Dymorfizm płciowy mięśni szkieletowych w ujęciu proteomicznym

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie specyfiki płciowej różnic w profilach proteomowych mięśni szkieletowych. Cel ten osiąga się poprzez wstępne posiekanie i dokładną homogenizację tkanek mięśnia dwugłowego ramienia myszy samców i samic w celu wyekstrahowania większości białek. Następnie próbkę nanosi się na pasek żelu IEF, gdzie białka są rozdzielane na podstawie ich punktu izoelektrycznego, a w kolejnym kroku przeprowadza się elektroforezę SDS-PAGE, czyli rozdzielanie w drugim wymiarze według wielkości. Po zabarwieniu i obrazowaniu żeli porównuje się profile proteomiczne próbek mięśni samców i samic, a następnie wycina plamki wykazujące istotne różnice w obfitości między obiema płciami.

Na koniec białka w wycinkach żelu poddaje się trawieniu trypsyną. Powstałe peptydy są ekstrahowane z żelu i poddawane analizie z wykorzystaniem nanociekłej chromatografii i spektrometrii mas w celu ich identyfikacji. W rezultacie, dzięki dwuwymiarowej elektroforezie żelowej i proteomice opartej na spektrometrii mas, można uzyskać wyniki wykazujące różnicową ekspresję białek w dwóch lub więcej warunkach eksperymentalnych.

Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat specyfiki płciowej mięśni, można ją również zastosować do innych komórek, tkanek, organów lub płynów w różnych stanach fizjologicznych. Procedurę zaprezentuje dr Kalina Diva, dyrektor techniczna Center for Proteomics w Smith College. Po wyizolowaniu, oczyszczeniu i posiekaniu mięśnia szkieletowego myszy w 45 µL buforu ekstrakcyjnego na gram tkanki (przepis tego oraz wszystkich pozostałych buforów znajduje się w protokole pisemnym), należy za pomocą zmotorowego tłuczka homogenizować tkankę siedmiokrotnie po 15 sekund w temperaturze 4 °C, z zachowaniem dwuminutowych przerw na chłodzenie w lodzie pomiędzy kolejnymi homogenizacjami.

Odwiruj próbki przy 15 800 Gs przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zbierz supernatant i zmierz jego objętość. Usuń osad, aby wytrącić białka w trzech objętościach lodu.

Zimny aceton klasy reagentowej w objętości odpowiadającej objętości supernatantu. Mieszaj probówki na vortexie przez 15 sekund, a następnie odwiruj przy 15 800 Gs przez 10 sekund w celu sformowania osadów. Odlej supernatant, a osady zawiesić ponownie w buforze do ekstrakcji za pomocą zmechanizowanego tłuczka i polipropylenowych prętów mieszających; wytrąć białka po raz drugi, dodając kolejne trzy objętości acetonu.

Po resuspensji osadu w buforze do ekstrakcji należy oznaczyć stężenie białka i/lub przechowywać próbki w temperaturze -20 °C. Aby przeprowadzić elektroforezę izoelektryczną białek, wyjmij gotową pasku IPG z zamrażarki o temperaturze -20 °C i pozostaw go na 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej, aby osiągnął równowagę termiczną. Próbkę należy wymieszać w wortexie, a następnie nanieść pipetą od 600 do 800 µg białka w linii prostej przy tylnej krawędzi kanału w kuwecie do rehydratacji próbek, pozostawiając około jednego centymetra odstępu od każdego końca.

Używając pęsety, zdejmij plastikową osłonkę z paska IPG, pamiętając, aby trzymać pasek wyłącznie za końce i unikać kontaktu z żelem. Zidentyfikuj koniec paska oznaczony jako dodatni i umieść go po lewej stronie tacki. Połóż pasek IPG stroną z żelem na próbce.

Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza pod spodem. Pozostawić do rehydratacji na jedną godzinę. Przykryć pasek 2.5 milliliters oleju mineralnego.

Przykryj tace pokrywką i pozostaw do rehydratacji przez noc. Następnego dnia, w temperaturze pokojowej, umieść knoty papierowe na obu końcach kanału skupiającego tacy i zwilż każdy z nich 10 µL wody Millipore. Wyjmij pasek IPG i trzymaj go pionowo przez około 10 sekund.

Aby odsączyć olej, osusz plastikową podkładkę za pomocą chusteczki Kimwipe. Umieść pasek IPG stroną z żelem do dołu, kierując koniec zasadowy w lewą stronę. W kuwecie do ogniskowania pokryj pasek 2,5 milliliters oleju mineralnego.

Umieść tace w komorze do IEF protean i zaprogramuj trzyetapowy protokół przy domyślnej temperaturze komory 20 °C, maksymalnym natężeniu prądu 50 µA na pasek oraz bez czasu rehydratacji. Po zakończeniu programu przenieś pasek gelem do góry do 11 cm tacy do równoważenia. Dodaj 4 mL buforu redukującego do kanału i równoważ pasek przez 10 minut przy łagodnym wstrząsaniu.

Usunąć bufor redukcyjny, dodać cztery mililitry buforu do alkilacji do kanału i równoważyć pasek, wstrząsając go przez kolejne 10 minut. Przepłukać pasek IPG, krótko zanurzając go w buforze do elektroforezy 1X SDS. Następnie położyć pasek stroną żelową do góry na płycie tylnej urządzenia criterion 11 centymetrów.

Przygotuj gotowy żel poliakrylamidowy 10,5–14% tris-HCl-SDS i delikatnie dociśnij go, aby zapewnić pełny kontakt z żelem SDS. Upewnij się, że między powierzchniami obu żeli nie pozostały pęcherzyki powietrza. Przykryj pasek IPG jednym mililitrem płynnego roztworu agarozy i pozostaw do zastygnięcia na pięć minut.

Następnie nanieś 5 µL markera białek do pojedynczej studzienki. Prowadź elektroforezę żelu w buforze SDS przy napięciu 200 V w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C. Gdy czoło barwnika dotrze do dolnej krawędzi żelu, wyjmij go z plastikowej formy i barwi go przez noc, delikatnie wstrząsając w roztworze Coomassie Brilliant Blue.

Wstrząsaj żel w roztworze do odbarwiania nr 1 dwukrotnie przez trzy godziny każdy raz, a następnie w roztworze do odbarwiania nr 2 przez noc. Przechowuj żel w 7% kwasie octowym do czasu analizy. Po obrazowaniu żelu przeprowadź analizę porównawczą wzorców plamek pomiędzy żelami i wytnij plamki interesujące badacza; do wycinków żelowych dodaj 200 µL roztworu do odbarwiania, wymieszaj w wortexie i inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez 30 minut przy ciągłym wstrząsaniu.

Następnie ostrożnie usunąć i wylać roztwór, a następnie powtórzyć czynność. Do probówek zawierających fragmenty żelu dodać 30 µL świeżo przygotowanego buforu redukującego i inkubować w temperaturze 60 °C przez 10 minut. Pozostawić próbki do ostygnięcia.

Następnie usunąć i odrzucić bufor. Dodać 30 µL buforu do alkilacji i inkubować próbki w ciemności w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, po czym usunąć i odrzucić bufor do alkilacji. Przemyć fragmenty żelu, dodając 200 µL roztworu do odbarwiania do każdej probówki, a następnie inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez 15 minut.

Usunąć i wylać roztwór odbarczający, a następnie powtórzyć przemywanie. Następnie dodać 50 µL acetonitrylu do fragmentów żelu i inkubować je przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby doprowadzić do ich wysuszenia przez skurczenie. Następnie ostrożnie usunąć acetonitryl i powtórzyć procedurę dla fragmentów żelu.

Kawałki żelu powinny być białe i małe. Pozostaw kawałki żelu do wyschnięcia w wirówce do odparowywania na 10 minut. Napęcznij kawałki żelu, dodając 10 µL roztworu aktywnej trypsyny.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Do probówek dodać 25 µL buforu do trawienia. Próbki inkubować w temperaturze pokojowej przez noc z wytrząsaniem, następnie poddać sonicacji przez 10 minut i odwirować przed przeniesieniem supernatantu do nowej probówki.

Aby przeprowadzić dalszą ekstrakcję peptydów, dodaj 10 µL 0,1% kwasu mrówkowego do wkładów i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej przy potrząsaniu, a następnie poddaj próbki sonikacji przez 10 minut. Zbierz nadsącz i połącz go z wcześniej zachowanym nadsączem. Białka można następnie odsolić i przygotować do spektrometrii mas sprzężonej z HPLC; wyekstrahowano mięsień szkieletowy z lustrzanych tkanek od niećwiczonych samców i samic, a następnie rozdzielono go na mapie dwuwymiarowej.

Na pierwszym poziomie komparatywnego proteomu mięśni, po wizualizacji za pomocą cyfrowego obrazowania o wysokiej rozdzielczości, w każdym z nich wykryto około 800 plamek białkowych, co przedstawiono tutaj. Przyjmując mapę proteomu samców jako punkt odniesienia, wyraźnie widać liczne plamki, których obfitość zmienia się w proteomie samic; plamki, których poziom w organizmach samic wzrósł dwukrotnie lub więcej, zostały obwiedzione na czerwono, natomiast te, których poziom spadł dwukrotnie lub więcej, obwiedziono na niebiesko. Tożsamość plamek białkowych, których obfitość zmieniła się ponad dwukrotnie w górę lub w dół i które są istotne statystycznie przy próbie N wynoszącej pięć myszy, została określona poprzez analizę sekwencji aminokwasów przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas.

Na tym wykresie oś X reprezentuje myszy żeńskie przed wysiłkiem, a oś Y reprezentuje grupę w punkcie czasowym zero godzin po pojedynczej serii ćwiczeń. Wyniki pokazują, że u samic występuje znaczny spadek metabolizmu energii z cukrów, aktywności enzymów oraz izoform enzymu kinazy kreatynowej, co wskazuje na inny system dostarczania energii w mięśniach. Zarówno u ludzi, jak i u zwierząt obserwuje się wyższe poziomy CK w surowicy u samców w spoczynku oraz po wysiłku, jednak poziomy CK w surowicy niekoniecznie korelują z ilością miofibryl.

Ten dymorfizm płciowy w komórkowej liczebności CK w mięśniu dwugłowym ramienia u myszy jest nowym odkryciem i może wyjaśniać fizjologiczne różnice w poziomach CK w surowicy. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak ilościowy immunoblotting, w celu weryfikacji wyników. Po obejrzeniu tego filmu powinniśmy posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak przygotować i rozdzielić próbki do różnicowego profilowania proteomu.