Analiza aktywacji Pak2 za pomocą wymiany wodoru na deuter w wiązaniach amidowych oraz spektrometrii mas MALDI-TOF

Niniejszy eksperyment demonstruje, w jaki sposób wykorzystać spektrometrię mas do monitorowania wymiany wodór-deuter w białku. Zmiany strukturalne prowadzące do stanów aktywacji polegają najpierw na cięciu kinazy białkowej PAC2 za pomocą kaspazy 3, a następnie na aktywacji PAC2 poprzez autofosforylację z użyciem ATP jako substratu. W drugim kroku białko PAC2 poddaje się trawieniu pepsyną, a powstałe fragmenty PAC2 analizuje się za pomocą tandemowej spektrometrii mas. Następnie analizuje się wzorce wymiany wodór-deuter w PAC2 poprzez monitorowanie poziomu deuteru w każdym fragmencie PAC2. Dokładne określenie poziomu wymiany wodór-deuter przy użyciu analizy mold zapewnia istotne informacje na temat cięcia przez kaspazę 3 oraz autofosforylacji PAC2.

Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na pytania dotyczące dynamiki białek, takie jak zmiany konformacyjne białek, oddziaływania białko-ligand oraz oddziaływania białko-białko. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak spektrometria mas LCQ z wymianą HD, jest kwestia instrumentalna. Procedura ta nie wymaga zastosowania spektrometrii mas sprzężonej z HPLC do analizy wyników wymiany HD i jest łatwa w obsłudze w celu rozszczepienia 0.6 µg PAC two.

Dodać kaspazę 3 i inkubować reakcję w temperaturze 34 °C przez 30 minut. Zweryfikować obecność PAC 2 oraz pełne cięcie PAC 2 poprzez analizę produktów metodą SDS-PAGE. W celu przeprowadzenia reakcji aktywacji, dodać rozcięty PAC 2 do 20 µL buforu aktywacyjnego B i inkubować w temperaturze 34 °C przez 30 minut.

Użyj elektroforezy SDS-PAGE, aby potwierdzić autofosforylację poprzez migrację fragmentów P 34 i P 27. Najpierw przemyj kulki agro sprzężone z puryną dwukrotnie 1 ml 0,1% kwasu trifluorooctowego (TFA). Rozcieńcz 2 µL roztworu o stężeniu 10 mg/ml pPak 2 w 100 µL 0,1% TFA, dodaj 30 µL przemytych kulek agro sprzężonych z puryną i inkubuj przez pięć minut.

Następnie należy przeprowadzić równoważenie kolumny H-P-L-C-C 18 w odwróconej fazie przy użyciu 0.1%TFA o pH 2.5. Następnie należy nałożyć Pepin Digest i rozdzielić go, stosując liniowy gradient trwający 100 minut. Frakcje HPLC należy zbierać co dwie minuty po uprzednim ich wysuszeniu za pomocą SpeedVac.

Zawiesić próbki w pięciu µL acetonitrylu i 0,1% TFA przy pH 2,5. W ramach wstępnego przesiewu przeanalizować każdą frakcję pod kątem obecności peptydów za pomocą MALDI dla wszystkich frakcji zawierających peptydy.

Zidentyfikuj fragmenty za pomocą tandemowej spektrometrii mas. Użyj funkcji MS product w programie Protein Prospector, aby dopasować jony potomne do teoretycznych stosunków MZ w oparciu o sekwencję pierwotną PAC two. Najpierw doprowadź wszystkie roztwory i odczynniki do stanu równowagi przed wymianą wodór-deuter.

Rozpocznij wymianę wodoru na deuter poprzez dodanie 18 µL buforu D₂O do 2 µL roztworu o stężeniu 10 mg/mL. Próbkę 2 przygotuj w trzech powtórzeniach w określonym przebiegu czasowym. Przerwij reakcję wymiany wodoru na deuter, dodając 180 µL lodowatego 0,1% TFA o pH 2,2.

Następnie rozdziel 100 µL aliquoty wodoru-deuteru. Przenieś po dwie aliquoty do 30 µL aktywowanych kulek agregatu sprzężonego z pepiną. Inkubuj tę digestię pepiną na lodzie przez pięć minut.

Wstrząsanie w wortexie co 30 sekund skutecznie przerywa reakcje trawienia, a następnie odwirowanie pozwala na szybkie usunięcie Pepinu. Próbki należy zamrozić w ciekłym azocie do czasu analizy. Przygotować matrycę i przechowywać w temperaturze 0 °C, a następnie szybko częściowo rozmrozić każdą próbkę.

Wymieszać 1 µL próbki z 1 µL matrycy, a następnie nanieść na płytkę docelową do MALDI schłodzoną do 4 °C na 30 sekund przed analizą MALDI. Zastosować umiarkowaną próżnię w celu osuszenia plamek. Należy kontynuować pomiar mas MALDI, uśredniając 100 skanów w ciągu dwóch minut.

Należy użyć programu komputerowego Data Explorer 4.0, aby obliczyć czas trwania każdego fragmentu. Następnie należy obliczyć wymianę wsteczną w oparciu o stosunek rzeczywistej inkorporacji po 24 godzinach wymiany wodoru na deuter do wszystkich możliwych miejsc wymiany, którymi są amidy szkieletu, z wyjątkiem amidu terminalnego. W tym przykładzie cięcie i autofosforylacja CASP Bay zostały zweryfikowane za pomocą elektroforezy SDS-PAGE z barwieniem Coomassie.

Niefosforylowana, nieaktywna forma PAC2 tworzy pojedynczy prążek o masie 58 kDa. Rozszczepienie PAC2 jest całkowite i w wyniku autofosforylacji prowadzi do powstania dwóch fragmentów: P27, będącego domeną regulacyjną, oraz P34, będącego domeną katalityczną. Migracja autofosforylowanych fragmentów P27 i P34 wykazuje nakładanie się na żelu białkowym ze względu na spowolnioną migrację w pełni fosforylowanego fragmentu P27 w porównaniu z niefosforylowaną formą PAC2.

Niniejsze widmo masowe przedstawia przebieg czasowy wbudowy deuteru dla nieaktywnego PAC two. Pik m/z 1697,85 składa się z wielu pików izotopowych, co obrazuje przesunięcie obwiedni masowej. Czerwona przerywana linia wskazuje średnią obwiedni masowej w czasie, a przesunięcie obwiedni masowej pokazuje czas trwania obecności peptydu.

Technikę tę można zrealizować w ciągu dwóch dni, jeśli zostanie ona przeprowadzona prawidłowo. Należy pamiętać, że praca z ciekłym azotem może być niezwykle niebezpieczna, dlatego należy podjąć środki ostrożności, takie jak wykonanie otworu w zakrętce probówki EOL 1,5 ml przed umieszczeniem jej w ciekłym azocie.