas. Wyniki te wskazują, że u samic obserwuje się spadek obfitości enzymów metabolizmu energetycznego cukrów oraz izoform enzymu kinazy kreatynowej (CK), który stanowi odmienny system dostarczania energii w mięśniach. Zarówno u ludzi, jak i u zwierząt stwierdza się wyższe poziomy CK w surowicy samców w spoczynku oraz po wysiłku fizycznym9,10, jednak poziomy CK w surowicy nie muszą korelować z zakresem uszkodzeń miofibrylarnych11,12. Ten dymorfizm płciowy w komórkowej obfitości CK w mięśniu biceps brachii myszy jest nowym odkryciem5 i może wyjaśniać fizjologiczne różnice w poziomach CK w surowicy.
Ryciny:
<img alt="Schemat identyfikacji białek: przygotowanie próbek, analiza, chromatografia, spektrometria mas, eksploracja danych." src="/files/ftp_upload/3536/3536fig1.jpg" data-altupdatedat="1788840098000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Ogólny schemat protokołu dla proteomiki porównawczej. Protokół jest podzielony na trzy grupy: przygotowanie próbek, analizę próbek oraz identyfikację białek. Końce każdej z tych trzech grup protokołów stanowią odpowiednie miejsca na przerwy, choć najlepsze wyniki uzyskuje się, gdy cały protokół jest przeprowadzany bez przerywania.
<img alt="Analiza białek mięśnia dwugłowego ramienia myszy, wyniki elektroforezy 2D, porównanie mięśni samców i samic." src="/files/ftp_upload/3536/3536fig2.jpg" data-altupdatedat="1788840098000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Porównanie plamek białkowych z mięśnia dwugłowego ramienia samic myszy w odniesieniu do identycznych plamek w mięśniu dwugłowym ramienia samców (zielone okręgi o). Plamki, których intensywność u samic wzrosła dwukrotnie lub więcej, obokreślono na czerwono (o), a plamki, których intensywność spadła dwukrotnie lub bardziej, obokreślono na niebiesko (o).
<img alt="Analiza regresji liniowej; wykres rozrzutu, dopasowanie danych, trend statystyczny, wykres edukacyjny." src="/files/ftp_upload/3536/3536fig3.jpg" data-altupdatedat="1788840098000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Analiza intensywności plam żelu: oś X, samice przed ćwiczeniami (kontrola, n=5); oś Y, grupa samic w punkcie czasowym 0 h po pojedynczej serii ćwiczeń (n=5). Linia regresji: współczynnik korelacji = 0,919; nachylenie = 0,976; punkt przecięcia = -0,0293. Plamy powyżej czerwonej linii i poniżej niebieskiej linii wykazują zmianę większą niż +/- dwukrotność.

<ol><li>Fehrenbach, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFehrenbach%2C+E+%22Molecular+and+Cellular+Exercise+Physiology%22">Molecular and Cellular Exercise Physiology</a>. Mooren, F. C., Völker, K. , Human Kinetics. New York. 199-217 (2005).</li>
<li>Mooren, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Exercise+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Cell.</a> Molecular and Cellular Exercise Physiology. Mooren, F. C., Völker, K. , Human Kinetics. New York. 3-18 (2005).</li>
<li>Thompson, H. S., Clarkson, P. M., Scordilis, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+repeated+bout+effect+and+heat+shock+proteins%3A+intra-muscular+HSP27+and+HSP70+expression+following+two+bouts+of+eccentric+exercise+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Physiol.+Scand%22%5BJournal%5D)">The repeated bout effect and heat shock proteins: intra-muscular HSP27 and HSP70 expression following two bouts of eccentric exercise in humans.</a> Acta. Physiol. Scand. 174, 47-56 (2002).</li>
<li>McHugh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+understanding+of+the+repeated+bout+effect%3A+the+protective+effect+against+muscle+damage+from+a+single+bout+of+eccentric+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Med.+Sci.+Sports%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the understanding of the repeated bout effect: the protective effect against muscle damage from a single bout of eccentric exercise.</a> Scand. J. Med. Sci. Sports. 13, 88-97 (2003).</li>
<li>Metskas, L. A., Kulp, M., Scordilis, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+Dimorphism+in+the+Exercise-Na%C3%AFve+Murine+Skeletal+Muscle+Proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Molec.+Biol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Gender Dimorphism in the Exercise-Naïve Murine Skeletal Muscle Proteome.</a> Cell Molec. Biol. Lett. 15, 507-516 (2010).</li>
<li>Lopez, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+electrophoresis+in+proteome+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional electrophoresis in proteome expression analysis.</a> J. Chromatogr. B. 849, 190-202 (2007).</li>
<li>Lowry, O. H., Rosenburg, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951).</li>
<li>Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, M. D., Fujimoto, E. K., Goeke, N. M., Olson, B. J., Klenk, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Protein+Using+Bicinchoninic+Acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Norton, J. P., Clarkson, P. M., Graves, J. E., Litchfield, P. L., Kirwan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+creatine+kinase+activity+and+body+composition+in+males+and+females%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Biol%22%5BJournal%5D)">Serum creatine kinase activity and body composition in males and females.</a> Hum. Biol. 57, 591-598 (1985).</li>
<li>Amelink, G. J., Kamp, H. H., Bär, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creatine+kinase+isoenzyme+profiles+after+exercise+in+the+rat%3A+sex-linked+differences+in+leakage+of+CK-MM%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers.+Arch%22%5BJournal%5D)">Creatine kinase isoenzyme profiles after exercise in the rat: sex-linked differences in leakage of CK-MM.</a> Pflügers. Arch. 412, 417-421 (1988).</li>
<li>Kendall, B., Eston, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-induced+muscle+damage+and+the+potential+protective+role+of+estrogen%5BTitle%5D)+AND+%22Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Exercise-induced muscle damage and the potential protective role of estrogen.</a> Sports Med. 32 (2), 103-123 (2002).</li>
<li>Tiidus, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+oestrogen+influence+skeletal+muscle+damage%2C+inflammation%2C+and+repair%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Can oestrogen influence skeletal muscle damage, inflammation, and repair?</a> Br. J. Sports Med. 39, 251-253 (2005).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Przedstawiona tutaj metoda proteomiki LC/MS stanowi wysoce niezawodny i powtarzalny protokół do szybkiej analizy pierwszego poziomu proteomu mięśni szkieletowych. Pozwala ona na stosunkowo sprawną analizę porównawczą specyfiki płciowej. Białka o niskiej zawartości wymagałyby frakcjonowania próbki mięśnia w celu usunięcia jak największej ilości białek kurczliwych, co zwiększyłoby stężenie białek o niskiej zawartości. Dostosowanie profilu proteomu można osiągnąć, stosując paski IPG o różnym zakresie pH oraz żele gradientowe o innym procencie, jeśli jest to pożądane. Istnieją bardziej czułe barwniki fluorescencyjne, jednak zalecamy, aby każde laboratorium samodzielnie określiło liniowość tych barwników w swoim systemie. Do bardziej rygorystycznej analizy ekspresji białek można zastosować system DIGE (system dwuwymiarowej elektroforezy w żelu, GE Healthcare Life Sciences), jednak wprowadza to dodatkowy poziom złożoności metodologii. Ponadto opisany tutaj protokół można zastosować do większości tkanek zwierzęcych, dla których zsekwencjonowano genom, a także do sekwencjonowania de novo białek z dowolnego źródła, o ile można je rozdzielić na żelu dwuwymiarowym, ponieważ poza trypsyną można generować nakładające się fragmenty enzymatyczne przy użyciu enzymów o wysokiej czystości. Próbki z innych źródeł tkankowych mogą wymagać pewnych zmian w metodologii ekstrakcji, zwłaszcza w przypadku poszukiwania białek błonowych i hydrofobowych, niemniej jednak uzyskaliśmy dobre wyniki stosując ten protokół w tkankach serca, wątroby, nerek i mózgu. Inne modyfikacje potranslacyjne można wykryć poprzez zmianę kryteriów wyszukiwania w bazie danych widma masowego. Podsumowując, przedstawiliśmy stosunkowo szczegółowy wstępny protokół analizy profilowania proteomu.

<table><tbody><tr><td>Kolumny do spinowania PepClean C-18</td><td>Produkt zużywalny</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>PI-89870</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna monolityczna Pepswift (100um x 5 cm)</td><td>Produkt zużywalny</td><td>Dionex</td><td>162348</td><td></td></tr><tr><td>Gotowe żele poliakryloamidowe SDS Criterion pre-cast 10,5%-14% Tris-HCl</td><td>Produkt zużywalny</td><td>Bio-Rad</td><td>345-0106</td><td></td></tr><tr><td>Paski IPG Readystrip</td><td>Produkt zużywalny</td><td>Bio-Rad</td><td>Różne zakresy pH</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>A465-1</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Odczynnik</td><td>Pharmco Products, Inc.</td><td>329000</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Odczynnik</td><td>Bio-Rad</td><td>163-2111</td><td>Roztwór&lt;br/&gt; nakładczy</td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu</td><td>Odczynnik</td><td>Fluka</td><td>40867</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP114</td><td></td></tr><tr><td>Amfolity Bio-Lyte</td><td>Odczynnik</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Różne zakresy pH&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Odczynnik</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>13361</td><td></td></tr><tr><td>Błękit Coomassie R-250</td><td>Odczynnik</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Odczynnik</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>15395</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Odczynnik</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Odczynnik</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>16407</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Odczynnik</td><td>Bio-Rad</td><td>163-2129</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6026</td><td></td></tr><tr><td>Tris (zasada)</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93349</td><td></td></tr><tr><td>Fosfina Tris[2-karb&amp;#8211;oksyetylu]</td><td>Odczynnik</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>77720</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna endoproteinaza, traktowana TPCK, stopień MS</td><td>Odczynnik</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>90055</td><td>modyfikowana</td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Odczynnik</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>75826</td><td></td></tr><tr><td>Woda</td><td>Odczynnik</td><td>Burdick &amp;amp; Jackson</td><td>365</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator Centrivap</td><td>Narzędzie</td><td>Labconco Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wytnijnik plamek Exquest</td><td>Narzędzie</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pułapkowa spektrometr mas LCQ Deca XP Max</td><td>Narzędzie</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zmotoryzowany tłuczek</td><td>Narzędzie</td><td>Kontes Corp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polipropylenowe pręty</td><td>Narzędzie</td><td>Biospec Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mieszające</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komora IEF PROTEAN</td><td>Narzędzie</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonikator</td><td>Narzędzie</td><td>Branson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System HPLC Surveyor Plus</td><td>Narzędzie</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania VersaDoc</td><td>Narzędzie</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dymorfizm płciowy mięśni szkieletowych w ujęciu proteomicznym

Skeletal Muscle Gender Dimorphism from Proteomics

Ogólny skurcz mięśnia szkieletowego jest determinowany przede wszystkim przez stosunkowo niewielką liczbę białek kurczliwych, jednak tkanka ta jest również niezwykle podatna na czynniki środowiskowe1, takie jak hipertrofia wywołana ćwiczeniami oporowymi oraz zanik wynikający z nieużywania. Wykazuje ona zatem remodeling i adaptacje do stresorów (ciepła, niedokrwienia, metali ciężkich itp.)2,3. Uszkodzenia mięśni mogą powstać w wyniku wywierania siły podczas wydłużania mięśnia, co określa się mianem skurczu ekscentrycznego4. Białka kurczliwe mogą ulec uszkodzeniu podczas takich wysiłków i wymagają naprawy, degradacji i/lub resyntezy; funkcje te nie są domeną białek kurczliwych, lecz innych, znacznie mniej licznych białek w komórce. Aby ustalić, jaka podgrupa białek bierze udział w łagodzeniu tego typu uszkodzeń, należy opracować globalny proteom przed wysiłkiem5, a następnie monitorować go po ćwiczeniach, aby określić różnicową ekspresję białek i w ten sposób wyróżnić białka kandydackie uczestniczące w adaptacjach do uszkodzeń i ich naprawie. Ponadto większość badań nad mięśniami szkieletowymi była prowadzona na osobnikach płci męskiej, w związku z czym mogą one nie być reprezentatywne dla mięśni osobników płci żeńskiej.
W niniejszym artykule przedstawiamy metodę powtarzalnej ekstrakcji białek z mięśni samców i samic oraz ich rozdzielania za pomocą dwuwymiarowej elektroforezy żelowej z następującym obrazowaniem cyfrowym o wysokiej rozdzielczości6. Zapewnia ona protokół dla plamek (i następnie zidentyfikowanych białek), które wykazują statystycznie istotny (p &lt; 0,05) dwukrotny wzrost lub spadek, pojawiają się lub znikają w stosunku do stanu kontrolnego. Są one następnie wycinane, trawione trypsyną i rozdzielane za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrem mas (LC/MS) w celu identyfikacji białek (LC/MS/MS)5. Metodologia ta (Rysunek 1) może być stosowana w wielu tkankach przy niewielkich lub żadnych modyfikacjach (wątroba, mózg, serce itp.).

Prosty zestaw metod izolacji i identyfikacji najliczniej występujących białek ekspresjonowanych w mięśniach szkieletowych. Na żelu dwuwymiarowym z 10 mg mięśnia można wyróżnić około 800 plamek, co umożliwia określenie specyficznej dla płci ekspresji białek. Metody te dają porównywalne wyniki w większości tkanek.

Dymorfizm płciowy mięśni szkieletowych w ujęciu proteomicznym

Całkowity skurcz mięśni szkieletowych jest determinowany przede wszystkim przez stosunkowo niewielką liczbę białek kurczliwych, jednak tkanka ta jest również niezwykle ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie specyfiki płciowej różnic w profilach proteomowych mięśni szkieletowych. Cel ten osiąga się poprzez wstępne posiekanie i dokładną homogenizację tkanek mięśnia dwugłowego ramienia myszy samców i samic w celu wyekstrahowania większości białek. Następnie próbkę nanosi się na pasek żelu IEF, gdzie białka są rozdzielane na podstawie ich punktu izoelektrycznego, a w kolejnym kroku przeprowadza się elektroforezę SDS-PAGE, czyli rozdzielanie w drugim wymiarze według wielkości. Po zabarwieniu i obrazowaniu żeli porównuje się profile proteomiczne próbek mięśni samców i samic, a następnie wycina plamki wykazujące istotne różnice w obfitości między obiema płciami.Na koniec białka w wycinkach żelu poddaje się trawieniu trypsyną. Powstałe peptydy są ekstrahowane z żelu i poddawane analizie z wykorzystaniem nanociekłej chromatografii i spektrometrii mas w celu ich identyfikacji. W rezultacie, dzięki dwuwymiarowej elektroforezie żelowej i proteomice opartej na spektrometrii mas, można uzyskać wyniki wykazujące różnicową ekspresję białek w dwóch lub więcej warunkach eksperymentalnych.Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat specyfiki płciowej mięśni, można ją również zastosować do innych komórek, tkanek, organów lub płynów w różnych stanach fizjologicznych. Procedurę zaprezentuje dr Kalina Diva, dyrektor techniczna Center for Proteomics w Smith College. Po wyizolowaniu, oczyszczeniu i posiekaniu mięśnia szkieletowego myszy w 45 µL buforu ekstrakcyjnego na gram tkanki (przepis tego oraz wszystkich pozostałych buforów znajduje się w protokole pisemnym), należy za pomocą zmotorowego tłuczka homogenizować tkankę siedmiokrotnie po 15 sekund w temperaturze 4 °C, z zachowaniem dwuminutowych przerw na chłodzenie w lodzie pomiędzy kolejnymi homogenizacjami.Odwiruj próbki przy 15 800 Gs przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zbierz supernatant i zmierz jego objętość. Usuń osad, aby wytrącić białka w trzech objętościach lodu.Zimny aceton klasy reagentowej w objętości odpowiadającej objętości supernatantu. Mieszaj probówki na vortexie przez 15 sekund, a następnie odwiruj przy 15 800 Gs przez 10 sekund w celu sformowania osadów. Odlej supernatant, a osady zawiesić ponownie w buforze do ekstrakcji za pomocą zmechanizowanego tłuczka i polipropylenowych prętów mieszających; wytrąć białka po raz drugi, dodając kolejne trzy objętości acetonu.Po resuspensji osadu w buforze do ekstrakcji należy oznaczyć stężenie białka i/lub przechowywać próbki w temperaturze -20 °C. Aby przeprowadzić elektroforezę izoelektryczną białek, wyjmij gotową pasku IPG z zamrażarki o temperaturze -20 °C i pozostaw go na 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej, aby osiągnął równowagę termiczną. Próbkę należy wymieszać w wortexie, a następnie nanieść pipetą od 600 do 800 µg białka w linii prostej przy tylnej krawędzi kanału w kuwecie do rehydratacji próbek, pozostawiając około jednego centymetra odstępu od każdego końca.Używając pęsety, zdejmij plastikową osłonkę z paska IPG, pamiętając, aby trzymać pasek wyłącznie za końce i unikać kontaktu z żelem. Zidentyfikuj koniec paska oznaczony jako dodatni i umieść go po lewej stronie tacki. Połóż pasek IPG stroną z żelem na próbce.Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza pod spodem. Pozostawić do rehydratacji na jedną godzinę. Przykryć pasek 2.5 milliliters oleju mineralnego.Przykryj tace pokrywką i pozostaw do rehydratacji przez noc. Następnego dnia, w temperaturze pokojowej, umieść knoty papierowe na obu końcach kanału skupiającego tacy i zwilż każdy z nich 10 µL wody Millipore. Wyjmij pasek IPG i trzymaj go pionowo przez około 10 sekund.Aby odsączyć olej, osusz plastikową podkładkę za pomocą chusteczki Kimwipe. Umieść pasek IPG stroną z żelem do dołu, kierując koniec zasadowy w lewą stronę. W kuwecie do ogniskowania pokryj pasek 2,5 milliliters oleju mineralnego.Umieść tace w komorze do IEF protean i zaprogramuj trzyetapowy protokół przy domyślnej temperaturze komory 20 °C, maksymalnym natężeniu prądu 50 µA na pasek oraz bez czasu rehydratacji. Po zakończeniu programu przenieś pasek gelem do góry do 11 cm tacy do równoważenia. Dodaj 4 mL buforu redukującego do kanału i równoważ pasek przez 10 minut przy łagodnym wstrząsaniu.Usunąć bufor redukcyjny, dodać cztery mililitry buforu do alkilacji do kanału i równoważyć pasek, wstrząsając go przez kolejne 10 minut. Przepłukać pasek IPG, krótko zanurzając go w buforze do elektroforezy 1X SDS. Następnie położyć pasek stroną żelową do góry na płycie tylnej urządzenia criterion 11 centymetrów.Przygotuj gotowy żel poliakrylamidowy 10,5–14% tris-HCl-SDS i delikatnie dociśnij go, aby zapewnić pełny kontakt z żelem SDS. Upewnij się, że między powierzchniami obu żeli nie pozostały pęcherzyki powietrza. Przykryj pasek IPG jednym mililitrem płynnego roztworu agarozy i pozostaw do zastygnięcia na pięć minut.Następnie nanieś 5 µL markera białek do pojedynczej studzienki. Prowadź elektroforezę żelu w buforze SDS przy napięciu 200 V w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C. Gdy czoło barwnika dotrze do dolnej krawędzi żelu, wyjmij go z plastikowej formy i barwi go przez noc, delikatnie wstrząsając w roztworze Coomassie Brilliant Blue.Wstrząsaj żel w roztworze do odbarwiania nr 1 dwukrotnie przez trzy godziny każdy raz, a następnie w roztworze do odbarwiania nr 2 przez noc. Przechowuj żel w 7% kwasie octowym do czasu analizy. Po obrazowaniu żelu przeprowadź analizę porównawczą wzorców plamek pomiędzy żelami i wytnij plamki interesujące badacza; do wycinków żelowych dodaj 200 µL roztworu do odbarwiania, wymieszaj w wortexie i inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez 30 minut przy ciągłym wstrząsaniu.Następnie ostrożnie usunąć i wylać roztwór, a następnie powtórzyć czynność. Do probówek zawierających fragmenty żelu dodać 30 µL świeżo przygotowanego buforu redukującego i inkubować w temperaturze 60 °C przez 10 minut. Pozostawić próbki do ostygnięcia.Następnie usunąć i odrzucić bufor. Dodać 30 µL buforu do alkilacji i inkubować próbki w ciemności w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, po czym usunąć i odrzucić bufor do alkilacji. Przemyć fragmenty żelu, dodając 200 µL roztworu do odbarwiania do każdej probówki, a następnie inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez 15 minut.Usunąć i wylać roztwór odbarczający, a następnie powtórzyć przemywanie. Następnie dodać 50 µL acetonitrylu do fragmentów żelu i inkubować je przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby doprowadzić do ich wysuszenia przez skurczenie. Następnie ostrożnie usunąć acetonitryl i powtórzyć procedurę dla fragmentów żelu.Kawałki żelu powinny być białe i małe. Pozostaw kawałki żelu do wyschnięcia w wirówce do odparowywania na 10 minut. Napęcznij kawałki żelu, dodając 10 µL roztworu aktywnej trypsyny.Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Do probówek dodać 25 µL buforu do trawienia. Próbki inkubować w temperaturze pokojowej przez noc z wytrząsaniem, następnie poddać sonicacji przez 10 minut i odwirować przed przeniesieniem supernatantu do nowej probówki.Aby przeprowadzić dalszą ekstrakcję peptydów, dodaj 10 µL 0,1% kwasu mrówkowego do wkładów i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej przy potrząsaniu, a następnie poddaj próbki sonikacji przez 10 minut. Zbierz nadsącz i połącz go z wcześniej zachowanym nadsączem. Białka można następnie odsolić i przygotować do spektrometrii mas sprzężonej z HPLC; wyekstrahowano mięsień szkieletowy z lustrzanych tkanek od niećwiczonych samców i samic, a następnie rozdzielono go na mapie dwuwymiarowej.Na pierwszym poziomie komparatywnego proteomu mięśni, po wizualizacji za pomocą cyfrowego obrazowania o wysokiej rozdzielczości, w każdym z nich wykryto około 800 plamek białkowych, co przedstawiono tutaj. Przyjmując mapę proteomu samców jako punkt odniesienia, wyraźnie widać liczne plamki, których obfitość zmienia się w proteomie samic; plamki, których poziom w organizmach samic wzrósł dwukrotnie lub więcej, zostały obwiedzione na czerwono, natomiast te, których poziom spadł dwukrotnie lub więcej, obwiedziono na niebiesko. Tożsamość plamek białkowych, których obfitość zmieniła się ponad dwukrotnie w górę lub w dół i które są istotne statystycznie przy próbie N wynoszącej pięć myszy, została określona poprzez analizę sekwencji aminokwasów przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas.Na tym wykresie oś X reprezentuje myszy żeńskie przed wysiłkiem, a oś Y reprezentuje grupę w punkcie czasowym zero godzin po pojedynczej serii ćwiczeń. Wyniki pokazują, że u samic występuje znaczny spadek metabolizmu energii z cukrów, aktywności enzymów oraz izoform enzymu kinazy kreatynowej, co wskazuje na inny system dostarczania energii w mięśniach. Zarówno u ludzi, jak i u zwierząt obserwuje się wyższe poziomy CK w surowicy u samców w spoczynku oraz po wysiłku, jednak poziomy CK w surowicy niekoniecznie korelują z ilością miofibryl.Ten dymorfizm płciowy w komórkowej liczebności CK w mięśniu dwugłowym ramienia u myszy jest nowym odkryciem i może wyjaśniać fizjologiczne różnice w poziomach CK w surowicy. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak ilościowy immunoblotting, w celu weryfikacji wyników. Po obejrzeniu tego filmu powinniśmy posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak przygotować i rozdzielić próbki do różnicowego profilowania proteomu.

skeletal-muscle-gender-dimorphism-from-proteomics

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Dymorfizm Płciowy Mięśni Szkieletowych z Proteomiki

Technika mikrodysekcji eksplantów jest solidną i niezawodną metodą izolacji proliferujących komórek mięśni szkieletowych z mięśni młodocianych, dorosłych lub embrionalnych w celu pozyskania macierzystych komórek mięśni szkieletowych. Wyjątkowo komórki te zostały wyprowadzone klonalnie, co pozwoliło na stworzenie linii macierzystych komórek mięśni szkieletowych wykorzystywanych do transplantacji in vivo.

Kultura mikroeksplantów szkieletowych mięśni dorosłych i embrionalnych oraz izolacja komórek macierzystych mięśni szkieletowych

Ten film demonstruje technikę przezskórnej biopsji mięśnia obszernego bocznego człowieka przy użyciu konchotomu Weila-Blakesleya.

Biopsja mięśni szkieletowych mięśnia obszernego bocznego człowieka przy użyciu konchotomu Weila-Blakesleya

MyoD to miogenny czynnik transkrypcyjny o dużej zdolności do indukowania miogennego transdyferencjacji wielu w pełni zróżnicowanych linii komórkowych niezwiązanych z mięśniami. Mechanizmy epigenetyczne zaangażowane w tę transdyferencjację są w dużej mierze nieznane. Tutaj opisujemy metodę oczyszczania z podwójnym powinowactwem, a następnie spektrometrię mas, aby wyczerpująco scharakteryzować partnerów MyoD.

Identyfikacja interaktomii MyoD za pomocą tandemowego oczyszczania powinowactwa sprzężonego ze spektrometrią mas

Tutaj prezentujemy protokół do szybkich analiz włókien mięśniowych, który pozwala na poprawę jakości barwienia, a tym samym na automatyczne pozyskiwanie i kwantyfikację populacji włókien za pomocą swobodnie dostępnego oprogramowania ImageJ.

Szybki zautomatyzowany protokół analizy populacji włókien mięśniowych w przekrojach poprzecznych mięśni szczurów przy użyciu immunohistochemii łańcuchów ciężkich miozyny

Immunohistochemiczne barwienie izoform łańcucha ciężkiego miozyny stało się najnowocześniejszym dyskryminatorem włókien mięśni szkieletowych typu (tj. typu I, typu IIA, typu IIX, typu IIB). W tym miejscu przedstawiamy protokół barwienia wraz z nowatorskim półautomatycznym algorytmem, który ułatwia szybką ocenę rodzaju włókien i morfologii włókien.

Półautomatyczna analiza morfologii mięśni szkieletowych myszy i składu włókien

Mięsień lotu Drosophila to potężny model do badania regulacji transkrypcji, alternatywnego splicingu, metabolizmu i mechanobiologii. Przedstawiamy protokół preparacji znakowanych fluorescencyjnie mięśni lotnych z żywych poczwarek w celu wygenerowania wysoce wzbogaconych próbek, idealnych do proteomiki i głębokiego sekwencjonowania. Próbki te mogą dostarczyć ważnych mechanistycznych wglądów w różne aspekty rozwoju mięśni.

Sekcja mięśni lotu Drosophila melanogaster dla podejść omicznych

Coraz więcej dowodów wskazuje, że nadmierna infiltracja lipidów wewnątrz mięśni szkieletowych prowadzi do lipotoksyczności i cukrzycy. Tutaj przedstawiamy kompletny protokół, w tym przetwarzanie tkanek, barwienie za pomocą Bodipy, akwizycję obrazu i analizę, w celu ilościowego określenia wielkości, gęstości i subkomórkowego rozkładu kropelek lipidów w sposób specyficzny dla rodzaju włókna.

Analiza zawartości kropelek lipidów w mięśniach szkieletowych pod kątem rodzaju włókien i subkomórek

Drosophila to sprawdzony model do badania kluczowych cząsteczek regulujących miogenezę. Jednak obecne metody są niewystarczające do określenia dynamiki transkrypcji mRNA i dystrybucji przestrzennej w obrębie syncytii. Aby rozwiązać ten problem, zoptymalizowaliśmy metodę hybrydyzacji in situ fluorescencji RNA, która umożliwia wykrywanie i kwantyfikację mRNA w skali pojedynczej cząsteczki.

Badanie dynamiki transkrypcji mięśni w skalach jednocząsteczkowych u Drosophila

Ten protokół demonstruje izolację pojedynczego włókna z liofilizowanych ludzkich mięśni szkieletowych i klasyfikację typów włókien według izoformy ciężkiego łańcucha miozyny (MHC) przy użyciu techniki kropkowania. Zidentyfikowane próbki włókien MHC I i II mogą być następnie dalej analizowane pod kątem specyficznych dla rodzaju błonnika różnic w ekspresji białek przy użyciu western blotting.

Identyfikacja rodzaju włókien ludzkich mięśni szkieletowych

Opisujemy protokół uzyskiwania enzymatycznie zdysocjowanych włókien o różnych długościach i typach z sześciu mięśni dorosłych myszy: trzy z nich już opisane (zginacz palca krótkiego, prostownik palca długiego, płaszczkowaty) i trzy z nich pomyślnie zdysocjowane po raz pierwszy (prostownik palucha długiego, mięsień długi długi, peroneus digiti quarti).

Nienaruszone krótkie, pośrednie i długie włókna mięśni szkieletowych uzyskane w wyniku enzymatycznej dysocjacji sześciu mięśni kończyn tylnych myszy: poza zginaczem digitorum brevis

Ten protokół wykorzystuje mikrotomografię komputerową, aby umożliwić ekonomiczną kwantyfikację beztłuszczowej masy, w tym mięśni szkieletowych i tkanki trzewnej, tkanki tłuszczowej i tkanki szkieletowej u małych zwierząt. Rozróżnia tkankę beztłuszczową i tłuszczową, co daje znaczące korzyści w badaniach biomedycznych, szczególnie w badaniach translacyjnych na małych zwierzętach.

Nieinwazyjna kwantyfikacja mięśni szkieletowych u małych zwierząt za pomocą mikrotomografii komputerowej

Poznaj metodę analizy proteomicznej mięśni szkieletowych u myszy w celu identyfikacji różnic ekspresji białek między płciami. Technika ta wykorzystuje dwuwymiarową elektroforezę żelową i spektrometrię masową.

Dymorfizm płciowy mięśni szkieletowych w ujęciu proteomicznym

Przeglądaj więcej filmów