Name: Wymiana amidowodór/deuter i analiza spektrometrii mas MALDI-TOF aktywacji Pak2 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Odkryj wymianę amidowodoru/deuteru w aktywacji kinazy białkowej Pak2 przy użyciu spektrometrii mas MALDI-TOF. Ta metoda pozwala badać dynamikę strukturalną białek i zmiany konformacyjne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca jest częściowo finansowana z grantu National Institutes of Health GM-26738 (przyznanego J.A.T.).

1. Aktywacja Pak2
<ol>
	<li>Do 20 μl Pak2 o stężeniu 12 mg/ml w buforze A (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl oraz 2 mM DTT przy pH 7,5) dodać odpowiednią, uprzednio przetestowaną ilość kaspazy 3 i inkubować w temperaturze 34 °C przez 30 min, aby całkowicie rozciąć i aktywować Pak2.</li>
	<li>Produkty rozcięcia przeanalizować metodą SDS-PAGE (10 %) i barwienia błękitem Coomassie.</li>
	<li>Rozcięty Pak2 przenieść do buforu aktywacyjnego B (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 15 mM MgCl2, 10 mM ATP) o pH 7,5 w objętości 20 μl do stężenia końcowego 10 mg/ml Pak2, a następnie inkubować w temperaturze 34 °C przez 30 min, aby w pełni aktywować Pak2 poprzez autofosforylację w 8 miejscach.</li>
	<li>Całkowite rozcięcie Pak2 potwierdzić na podstawie migracji fragmentów p34 i p27 w analizie SDS-PAGE10. Prawidłową weryfikację warunków autofosforylacji przeprowadza się w osobnym eksperymencie za pomocą autoradiografii z użyciem (32P)ATP lub spektrometrii mas w celu wykrycia fosfopeptydów.</li>
</ol>
2. Identyfikacja fragmentów Pak2 po trawieniu pepsyną
<ol>
	<li>Dodaj 1 ml 0,1% kwasu trifluorooctowego (TFA) o pH 2,5, aby dwukrotnie przemyć kulki agarozowe przed użyciem. Następnie odwiruj próbki przez 15 s przy 2 000 x g, aby usunąć kulki.</li>
	<li>Dodaj Pak2 (20 μg w 2 μl 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl i 2 mM DTT o pH 7,5) do 100 μl 0,1% TFA i inkubuj próbkę przez 5 min z 30 μl kulki agarozowe sprzężone z pepsyną.</li>
	<li>Urównoważ kolumnę HPLC C18 w odwróconej fazie, stosując główny układ rozpuszczalników składający się z 0,1% TFA o pH 2,5. Trawienie pepsyną (50 μl) jest eluowane przy użyciu liniowego 100-minutowego gradientu 0 - 80% acetonitrylu zawierającego 0,1% TFA przy szybkości przepływu 0,2 ml/min. Frakcje są zbierane co 2 min.</li>
	<li>Osusz frakcje HPLC w wirówce próżniowej (3 h) i resuspenduj próbki w roztworze acetonitrylu (5 μl) i 0,1% TFA (5 μl) o pH 2,5.</li>
	<li>W pierwszej kolejności każdą frakcję przesiewano pod kątem obecności peptydów przy użyciu MALDI-TOF PerSeptive Biosystems Voyager DE STR (PE Biosystems, Foster City, CA, USA).</li>
	<li>16 frakcji zawierających peptydy poddano tandemowej spektrometrii mas z wykorzystaniem spektrometru mas Q-TOF oraz QSTAR XL oMALDI MS/MS w celu identyfikacji fragmentów.</li>
	<li>Sekwencja każdego peptydu została zweryfikowana poprzez porównanie jonów produktowych generowanych w tandemowej spektrometrii mas z teoretycznymi stosunkami m/z na podstawie sekwencji pierwotnej Pak2, korzystając ze strony internetowej Protein Prospector (<a href="http://prospector.ucsf.edu/">http://prospector.ucsf.edu/</a>)11.</li>
</ol>
3. Pomiar wymiany H/D amidowej
<ol>
	<li>Wszystkie roztwory i odczynniki niezbędne do wymiany H/D należy utrzymać w temperaturze 25 °C w łaźni wodnej. ATP rozpuszcza się w wodzie, a przed użyciem dostosowuje pH do 7,0. Dodatkowe 4mM ATP w buforze D2O ma zapobiegać dysocjacji ATP z Pak2 po rozcieńczeniu.</li>
	<li>Wymianę H/D rozpoczyna się poprzez dodanie 18 μl buforowanego D2O (50 mM MOPS pH 6,98, 125 mM NaCl) do 2 μl (20 μg) Pak2 w buforze zawierającym 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) i 2 mM DTT, co daje stężenie Pak2 wynoszące 10 mg/ml i pH 7,0 w temperaturze 0°C.</li>
	<li>Próbki w trzech powtórzeniach inkubuje się w warunkach wymiany H/D przez 0, 0,5, 1, 3, 5 i 10 min lub 24 h.</li>
	<li>Proces wymiany H/D przerywa się (quench) poprzez dodanie 180 μl lodowatego 0,1% TFA o pH 2,2, co obniża pH do 2,5 w końcowej objętości 200 μl. W przypadku próbek zawierających ATP stosuje się 180 μl lodowatego 0,11% TFA o pH 2,2, aby utrzymać pH na poziomie 2,5 w warunkach przerwania reakcji.</li>
	<li>Alikwot (100 μl) każdej zatrzymanej próbki dodaje się do 30 μl aktywowanych kulek agarozowych sprzężonych z pepsyną. Trawienie pepsyną przeprowadza się na lodzie przez pięć min, mieszając próbki w vortexie co 30 s.</li>
	<li>Trawienie kończy się poprzez wirowanie próbki przez 15 s przy 5,000 x g w temperaturze 4 °C w celu usunięcia pepsyny.</li>
	<li>Próbki należy szybko zamrozić w ciekłym N2 i przechowywać w temperaturze -80 °C nie dłużej niż przez 2 dni przed analizą MALDI-TOF.</li>
	<li>Matrycą do MALDI jest 5 mg/ml kwasu α-cyjano-4-hydroksycynnamowego (CHCA) rozpuszczonego w roztworze (1:1:1) acetonitrylu, etanolu i 0,1% TFA o pH 2,5, utrzymywanym w temperaturze 0 °C.</li>
	<li>Każdą próbkę należy szybko częściowo rozmrozić, zmieszać 1 μl próbki z 1 μl matrycy i nanieść na płytkę docelową MALDI w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Na płytkę należy przyłożyć umiarkowaną próżnię, aby wysuszyć plamki w ciągu 30 s przed analizą MALDI-TOF. Czas między rozmrożeniem próbki a uzyskaniem widma wynosi około 3 min.</li>
	<li>Widma mas MALDI-TOF należy zarejestrować za pomocą urządzenia PerSeptive Biosystems Voyager DE STR. Dane należy zbierać przy częstotliwości próbkowania 2 GHz, korzystając ze 100 000 kanałów danych, napięcia przyspieszającego 20 000 V i napięcia siatki 65% z zastosowaniem opóźnionej ekstrakcji z opóźnieniem impulsu 180 ns. Średnią wylicza się ze stu skanów w ciągu 2 min. Instrument MALDI-TOF nie musi być konkretnej marki ani korzystać z określonego oprogramowania.</li>
	<li>Do obliczenia stopnia deuterowania każdego fragmentu należy użyć programu komputerowego Data Explorer 4.0.</li>
	<li>Wymianę zwrotną oblicza się na podstawie stosunku rzeczywistej liczby wbudowanych deuteronów po 24 h wymiany H/D do wszystkich możliwych miejsc wymiany, którymi są amidy szkieletowe z wyjątkiem amidu N-końcowego (Rycina 1).</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
Rozszczepienie przez kaspazę oraz autofosforylację weryfikuje metoda SDS-PAGE z barwieniem Coomassie. Nieaktywne Pak2 tworzy pojedynczy prążek o masie 58 kDa. Rozszczepienie Pak2 przez kaspazę przebiega całkowicie i prowadzi do powstania dwóch fragmentów, p27 i p34, które migrują oddzielnie. Migracja autofosforylowanych fragmentów p27 i p34 wykazuje na żelu nakładanie się ze względu na spowolnioną migrację w pełni fosforylowanego fragmentu p27 (Rysunek 2).
Eksperymenty wymiany H/D prowadzi się wielokrotnie w przedziale od 0 do 10 min (Rysunek 3). Jako przykład, przebieg czasowy wbudowy deuteru w pik m/z 1697,85 nieaktywnego Pak2 składa się z wielu pików izotopowych, co obrazuje przesunięcie obwiedni masy w czasie.
<img alt="Równanie deuterowania fragmentów proteolitycznych; wzór na analizę liczby deuteronów, uwagi eksperymentalne." src="/files/ftp_upload/3602/3602fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1">
Rycina 1. Równanie do obliczenia stopnia deuterowania.
<img alt="Wynik SDS-PAGE; prążki białek Pak2, p34/p27(P), p27; rozszczepienie kaspazy, autofosforylacja." src="/files/ftp_upload/3602/3602fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2">
Rysunek 2. Autofosforylacja i rozszczepienie Pak2 przez kaspazę. Pak2 rozszczepiony przez kaspazę (lewa ścieżka), nienaruszony nieaktywny Pak2 (środkowa ścieżka) oraz autofosforylowany Pak2 rozszczepiony przez kaspazę (prawa ścieżka) przeanalizowano za pomocą SDS-PAGE i barwienia błękitem Coomassie. Adaptowano z Hsu, YH et al2.
<img alt="Wykres spektrometrii mas pokazujący wymianę deuteru w czasie; analiza kinetyczna, zakres m/z 1693-1713." src="/files/ftp_upload/3602/3602fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3">
Rycina 3. Widmo masowe przebiegu czasowego wbudowywania deuteru dla nieaktywnego Pak2. Nieaktywny Pak2 poddano wymianie H/D przez 0-10 min i analizowano za pomocą MALDI-TOF. Przedstawiono przykład powiększonego rozkładu izotopowego MALDI-TOF dla piku m/z 1697,85 w czasie przebiegu wymiany H/D. Czerwona przerywana linia oznacza średnią obwiedni masowej, a przesunięcie obwiedni masowej wskazuje na deuterację peptydu.

<ol><li>Anand, G. S., Hughes, C. A., Jones, J. M., Taylor, S. S., Komives, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amide+H%2F2H+exchange+reveals+communication+between+the+cAMP+and+catalytic+subunit-binding+sites+in+the+R%28I%29alpha+subunit+of+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22A.+J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Amide H/2H exchange reveals communication between the cAMP and catalytic subunit-binding sites in the R(I)alpha subunit of protein kinase.</a> A. J. Mol. Biol. 323, 377-386 (2002).</li>
<li>Hsu, Y. H., Johnson, D. A., Traugh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+conformational+changes+during+activation+of+protein+kinase+Pak2+by+amide+hydrogen%2Fdeuterium+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of conformational changes during activation of protein kinase Pak2 by amide hydrogen/deuterium exchange.</a> J. Biol. Chem. 283, 36397-36405 (2008).</li>
<li>Englander, S. W., Kallenbach, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+exchange+and+structural+dynamics+of+proteins+and+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Q.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Hydrogen exchange and structural dynamics of proteins and nucleic acids.</a> Q. Rev. Biophys. 16, 521-655 (1983).</li>
<li>Katta, V., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+in+proteins+probed+by+hydrogen-exchange+electrospray-ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass. Spectrom. 5, 214-217 (1991).</li>
<li>Dennis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localizing+the+membrane+binding+region+of+Group+VIA+Ca2%2B-independent+phospholipase+A2+using+peptide+amide+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Localizing the membrane binding region of Group VIA Ca2+-independent phospholipase A2 using peptide amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> J. Biol. Chem. 284, 23652-23661 (2009).</li>
<li>Hsu, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+binding+rigidifies+the+C2+domain+and+the+intradomain+interaction+of+GIVA+phospholipase+A2+as+revealed+by+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Calcium binding rigidifies the C2 domain and the intradomain interaction of GIVA phospholipase A2 as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> J. Biol. Chem. 283, 9820-9827 (2008).</li>
<li>Lee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+hPAK65+by+caspase+cleavage+induces+some+of+the+morphological+and+biochemical+changes+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Activation of hPAK65 by caspase cleavage induces some of the morphological and biochemical changes of apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 13642-13647 (1997).</li>
<li>Rudel, T., Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+and+morphological+changes+in+apoptotic+cells+regulated+by+caspase-mediated+activation+of+PAK2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Membrane and morphological changes in apoptotic cells regulated by caspase-mediated activation of PAK2.</a> Science. 276, 1571-1574 (1997).</li>
<li>Roig, J., Traugh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytostatic+p21+G+protein-activated+protein+kinase+gamma-PAK%5BTitle%5D)+AND+%22Vitam.+Horm%22%5BJournal%5D)">Cytostatic p21 G protein-activated protein kinase gamma-PAK.</a> Vitam. Horm. 62, 167-198 (2001).</li>
<li>Walter, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+and+activation+of+p21-activated+protein+kinase+gamma-PAK+by+CPP32+%28caspase+3%29.+Effects+of+autophosphorylation+on+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cleavage and activation of p21-activated protein kinase gamma-PAK by CPP32 (caspase 3). Effects of autophosphorylation on activity.</a> J. Biol. Chem. 273, 28733-28739 (1998).</li>
<li>Clauser, K. R., Baker, P., Burlingame, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+accurate+mass+measurement+%28%2B%2F-+10+ppm%29+in+protein+identification+strategies+employing+MS+or+MS%2FMS+and+database+searching%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Role of accurate mass measurement (+/- 10 ppm) in protein identification strategies employing MS or MS/MS and database searching.</a> Anal. Chem. 71, 2871-2882 (1999).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Identyfikacja fragmentów strawionych pepsyną jest krytycznym etapem eksperymentu z wymiany H/D. Błędna identyfikacja peptydu może prowadzić do niewłaściwych wniosków. Pak2 strawiony pepsyną jest eluowany przez kolumnę C18 do HPLC w fazie odwróconej, aby uzyskać czyste tło. W naszych eksperymentach zebrano łącznie 40 frakcji, które poddano analizie MALDI-TOF. W każdej z frakcji można było zidentyfikować wiele peptydów. Peptydy te poddano tandemowej spektrometrii mas (Q-TOF MS/MS oraz oMALDI MS/MS) w celu zidentyfikowania ich sekwencji. Widma MS/MS peptydu powinny zawierać co najmniej trzy jony produktu, aby potwierdzić identyfikację peptydu.
Program komputerowy Data Explorer 4.0 (Applied Biosystems) służy do wstępnej korekcji linii bazowej i filtracji szumów. Każde widmo musi zostać skalibrowane na podstawie dwóch sekwencyjnych pików. Kalibracji widma dokonujemy za pomocą teoretycznej masy nieduerylowanego m/z, która wynosi 923,45 i 1697,84. Dokładność masy po kalibracji może osiągnąć 10 ppm. Po deuterowaniu monoizotop może przesunąć się w stronę wyższej masy. Jednostkowe przyrosty tych stosunków m/z prowadzą do zwiększenia masy związanej z deuterowaniem. Intensywność pików obwiedni masy nie wpływa na stopień deuterowania. Jednakże intensywność pików izotopowych w konkretnej obwiedni masy ma kluczowe znaczenie dla obliczenia masy średniej. Pierwszym krokiem obliczania wbudowanego deuteru jest odjęcie masy peptydu próbki nieduerylowanej od masy próbkiu deuterowanej. W obliczeniach należy dodatkowo uwzględnić trzy inne czynniki: rozcieńczenie D2O, pozostałe deutery w łańcuchach bocznych oraz wymianę wsteczną (Rysunek 1). Rozcieńczenie D2O to czynnik rozcieńczenia D2O po wymieszaniu próbki z buforem D2O w celu zainicjowania wymiany H/D. Należy odjąć pozostały deuter (4,5%) w łańcuchach bocznych peptydów trawionych pepsyną. Wymiana wsteczna to nieunikniona utrata deuterowania we wszystkich deuterowanych i trawionych pepsyną peptydach podczas procesu pomiaru masy.
Peptyd o największej dostępności dla rozpuszczalnika (m/z = 1105,60) po 24 godzinach wymiany H/D reprezentuje obszar pełnego deuterowania. Liczba wbudowanych deuteronów dla każdego z peptydów stanowi różnicę między centroidem peptydów peptycznych Pak2 deuterowanych i niedeuterowanych. Peptyd o najwyższym stopniu deuterowania m/z 1105 został wybrany do reprezentowania pełnego deuterowania w przypadku Pak2 po 24 h wymiany H/D. Współczynnik wymiany wstecznej (Back Exchange Ratio) obliczono poprzez podzielenie rzeczywistej liczby wbudowanych deuteronów po 24 h wymiany H/D przez wszystkie możliwe miejsca wymiany w peptydzie m/z 1105.

<table><tbody><tr><td>D&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Aldrich</td><td>7789-20-0</td><td></td></tr><tr><td>kwas &amp;alpha;-cyjanowy-4-hydroksycynnamowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>28166-41-8</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF</td><td>PE Biosystems</td><td>Voyager DE STR</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr mas Q-TOF</td><td>Q-TOF Ultima-Global</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QSTAR XL oMALDI MS/MS</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program komputerowy Data Explorer 4.0</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analiza aktywacji pak2 za pomocą wymiany wodoru na deuter w wiązaniach amidowych oraz spektrometrii mas maldi-tof

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Wymiana wodoru na deuter (wymiana H/D) w grupach amidowych sprzężona ze spektrometrią mas jest szeroko stosowana do analizy powierzchni oddziaływań białko-białko, zmian konformacyjnych białek, dynamiki białek oraz oddziaływań białko-ligand. Wymiana H/D w pozycjach amidowych szkieletu białkowego jest wykorzystywana do pomiaru szybkości deuteracji mikroregionów w białku za pomocą spektrometrii mas1,2,3. Rozdzielczość tej metody zależy od trawienia pepsyną deuterowanego białka docelowego do peptydów, które zazwyczaj obejmują od 3 do 20 reszt. Chociaż rozdzielczość wymiany H/D mierzonej spektrometrią mas jest niższa niż rozdzielczość pojedynczej reszty uzyskiwana metodą Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC) w NMR, pomiar spektrometrią mas w wymianie H/D nie jest ograniczony rozmiarem białka4. Wymiana H/D jest przeprowadzana w roztworze wodnym, który utrzymuje konformację białka. Przedstawiamy metodę wykorzystującą MALDI-TOF do detekcji2 zamiast systemu HPLC/ESI (jonizacja przez rozpylanie)-MS5,6. MALDI-TOF dostarcza dokładne dane o intensywności masy dla peptydów trawionego białka, w tym przypadku kinazy białkowej Pak2 (zwanej również γ-Pak). Proteoliza Pak 2 jest przeprowadzana w ramach offline’owego trawienia pepsyną. Ta alternatywna metoda jest stosowana, gdy użytkownik nie ma dostępu do układu HPLC i kolumny z pepsyną połączonych ze spektrometrem mas lub gdy kolumna z pepsyną w układzie HPLC nie daje optymalnej mapy trawienia, na przykład w przypadku wydzielanej fosfolipazy A2 (sPLA2) z licznymi mostkami dwusiarczkowymi. Wykorzystując tę metodę, z sukcesem monitorowaliśmy zmiany w poziomie deuteracji podczas aktywacji Pak2 poprzez cięcie przez kaspazę 3 oraz autofosforylację7,8,9.

Spektrometria mas MALDI-TOF została z powodzeniem wykorzystana do monitorowania wymiany wodoru/deuteru w wiązaniach amidowych podczas aktywacji kinazy białkowej Pak2.

Analiza aktywacji Pak2 za pomocą wymiany wodoru na deuter w wiązaniach amidowych oraz spektrometrii mas MALDI-TOF

Wymiana wodoru na deuter w grupach amidowych (wymiana H/D) sprzężona ze spektrometrią mas jest szeroko stosowana do analizy powierzchni styku białko-białko...

Niniejszy eksperyment demonstruje, w jaki sposób wykorzystać spektrometrię mas do monitorowania wymiany wodór-deuter w białku. Zmiany strukturalne prowadzące do stanów aktywacji polegają najpierw na cięciu kinazy białkowej PAC2 za pomocą kaspazy 3, a następnie na aktywacji PAC2 poprzez autofosforylację z użyciem ATP jako substratu. W drugim kroku białko PAC2 poddaje się trawieniu pepsyną, a powstałe fragmenty PAC2 analizuje się za pomocą tandemowej spektrometrii mas. Następnie analizuje się wzorce wymiany wodór-deuter w PAC2 poprzez monitorowanie poziomu deuteru w każdym fragmencie PAC2. Dokładne określenie poziomu wymiany wodór-deuter przy użyciu analizy mold zapewnia istotne informacje na temat cięcia przez kaspazę 3 oraz autofosforylacji PAC2.Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na pytania dotyczące dynamiki białek, takie jak zmiany konformacyjne białek, oddziaływania białko-ligand oraz oddziaływania białko-białko. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak spektrometria mas LCQ z wymianą HD, jest kwestia instrumentalna. Procedura ta nie wymaga zastosowania spektrometrii mas sprzężonej z HPLC do analizy wyników wymiany HD i jest łatwa w obsłudze w celu rozszczepienia 0.6 µg PAC two.Dodać kaspazę 3 i inkubować reakcję w temperaturze 34 °C przez 30 minut. Zweryfikować obecność PAC 2 oraz pełne cięcie PAC 2 poprzez analizę produktów metodą SDS-PAGE. W celu przeprowadzenia reakcji aktywacji, dodać rozcięty PAC 2 do 20 µL buforu aktywacyjnego B i inkubować w temperaturze 34 °C przez 30 minut.Użyj elektroforezy SDS-PAGE, aby potwierdzić autofosforylację poprzez migrację fragmentów P 34 i P 27. Najpierw przemyj kulki agro sprzężone z puryną dwukrotnie 1 ml 0,1% kwasu trifluorooctowego (TFA). Rozcieńcz 2 µL roztworu o stężeniu 10 mg/ml pPak 2 w 100 µL 0,1% TFA, dodaj 30 µL przemytych kulek agro sprzężonych z puryną i inkubuj przez pięć minut.Następnie należy przeprowadzić równoważenie kolumny H-P-L-C-C 18 w odwróconej fazie przy użyciu 0.1%TFA o pH 2.5. Następnie należy nałożyć Pepin Digest i rozdzielić go, stosując liniowy gradient trwający 100 minut. Frakcje HPLC należy zbierać co dwie minuty po uprzednim ich wysuszeniu za pomocą SpeedVac.Zawiesić próbki w pięciu µL acetonitrylu i 0,1% TFA przy pH 2,5. W ramach wstępnego przesiewu przeanalizować każdą frakcję pod kątem obecności peptydów za pomocą MALDI dla wszystkich frakcji zawierających peptydy.Zidentyfikuj fragmenty za pomocą tandemowej spektrometrii mas. Użyj funkcji MS product w programie Protein Prospector, aby dopasować jony potomne do teoretycznych stosunków MZ w oparciu o sekwencję pierwotną PAC two. Najpierw doprowadź wszystkie roztwory i odczynniki do stanu równowagi przed wymianą wodór-deuter.Rozpocznij wymianę wodoru na deuter poprzez dodanie 18 µL buforu D₂O do 2 µL roztworu o stężeniu 10 mg/mL. Próbkę 2 przygotuj w trzech powtórzeniach w określonym przebiegu czasowym. Przerwij reakcję wymiany wodoru na deuter, dodając 180 µL lodowatego 0,1% TFA o pH 2,2.Następnie rozdziel 100 µL aliquoty wodoru-deuteru. Przenieś po dwie aliquoty do 30 µL aktywowanych kulek agregatu sprzężonego z pepiną. Inkubuj tę digestię pepiną na lodzie przez pięć minut.Wstrząsanie w wortexie co 30 sekund skutecznie przerywa reakcje trawienia, a następnie odwirowanie pozwala na szybkie usunięcie Pepinu. Próbki należy zamrozić w ciekłym azocie do czasu analizy. Przygotować matrycę i przechowywać w temperaturze 0 °C, a następnie szybko częściowo rozmrozić każdą próbkę.Wymieszać 1 µL próbki z 1 µL matrycy, a następnie nanieść na płytkę docelową do MALDI schłodzoną do 4 °C na 30 sekund przed analizą MALDI. Zastosować umiarkowaną próżnię w celu osuszenia plamek. Należy kontynuować pomiar mas MALDI, uśredniając 100 skanów w ciągu dwóch minut.Należy użyć programu komputerowego Data Explorer 4.0, aby obliczyć czas trwania każdego fragmentu. Następnie należy obliczyć wymianę wsteczną w oparciu o stosunek rzeczywistej inkorporacji po 24 godzinach wymiany wodoru na deuter do wszystkich możliwych miejsc wymiany, którymi są amidy szkieletu, z wyjątkiem amidu terminalnego. W tym przykładzie cięcie i autofosforylacja CASP Bay zostały zweryfikowane za pomocą elektroforezy SDS-PAGE z barwieniem Coomassie.Niefosforylowana, nieaktywna forma PAC2 tworzy pojedynczy prążek o masie 58 kDa. Rozszczepienie PAC2 jest całkowite i w wyniku autofosforylacji prowadzi do powstania dwóch fragmentów: P27, będącego domeną regulacyjną, oraz P34, będącego domeną katalityczną. Migracja autofosforylowanych fragmentów P27 i P34 wykazuje nakładanie się na żelu białkowym ze względu na spowolnioną migrację w pełni fosforylowanego fragmentu P27 w porównaniu z niefosforylowaną formą PAC2.Niniejsze widmo masowe przedstawia przebieg czasowy wbudowy deuteru dla nieaktywnego PAC two. Pik m/z 1697,85 składa się z wielu pików izotopowych, co obrazuje przesunięcie obwiedni masowej. Czerwona przerywana linia wskazuje średnią obwiedni masowej w czasie, a przesunięcie obwiedni masowej pokazuje czas trwania obecności peptydu.Technikę tę można zrealizować w ciągu dwóch dni, jeśli zostanie ona przeprowadzona prawidłowo. Należy pamiętać, że praca z ciekłym azotem może być niezwykle niebezpieczna, dlatego należy podjąć środki ostrożności, takie jak wykonanie otworu w zakrętce probówki EOL 1,5 ml przed umieszczeniem jej w ciekłym azocie.

amide-hydrogendeuterium-exchange-maldi-tof-mass-spectrometry-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wymiana wodoru/deuteru Amidowego & Analiza spektrometrii mas MALDI-TOF aktywacji Pak2

Kinaza 2 z powtórzeniami bogatymi w leucynę (LRRK2) jest dużą, wielodomenową kinazą, której mutacje stanowią najczęstszą genetyczną przyczynę choroby Parkinsona. Analiza aktywności kinazowej tego białka okazała się kluczowym narzędziem w zrozumieniu biologii i dysfunkcji tego białka. W niniejszej pracy opisano badanie aktywności kinazowej LRRK2 oraz wybranych jej mutantów in vitro, zapewniając system eksperymentalny do badania fosforylacji domniemanych substratów oraz potencjalnej dysfunkcji...

Oznaczanie aktywności kinazy LRRK2 in vitro

Konformacja i dynamika białek są kluczem do zrozumienia związku między strukturą a funkcją białka. Wymiana wodorowa w połączeniu ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości jest wszechstronną metodą badania dynamiki konformacyjnej białek, a także charakteryzowania interakcji białko-ligand i białko-białko, w tym interfejsów kontaktowych i efektów allosterycznych.

Analiza dynamiki białek za pomocą spektrometrii mas wymiany wodorowej

Opisujemy tutaj protokół oczyszczania i charakterystyki kompleksów białek roślinnych. Pokazujemy to, immunoprecypitując pojedyncze białko w kompleksie, dzięki czemu możemy zidentyfikować jego modyfikacje potranslacyjne i oddziałujących partnerów.

Identyfikacja modyfikacji potranslacyjnych kompleksów białek roślinnych

Korzystając z mikromacierzy białkowych zawierających prawie cały proteom S. cerevisiae, sonduje się szybkie, bezstronne badanie tysięcy równoległych interakcji białko-białko. Metoda ta może być stosowana do małych cząsteczek białek, modyfikacji potranslacyjnych i innych testów o wysokiej przepustowości.

Sondowanie funkcjonalnych mikromacierzy białkowych o dużej gęstości w celu wykrycia interakcji białko-białko

Elastyczność konformacyjna odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu białek. W tym artykule opisujemy zastosowanie czasowo-rozdzielczej spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylającą sprzężoną z wymianą wodorowo-deuterową do badania szybkich zmian strukturalnych, które napędzają funkcję w uporządkowanych i nieuporządkowanych białkach.

Spektrometria mas z jonizacją wodorowo-deuterową z jonizacją elektrorozpylającą do badania struktury i dynamiki białek

Kinazy białkowe to wysoce rozwinięte enzymy sygnalizacyjne i rusztowania, które są kluczowe dla między- i wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnału. Przedstawiamy protokół pomiaru aktywności kinazy za pomocą znakowanego radioaktywnie trifosforanu adenozyny ([γ-32P] ATP), niezawodnej metody pomagającej w wyjaśnieniu regulacji sygnalizacji komórkowej.

Oznaczanie aktywności kinazy białkowej za pomocą znakowanego radioaktywnie ATP

Ten przepływ pracy opisuje wydajność efektywnego czasowo i kosztowo wzbogacania wielu modyfikacji potranslacyjnych białek (PTM) jednocześnie dla ilościowej globalnej analizy proteomicznej. Protokół wykorzystuje wzbogacanie PTM na poziomie peptydów wieloma sprzężonymi przeciwciałami, a następnie niezależną od danych analizę spektrometrii mas w celu uzyskania biologicznego wglądu w przesłuchy PTM.

Jednoczesne wzbogacenie powinowactwa dwóch modyfikacji potranslacyjnych do kwantyfikacji i lokalizacji miejsca

Syntetazy lantipeptydu katalizują wieloetapowe reakcje podczas biosyntezy naturalnych produktów peptydowych. W tym miejscu opisujemy ciągły, oddolny przepływ pracy spektrometrii mas z wymianą wodorowo-deuterową (HDX-MS), który można wykorzystać do badania dynamiki konformacyjnej syntetaz lantipeptydów, a także innych podobnych enzymów zaangażowanych w biosyntezę naturalnych produktów peptydowych.

Platforma spektrometrii mas z wymianą wodorowo-deuterową (HDX-MS) do badania biosyntetycznych enzymów peptydowych

Połączone znakowanie izotopowe prekursorów i znakowanie izobaryczne (cPILOT) to ulepszona strategia multipleksowania próbek, która jest w stanie zwiększyć liczbę próbek, które mogą być analizowane jednocześnie z dostępnymi znacznikami izobarycznymi. Zastosowanie platformy robotycznej znacznie zwiększyło przepustowość eksperymentalną, powtarzalność i dokładność ilościową.

Automatyczne multipleksowanie próbek przy użyciu połączonego znakowania izotopowego prekursorów i znakowania izobarycznego (cPILOT)

Możliwość oceny zaangażowania inhibitorów kandydatów w komórkach nienaruszonych jest kluczowa dla odkrywania leków. Protokół ten opisuje 384-dołkowy test termiczny przesunięcia komórkowego, który niezawodnie wykrywa zaangażowanie inhibitorów celujących w dziki typ SHP2 lub jego warianty onkogenne.

Ocena zaangażowania komórek w cele przez inhibitory fosfatazy SHP2 (PTPN11)

Tutaj prezentujemy protokół wzbogacania endogennych fosfataz fosfoproteinowych i ich oddziałujących białek z komórek i tkanek oraz ich identyfikacji i kwantyfikacji za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas.

Podejście oparte na spektrometrii mas do identyfikacji fosfataz fosfoproteinowych i ich interaktorów

Odkryj wymianę amidowodoru/deuteru w aktywacji kinazy białkowej Pak2 przy użyciu spektrometrii mas MALDI-TOF. Ta metoda pozwala badać dynamikę strukturalną białek i zmiany konformacyjne.

Analiza aktywacji Pak2 za pomocą wymiany wodoru na deuter w wiązaniach amidowych oraz spektrometrii mas MALDI-TOF

Przeglądaj więcej filmów