Name: Analiza migracji i różnicowania grzebieni nerwowych przez przeszczep międzygatunkowy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Poznaj metodę przeszczepu międzygatunkowego do analizy migracji i różnicowania komórek grzebienia nerwowego w zarodkach przepiórczo-kurzych. Technika ta umożliwia śledzenie komórek w czasie ich migracji i różnicowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują członkom laboratorium Lwigale za krytyczną analizę manuskryptu. SLG jest wspierana przez stypendium Ruth L. Kirschstein NRSA z National Eye Institute (F32 EY02167301). PYL jest wspierany przez National Eye Institute (EY018050).

1. Inkubacja jaj kurzych i przepiórczych do pożądanego stadium
W przypadku embrionów w stadium HH9 typowy czas inkubacji wynosi od 29 do 33 godzin w temperaturze 38 °C.63
<ol>
	<li>Opłucz jaja z wszelkich zanieczyszczeń letnią wodą.</li>
	<li>Ułóż jaja kurzych poziomo na tacy. Zaznacz ołówkiem stronę skierowaną do góry; będzie ona odpowiadać obszarowi, w którym zlokalizowany będzie embrion. Inkubuj jaja przepiórcze tępym końcem do góry.</li>
	<li>Umieść jaja w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 38 °C. Włącz funkcję kołysania.</li>
</ol>
2. Przygotowanie jaj do wycinania okna i sekcji
<ol>
	<li>Wyjmij jaja z inkubatora i wysterylizuj ich górne części 70% etanolem. Najlepiej rozpylić etanol i szybko wytrzeć go ręcznikiem papierowym lub chusteczką Kimwipe, aby zapobiec wchłanianiu etanolu przez skorupkę jaja.</li>
	<li>Umieść jajo kurze w indywidualnym uchwycie (stosujemy szalkę Petriego wyłożoną złożonymi ręcznikami papierowymi, np. „Kimwipes”). Używając pęsety AA, wykonaj mały otwór w górnej powierzchni skorupki jaja na jego ostrym końcu.</li>
	<li>Odsącz 1,5-3 mL rzadkiego albuminy z jaja kurzego za pomocą igły hipodermicznej 18½ G i strzykawki 5 mL. Najlepiej wprowadzić igłę pionowo do otworu, tak aby ścięcie było skierowane w stronę ostrego końca jaja (Rysunek 2A). W ten sposób podczas odsysania albuminy istnieje niewielkie ryzyko przypadkowego uszkodzenia żółtka przez ssanie. Wylej albuminę. Ten krok obniży poziom żółtka i zarodka wewnątrz jaja, umożliwiając otwarcie okna w skorupce.</li>
	<li>Przetrzyj otwór 70% etanolem, jak opisano powyżej, i zabezpiecz go taśmą klejącą. Ważne jest, aby skorupka wokół otworu była całkowicie wolna od albuminy i sucha, w przeciwnym razie klej nie przylgnie.</li>
	<li>Za pomocą pęsety AA wykonaj kolejny otwór w zaznaczonej górnej powierzchni poziomo ułożonego jaja, nie całkiem na szczycie. Należy uważać, aby pęseta nie weszła zbyt głęboko w skorupkę, aby uniknąć uszkodzenia żółtka lub zarodka.</li>
	<li>Wprowadź jedną stronę zakrzywionej pęsety irydowej do otworu równolegle do skorupki jaja. Ściśniętej skorupkę, wykonując ruchy koliste, aby wyciąć okno o średnicy ok. 2 cm w skorupce jaja kurzego. Usuń fragment skorupki. Alternatywnie można pokryć górną powierzchnię jaja taśmą pakową i wyciąć okno nożyczkami. Minimalizuje to ryzyko wpadnięcia odłamków skorupki do wnętrza jaja. Zarodek powinien wyglądać jak nieprzezroczysty dysk na szczycie żółtka. Odrzuć jaja niezapłodnione (rozpoznawalne po małej białej plamce na powierzchni żółtka lub braku blastodermy).</li>
	<li>Wstrzyknij niewielką ilość tuszu indyjskiego (rozcieńczonego 1:10 w sterylnym roztworze Ringera zawierającym antybiotyk „Pen/Strep”: końcowe stężenie 100 μg/mL penicyliny i 100 μg/mL streptomycyny) pod blastodermę, aby ułatwić określenie stadium rozwoju zarodka. Użyj strzykawki 1 mL i igły hipodermicznej 26½ G, zgiętej pod kątem 45° u podstawy, ze ścięciem skierowanym do góry; alternatywnie można użyć wyciągniętej szklanej pipety Pasteura i urządzenia do pipetowania ustnego (należy stosować ochronę oczu podczas zginania igły hipodermicznej lub łamania szklanej igły). Przebij błonę żółtka poza obrysem blastodermy i wsuń końcówkę igły pod zarodek, blisko powierzchni żółtka, ale nie w warstwy embrionalne (Rysunek 2B). Wstrzyknij tylko tyle tuszu, aby obrysować zarodek, a następnie ostrożnie wycofaj igłę (Rysunek 2C). Wstrzyknięcie zbyt dużej ilości tuszu może doprowadzić do śmierci zarodka. Ważne jest, aby nie wstrzyknąć żadnych pęcherzyków powietrza pod zarodek, ponieważ mogą one być źródłem kontaminacji. Uwaga: cały roztwór Ringera stosowany w tej procedurze jest sterylizowany i zawiera Pen/Strep zgodnie z powyższą definicją. Sterylny roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS) jest również dopuszczalną alternatywą dla roztworu Ringera we wszystkich krokach tego protokołu.</li>
	<li>Określ stadium rozwoju zarodka zgodnie z klasyfikacją Hamburgera i Hamiltona63 i zapisz stadium na skorupce jaja trwałym pisakiem lub ołówkiem. Stadia najlepiej oceniać pod mikroskopem stereoskopowym, z wykorzystaniem światłowodowych źródeł światła typu „gooseneck”, które generują niską emisję ciepła.</li>
	<li>Nanieś 2-3 krople ciepłego, sterylnego roztworu Ringera na powierzchnię zarodka, aby zapobiec odwodnieniu i kontaminacji. Tymczasowo zabezpiecz okno parafilmem rozciągniętym nad powierzchnią jaja.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.2-2.9 dla wszystkich jaj kurzych przed rozpoczęciem eksperymentów z transplantacją.</li>
	<li>Ponieważ zarodki przepiórcze są używane wyłącznie jako tkanki dawcze, kroki 2.2-2.9 in ovo można pominąć. Do przygotowania zarodków dawców ex ovo jaja przepiórcze inkubuje się stroną tępą do góry i otwiera w tym obszarze zakrzywioną pęsetą, aby odsłonić zarodek. Używając nożyczek sekcyjnych, wykonaj cztery nacięcia w kształcie kwadratu przez błonę żółtkową i blastodermę poza zarodkiem (upewnij się, że wszystkie nacięcia się łączą). Używając zakrzywionej pęsety irydowej, delikatnie chwyć jedną z krawędzi nacięcia, podnieś zarodek z jaja i przenieś go do roztworu Ringera w szalce Petriego. Alternatywnie można użyć zakrzywionej pęsety irydowej do podniesienia wyciętego zarodka od spodu lub łyżeczki do embrionów bądź plastikowej pipety transferowej przeciętej w szerszej części cylindra, aby przenieść zarodek z jaja. Delikatnie usuń błonę żółtkową pęsetą nr 5. Zbierz pozostałe zarodki przepiórcze w ten sam sposób i określ ich stadium pod mikroskopem sekcyjnym.</li>
</ol>
3. Przygotowanie zarodka biorcy do przyjęcia przeszczepu
<ol>
	<li>Zdjąć parafilm z zarodka gospodarza (kurczaka) i za pomocą zaostrzonej igły wolframowej lub pęsety nr 5 wykonać niewielki otwór w błonie żółtkowej w pożądanym obszarze rurki nerwowej (Rysunek 3A).</li>
	<li>Dodać kroplę roztworu Ringera do zarodka. Należy dbać o to, aby zarodek pozostawał całkowicie zanurzony w roztworze Ringera przez cały czas trwania procedury, aby zapobiec odwodnieniu tkanki. W razie potrzeby należy sukcesywnie dodawać krople roztworu Ringera na powierzchnię zarodka za pomocą pipety transferowej.</li>
	<li>Używając wyciągniętej igły szklanej, ostrożnie wykonać poprzeczne nacięcia rostralne i kaudalne, odpowiadające długości i obszarowi zainteresowania w grzbietowej części rurki nerwowej. (Wyciągnięte igły szklane są wytwarzane z silikatyowych kapilar szklanych, które zostały wyciągnięte pod wpływem ciepła za pomocą urządzenia do wyciągania igieł). W przypadku przeszczepów jednostronnych nacięcia powinny sięgać jedynie do światła grzbietowej części rurki nerwowej, a w przypadku przeszczepów obustronnych należy wykonać nacięcia przez całą szerokość grzbietowej części rurki nerwowej. Następnie należy przeciąć obustronnie przestrzeń między grzbietową częścią rurki nerwowej a mezodermą paraksjalną.</li>
	<li>Ostrożnie oddzielić wycięty eksplant od rurki nerwowej, a następnie usunąć go z zarodka poprzez odessanie do szklanej mikropipety (Rysunek 3B).</li>
</ol>
4. Przygotowanie tkanki przeszczepowej dawcy
<ol>
	<li>Wybierz zarodek przepiórki o odpowiadającym stadium rozwoju. Przytrzymaj zarodek pęsetą AA, usuń błonę żółtkową i wyetnij obszar cewy nerwowej o podobnej wielkości, jak opisano powyżej (3.3-3.4) (Rycina 3A'-B'). W zależności od potrzeb eksperymentu, obszar ten może być regionem komplementarnym do cewy nerwowej gospodarza (kurczaka) lub pochodzić z innego regionu wzdłuż osi rostro-kaudalnej. (Uwaga: w przypadku większych przeszczepów regionalnych, w tym pełnych przeszczepów cewy nerwowej, badacze mogą chcieć wprowadzić na tym etapie trawienie proteazą, aby usunąć przylegającą tkankę mezenchymalną z tkanki dawcy przed transplantacją. Jednak w przypadku małych przeszczepów grzbietowej części cewy nerwowej na wczesnych etapach, jak szczegółowo opisano tutaj, trawienie proteazą nie jest konieczne, ponieważ cewę nerwową można łatwo oddzielić od sąsiedniej mezenchymy za pomocą ściśle technik chirurgicznych.)</li>
</ol>
5. Przeszczepienie tkanki
<ol>
	<li>Odessa eksplant donora do szklanej mikropipety zawierającej roztwór Ringera. Należy uważać, aby do pipety nie dostały się pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Przenieś eksplant w miejsce sąsiadujące z wyciętym obszarem gospodarza (kurczaka). Za pomocą wyciągniętej szklanej igły ustaw eksplant i delikatnie wprowadź go w obszar ablacji (Rysunek 3C).</li>
	<li>Ostrożnie dodaj kilka kropli roztworu Ringera do embrionu, aby zapobiec odwodnieniu. Należy uważać, aby nie wkraplać płynu bezpośrednio na miejsce przeszczepu, ponieważ może to spowodować jego przemieszczenie.</li>
	<li>Uszczelnij okno taśmą pakową. Upewnij się, że taśma szczelnie zakrywa cały obszar okna w jajie. Zapobiega to odwodnieniu i kontaminacji embrionu podczas późniejszej inkubacji.</li>
	<li>Włóż jajo z powrotem do inkubatora aż do osiągnięcia pożądanego stadium. Upewnij się, że funkcja „kołysania” (rocking) jest wyłączona podczas inkubacji chimer. Jaja można delikatnie obracać ręcznie dwa razy dziennie, co może zwiększyć ich żywotność, jeśli celem są późniejsze stadia rozwoju.</li>
</ol>
6. Przygotowanie embrionów chimerycznych do sekcjonowania
<ol>
	<li>W punkcie końcowym eksperymentu odciąć taśmę zakrywającą okno za pomocą precyzyjnych nożyczek.</li>
	<li>Chwycić krawędź blastodermy zakrzywioną pęsetą irydową (najłatwiej wykonać to pęsetą z ząbkami), a następnie oddzielić zarodek od żółtka, wykonując 4 szerokie cięcia poza granicami blastodermy.</li>
	<li>Przenieść zarodek do szalki Petriego zawierającej roztwór Ringera. Należy zadbać o zminimalizowanie ekspozycji zarodka na powietrze, aby uniknąć odwodnienia tkanek.</li>
	<li>Pod mikroskopem stereoskopowym delikatnie oddzielić błonę witelijną od blastodermy za pomocą pęsety nr 5.</li>
	<li>Uważnie ułożyć zarodek w szalce tak, aby zachował tę samą orientację co w jajku, z płasko rozłożonymi błonami otaczającymi.</li>
	<li>Używając igieł sekcyjnych wykonanych z drutów wolframowych64, precyzyjnie usunąć otaczającą blastodermę z zarodka, ustawiając igłę na granicy zarodka i tkanek pozazarodkowych, tak aby drut wolframowy był równoległy do dna szalki. Tkaniki przeciąć delikatnym ruchem piłującym.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć błonę owodnią za pomocą pęsety nr 5. Na tym etapie można przeprowadzić dalszą sekcję obszaru zainteresowania lub pozostawić zarodek w całości.</li>
	<li>Przenieść zarodek do lodowatej 4% paraformaldehydu i inkubować na kołysarce przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować próbki i zatopić je do sekcjonowania krio- lub parafina-metodą.</li>
</ol>
Śledzenie przeszczepionej tkanki w obrębie zarodka biorcy. Istnieje kilka technik identyfikacji tkanki przepiórki w zarodku kurczaka, w tym wykrywanie jąderków przepiórki za pomocą barwienia hematoksyliną (jądra przepiórki posiadają znacznie większe, ciemniej barwiące się wtrącenia niż jądra kurczaka), reakcję Feulgena-Rossenbecka, barwienie akrydyną pomarańczową lub biz-benzamidem w połączeniu z mikroskopią elektronową lub immunoznakowanie antygenów specyficznych dla przepiórki3,47,65,66. W niniejszym protokole wykorzystujemy antygen QCPN oraz standardowe techniki immunofluorescencji całego preparatu lub przekrojów w celu identyfikacji komórek grzebienia neuronalnego przepiórki w chimerach przepiórka-kurczak (Rysunek 4). Technika ta zapewnia największą elastyczność w projekcie eksperymentalnym, ponieważ immunofluorescencję QCPN można łączyć z innymi przeciwciałami w celu identyfikacji zróżnicowanych komórek pochodzących z tkanki dawcy (przepiórki). Należy zastosować standardowe techniki immunofluorescencji całego preparatu lub przekrojów, aby znakować komórki pochodzące od przepiórki w chimerach.
7. Reprezentatywne wyniki
Reprezentatywny obraz obszaru przeszczepionego rurki nerwowej po 6h ponownej inkubacji (do stadium HH11) wykazuje oczekiwaną inkorporację przeszczepionej tkanki dawcy (przepiórki) do rurki nerwowej biorcy (kurczaka) (Rycina 4A). Zarodki wykazujące niepełną integrację przeszczepu lub asymetryczny rozwój obszaru czaszkowego bądź somytów po ponownej inkubacji powinny zostać odrzucone.
Przekrój poprzeczny przez obszar szczepienia w stadium HH11 wykazuje, że NCC znakowane HNK-1 migrują bocznie od rurki neuralnej. Komórki przepiórcze uczestniczące w strumieniu migracyjnym NCC oraz tworzące rurkę neuralną są wyraźnie znakowane QCPN (Rysunek 4B).
W późniejszych etapach komórki pochodne z NCC przepiórnika mogą być śledzone aż do ich docelowej tkanki. Komórki znakowane QCPN są rozmieszczone w obrębie mezenchymy wyrostka szczękowego zarodka kurczaka w dniu E5 (Rycina 4C).
Przeciwciało QCPN można łatwo łączyć z innymi przeciwciałami w celu zbadania różnicowania komórek grzebienia neuronalnego (NCC) pochodzenia przepiórczego w środowisku gospodarza. Neurony sensoryczne nerwu trójdzielnego pochodzące z NCC przepiórki są znakowane przeciwciałami QCPN i Tuj1 (Rysunek 4D).
<img alt="Proces tworzenia chimery zarodka kurczaka i przepiórki; schematy, narzędzia do eksperymentu nad rozwojem zarodkowym." src="/files/ftp_upload/3622/3622fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Przegląd procedury eksperymentalnej i niezbędnych instrumentów. A) Zarodki gospodarza (kurczaka) i dawcy (przepiórki) powinny być na tym samym etapie rozwoju. Do znakowania strumienia NCC, który przyczynia się do tworzenia zwoju trójdzielnego oraz obszaru szczękowo-żuchwowego, idealny jest etap HH9. W stadium HH9 cewka nerwowa zaczyna się zamykać w regionie rostralnym, ale nie jest jeszcze całkowicie szczelna. Szara linia na schematach reprezentuje linię środkową zamykającej się cewki nerwowej. Białe linie przerywane wskazują linie cięcia służące do wycięcia regionu śródmózgowia z prawej strony cewki nerwowej zarodków gospodarza i dawcy. Wycięty region zarodka gospodarza zostaje usunięty, a tkanka dawcy zostaje przeszczepiona w celu wytworzenia zarodka chimerycznego. B) Niezbędne instrumenty obejmują: a) strzykawkę 5 mL z igłą hipodermiczną 18½ G, b) strzykawkę 1 mL z igłą hipodermiczną 26½ G zgiętą pod kątem 45°, c) tusz kreślarski, d) przezroczystą taśmę pakową, e) pipetę szklaną z urządzeniem do pipetowania ustnego, f) szalkę Petriego 60 mm, g) pincetę AA, h) zakrzywioną pincetę irydową z ząbkowanymi końcówkami, i) pincetę nr 5, j) precyzyjne nożyczki, k) zaostrzony drut wolframowy, l) wyciąganą igłę szklaną, m) kwadraty parafilmu.
<img alt="Schemat wstrzykiwania i znakowania jaj; analiza przenikania tuszu indyjskiego w strukturze skorupy." src="/files/ftp_upload/3622/3622fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Przygotowanie jaj i embrionów. A) Schemat przekroju jaja, przedstawiający optymalny punkt wprowadzenia igły hipodermicznej 18½ G w celu odessania lekkiego albuminy. B) Po odessaniu ~3mL lekkiego albuminy, żółtko i embrion opadają wewnątrz jaja, co pozwala badaczom na wycięcie „okna” (strzałki) w skorupie jaja w celu uzyskania dostępu do embrionu. Następnie pod blastodermę można wstrzyknąć tusz indyjski, rozcieńczony 1:10 w sterylnym roztworze Ringera, aby zapewnić kontrast umożliwiający łatwe określenie stadium rozwoju embrionów. C) Embrion kurczaka po zabarwieniu tuszem.
<img alt="Chimery embrionów kury i przepiórnika; stadia rozwojowe; schematy, fuzja embrionalna, błona witelinowa, HH9." src="/files/ftp_upload/3622/3622fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Schemat i przykłady embrionów dawcy i biorcy w stadium HH 9 na każdym etapie procedury przeszczepiania. A) Embrion kury (biorca). Linie przerywane na schemacie wskazują miejsce, w którym należy przerwać błonę witelinową, aby uzyskać dostęp do regionu czaszkowego w celu wykonania przeszczepu. Po przerwaniu trójkątna klapa błony witelinowej powinna zostać odchylona w kierunku ogonowym. Ramka na zdjęciu wskazuje powiększenie użyte w (B-C). A') Embrion przepiórnika (dawca). Zdjęcie przedstawia embrion dawcy wyjęty z jaja i umieszczony w szalce Petriego w celu wycięcia tkanki do przeszczepu. Ramka na zdjęciu wskazuje powiększenie użyte w (B'). Linie przerywane na schemacie (A') wskazują miejsce, w którym należy przeciąć błony witelinową i żółtkową, aby usunąć embrion z jaja. B) Embrion biorcy z wyciętym jednostronnie regionem śródmózgowym rurki neuralnej (białe strzałki) oczekujący na przeszczep. Linia kropkowana na schemacie wskazuje miejsca nacięć koniecznych do wycięcia rurki neuralnej w regionie śródmózgowia. B') Embrion dawcy z wyciętą tkanką z grzbietowej części rurki neuralnej (tkanka przeszczepowa wskazana czarnymi grotami strzałek). Linia kropkowana na schemacie wskazuje miejsca nacięć w embrionie przepiórnika w celu wycięcia tkanki dawcy do jednostronnego przeszczepu w regionie śródmózgowia rurki neuralnej. C) Embrion chimeryczny po przeszczepieniu eksplantatu grzbietowej rurki neuralnej przepiórnika do regionu śródmózgowia kury.
<img alt="Migracja embrionalnych komórek grzebienia neuronalnego w mikroskopii fluorescencyjnej; markery QCPN, HNK-1; widoki przekrojowe." src="/files/ftp_upload/3622/3622fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Immunofluorescencja wykrywająca swoisty dla przepiórki antygen jądrowy QCPN w komórkach pochodzących od dawcy w embrionie chimerycznym. A) Obraz całego preparatu chimery HH11 (przeszczepionej w stadium HH9) pokazujący barwienie QCPN na czerwono i barwienie HNK-1 (marker migrujących NCC) na zielono. Powiększenie 10X, widok grzbietowy. B) Przekrój poprzeczny przez embrion z (A), pokazujący komórki pochodzące od przepiórki wykazujące pozytywną reakcję z QCPN w rurce neuralnej oraz migrujące NCC współbarwione z HNK-1 (zielone). Powiększenie 40X. C) Przekrój poprzeczny przez wyrostek szczękowy chimery E5 (inkubowanej przez 3 dni po przeszczepieniu), pokazujący pochodzące z NCC komórki pozytywne dla QCPN (czerwone), które zmigrowały z przeszczepionego obszaru rurki neuralnej do swojej docelowej lokalizacji w embrionie. Powiększenie 10X. D) Przekrój przez chimerę E5 pokazujący udział NCC pochodzących od przepiórki w zwoju trójdzielnym (czerwone) i różnicowanie w neurony pozytywne dla TuJ1 (zielone). Powiększenie 40X. *, NCCs; MP, wyrostek szczękowy; NT, rurka neuralna; TG, zwój trójdzielny.

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

Opisane tutaj przeszczepianie cewy nerwowej przepiórki do embrionów kurczęcia jest prostą i niedrogą techniką śledzenia specyficznych subpopulacji migrujących NCC wywodzących się z różnych regionów wzdłuż osi rostro-kaudalnej21,67-69. Technika ta wykorzystuje łatwy dostęp do embrionów ptaków (w porównaniu do embrionów ssaków) i może być łączona z innymi metodami, takimi jak ablacja tkanek, wstrzykiwanie cząsteczek inhibitorowych lub manipulacje genetyczne za pomocą elektroporacji plazmidów ekspresyjnych, aby e...

<table><tbody><tr><td>Jaja kurczęce</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jaja przepiórcze</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator do jaj (Sportsman Incubator z cyfrowym odczytem, model 1502, z kontrolą wilgotności, 110-120 V AC)</td><td><a href="http://www.poultrysupply.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Zaopatrzenie w drób</a></td><td>1502</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta Dumont AA, pokryta epoksydem Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11210-10</td><td></td></tr><tr><td>Taśma klejąca Scotch</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywiona pęseta irydowa</td><td>Fine Science Tools</td><td>11065-07</td><td></td></tr><tr><td>tusze indyjski</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Pen/Strep (penicylina, streptomycyna) </td><td>VWR international</td><td>101447-068</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczysta taśma pakowa</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aparat do wyciągania igieł</td><td>Narishige International</td><td>PE-21</td><td></td></tr><tr><td>Wyciągnięta igła szklana, wykonana z borokrzemianowej rurki kapilarnej o wymiarach 1,5–1,8 x 100 mm</td><td>Kimble Chase</td><td>34500 99</td><td></td></tr><tr><td>Wytrawiona pipeta szklana, wykonana z 5&amp;#190;pipeta Pasteura</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6A</td><td></td></tr><tr><td>Aparat do pipetowania ustnego (zespół rurki aspiracyjnej dla kalibrowanej pipety mikrokapilarnej)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177-52A</td><td></td></tr><tr><td>pinceta Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Drut wolframowy, średnica 0,1 mm</td><td>VWR international</td><td>AA10404-H2</td><td></td></tr><tr><td>Portigły do igieł (niklowany uchwyt do pinów)</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td></td></tr><tr><td>anty serum QCPN</td><td>Bank Hybrydom Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>QCPN</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało wtórne Alexa Fluor (np. Alexa Fluor 594 kozie anty-mysie IgG1)</td><td>Invitrogen</td><td>A21125</td><td></td></tr><tr><td>Ringer&amp;rsquo;roztwór (2 L): &lt;ul&gt; &lt;li&gt;14,4 g NaCl&lt;/li&gt; &lt;li&gt;0,34 g CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;/li&gt; &lt;li&gt;0,74 g KCl&lt;/li&gt; &lt;li&gt;0,230 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;/li&gt; &lt;li&gt;0,04 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;/li&gt; &lt;li&gt;ddH2O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O do 2 L&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Filtrowanie i autoklawowanie&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>&lt;ul&gt; &lt;li&gt;7647-14-5&lt;/li&gt; &lt;li&gt;10043-52-4&lt;/li&gt; &lt;li&gt;7447-40-7&lt;/li&gt; &lt;li&gt;7558-79-4&lt;/li&gt; &lt;li&gt;7778-77-0&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza migracji i różnicowania grzebienia neuronalnego za pomocą transplantacji międzygatunkowej

Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

Zarodki ptaków stanowią wyjątkową platformę do badania wielu procesów rozwojowych kręgowców dzięki łatwemu dostępowi do zarodków wewnątrz jaja. Chimerowe zarodki ptaków, w których tkanka dawcy z przepiórki jest przeszczepiana do zarodka kurczaka in ovo, łączą zalety trwałego znakowania genetycznego populacji komórek z łatwością manipulacji, jaką oferuje zarodek ptaka.
Chimery przepiór-kurczak są klasycznym narzędziem do śledzenia migrujących komórek grzebienia neuronalnego (NCCs)1-3. NCCs stanowią przejściową migrującą populację komórek w embrionie, które pochodzą z grzbietowej części rozwijającej się rurki neuralnej4. Przechodzą one przejście nabłonkowo-mezenchymalne, a następnie migrują do innych obszarów embrionu, gdzie różnicują się w różne typy komórek, w tym chrząstkę5-13, melanocyty11,14-20, neurony i glej21-32. NCCs są multipotencjalne, a ich ostateczny los zależy od: 1) regionu rurki neuralnej, z którego pochodzą wzdłuż osi rostralno-kaudalnej embrionu11,33-37, 2) sygnałów z sąsiednich komórek podczas migracji38-44 oraz 3) mikrośrodowiska w ich ostatecznym miejscu przeznaczenia w obrębie embrionu45,46. Śledzenie tych komórek od miejsca ich powstania w rurce neuralnej do końcowej pozycji i losu w embrionie dostarcza ważnych informacji na temat procesów rozwojowych regulujących wzorcowanie i organogenezę.
Przeszczepianie komplementarnych obszarów rurki neuralnej dawcy (przeszczepy homotopowe) lub różnych obszarów rurki neuralnej dawcy (przeszczepy heterotopowe) może ujawnić różnice w przedspecyfikacji NCC wzdłuż osi rostro-kaudalnej2,47. Technikę tę można dodatkowo dostosować do przeszczepienia jednostronnego przedziału rurki neuralnej w taki sposób, aby jedna strona pochodziła z tkanki dawcy, a strona przeciwległa w embrionie biorcy pozostała nienaruszona, co zapewnia kontrolę wewnętrzną w obrębie tej samej próbki2,47. Może ona zostać również zaadaptowana do przeszczepiania segmentów mózgu w późniejszych stadiach embrionalnych, po etapie HH10, gdy przednia część rurki neuralnej uległa zamknięciu47.
W niniejszej pracy przedstawiamy techniki generowania chimer przepiórczo-kurzych poprzez transplantację rurki neuralnej, które umożliwiają śledzenie migrujących NCC pochodzących z określonego segmentu rurki neuralnej. Gatunkowo swoiste znakowanie komórek pochodzących od dawcy za pomocą przeciwciała QCPN specyficznego dla przepiórki48-56 pozwala badaczowi odróżnić komórki dawcy od komórek biorcy w końcowym punkcie eksperymentu. Technika ta jest prosta, niedroga i ma wiele zastosowań, w tym mapowanie losów komórek, śledzenie linii komórkowych oraz identyfikację zdarzeń pre-patterningu wzdłuż osi rostro-kaudalnej45. Ze względu na łatwy dostęp do zarodka ptasiego, technika przeszczepu przepiórczo-kurzego może być łączona z innymi manipulacjami, w tym między innymi z ablacją soczewki40, wstrzykiwaniem cząsteczek inhibicyjnych57,58 lub manipulacjami genetycznymi poprzez elektroporację plazmidów ekspresyjnych59-61, aby zidentyfikować odpowiedź konkretnych strumieni migrujących NCC na zaburzenia w programie rozwojowym zarodka. Ponadto technika ta może być również wykorzystywana do generowania innych międzygatunkowych zarodków chimerycznych, takich jak chimery przepiórczo-kaczcze, w celu zbadania udziału NCC w morfogenezie kraniofacjalnej, lub chimery mysio-kurze, aby połączyć możliwości genetyki myszy z łatwością manipulacji zarodkiem ptasim.62

Opisano podejście do analizy migracji i ostatecznego losu ptasich komórek grzebienia neuronalnego w embrionach chimerycznych przepiórnik-kurczak. Metoda ta stanowi prostą i przejrzystą technikę śledzenia komórek grzebienia neuronalnego podczas migracji i różnicowania, których w przeciwnym razie trudno byłoby odróżnić w niezmodyfikowanym embrionie kurczaka.

Analiza migracji i różnicowania grzebienia neuronalnego za pomocą transplantacji międzygatunkowej

Zarodki ptaków stanowią wyjątkową platformę do badania wielu procesów rozwojowych kręgowców ze względu na łatwy dostęp do zarodków znajdujących się wewnątrz jaja. ...

Ogólnym celem tej procedury jest przeszczepienie fragmentu grzbietowej rurki neuralnej z zarodka przepiórki do zarodka kurczaka o odpowiadającym mu stadium rozwoju, aby prześledzić migrację i los komórek grzebienia neuralnego. Realizuje się to poprzez wykonanie najpierw niewielkiego otworu w błonie IGN zarodka kurczaka-gospodarza, aby uzyskać dostęp do rurki neuralnej. Następnie zarodek przepiórki-dawcy zostaje wyjęty z jaja w celu przygotowania do wycięcia przeszczepu.W następnym kroku obszar zainteresowania zostaje wycięty z rurki neuralnej embrionu biorcy. Następnie z rurki neuralnej dawcy wycina się podobny obszar w celu przeszczepienia. W kolejnym etapie rurka neuralna dawcy jest transplantowana do rurki neuralnej biorcy.Na koniec chimeryczny embrion inkubuje się do pożądanego stadium w celu wykrycia komórek grzebienia neuronalnego, które dotarły do wybranego narządu. Ostatecznie migrację i różnicowanie pochodzących od donora komórek grzebienia neuronalnego w różnych lokalizacjach embrionu biorcy można zwizualizować za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy mikrodyssekcji i przeszczepiania wymagają bardzo precyzyjnych umiejętności motorycznych, co utrudnia ich opanowanie.Rozpocznij od opłukania zanieczyszczeń z jaj kurzych letnią wodą. Ułóż jaja poziomo na tacy, a następnie zaznacz ołówkiem strony skierowane do góry, aby wskazać obszar, w którym znajdzie się zarodek. W przypadku przygotowania embrionów donora metodą X ovo, inkubuj nogi przepiórki stroną tępą do dołu.W następnym kroku umieść jaja w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 38 °C i włącz funkcję kołysania. Po zakończeniu inkubacji jaj sterylizuj ich górne części, rozpylając 70% etanol, a następnie szybko wycierając je chusteczką Kimwipe. Aby zapobiec wchłanianiu cieczy przez skorupkę jaja, umieść każde wysterylizowane jajo na oddzielnym uchwycie, podobnym do szalki Petriego wyłożonej złożonymi chusteczkami Kimwipe, widocznych tutaj. Następnie, używając sterylnej pęsety AA, wykonaj niewielki otwór w górnej części skorupki jaja, na jego ostrym końcu.Wyposażyć strzykawkę o pojemności 5 ml igłą hipodermiczną o rozmiarze 18,5 G. Następnie, kierując ścięcie igły w stronę szpiczastego końca jaja, wprowadzić igłę pionowo do otworu w skorupce. Aby uniknąć przypadkowego uszkodzenia żółtka poprzez zasysanie, oczyścić otwór 70% etanolem, tak jak wcześniej, a następnie zabezpieczyć otwór taśmą klejącą.Następnie za pomocą pęsety typu double A należy wykonać kolejny otwór w zaznaczonej górnej powierzchni poziomego odnoga, nieco poniżej wierzchołka. Następnie włożyć jeden koniec zakrzywionej pęsety irydowej do otworu równolegle do jaja. Następnie należy ściskać skorupkę, wykonując ruchy okrężne.Wykonaj otwór o średnicy dwóch centymetrów w skorupce jaja kurzego, a usunięty fragment skorupki wyrzuć. Zarodek powinien wyglądać jak nieprzezroczysty krążek na górnej powierzchni żółtka. Odrzuć wszystkie niezapłodnione jaja, które można zidentyfikować po małej białej plamce na powierzchni żółtka lub braku blastodermy.Mając na sobie odpowiednią ochronę oczu, zgnij igłę hipodermiczną o rozmiarze 26,5 pod kątem 45 stopni, zaczynając od nasady igły. Po przymocowaniu zgiętej igły ściętą stroną do góry do strzykawki o pojemności 1 ml, napełnij ją rozcieńczonym tuszem indyjskim. Przebij błonę żółtka poza obrysem blastodermy i wsuń końcówkę igły pod embrion, blisko powierzchni żółtka, ale nie w warstwy embrionalne.Następnie wstrzyknij taką ilość tuszu, aby jedynie obrysować zarodek, unikając wstrzyknięcia pęcherzyków powietrza. Ostrożnie wyjmij igłę. Teraz użyj stereomikroskopu oraz źródła światła o niskiej emisji ciepła, takiego jak pokazana tutaj lampa światłowodowa na elastycznym ramieniu.Określ stadium rozwoju embrionów zgodnie z klasyfikacją Hamburgera i Hamiltona. Zapisz stadium na skorupkach jaj. Następnie nanieś dwie do trzech kropli ciepłego, sterylnego roztworu Ringera na powierzchnię embrionów, aby zapobiec ich odwodnieniu i kontaminacji.Następnie naciągnij parafilm na powierzchnię jaj, aby tymczasowo uszczelnić okna. W kolejnym kroku przygotuj jaja przepiórcze do transplantacji. Przed wyjęciem jaj z inkubatora napełnij szalkę Petriego roztworem Ringera.Następnie otwórz jaja od strony tępej za pomocą zakrzywionych pęset, aby odsłonić zarodek. Używając nożyczek sekcyjnych, wykonaj cztery cięcia w kształcie kwadratu przez błonę kosmkową i blastoderm poza obrębiem zarodka, upewniając się, że wszystkie cięcia łączą się ze sobą. Następnie, używając zakrzywionej pęsety irydowej, delikatnie chwyć jedną z krawędzi cięcia, wyjmij zarodek z jaja i przenieś go do przygotowanej szalki Petriego.Na koniec ostrożnie usuń błonę witelinową za pomocą pęsety nr 5, a następnie określ stadium rozwoju embrionów pod mikroskopem stereologicznym. Usuń parafilm z embrionu kurczaka gospodarza. Następnie, używając zaostrzonej igły wolframowej, wykonaj mały otwór w błonie witelinowej w pożądanym obszarze rurki nerwowej.Dodaj kroplę roztworu Ringera do zarodka. Następnie, w przypadku przeszczepów jednostronnych, takich jak ten wykonywany w tym filmie, użyj wyciągniętej szklanej igły, aby ostrożnie wykonać poprzeczne nacięcia rostralne i kaudalne w obrębie śródmózgowia rurki neuralnej, nie przekraczając światła rurki. Następnie wykonaj cięcia obustronne pomiędzy grzbietową częścią rurki neuralnej a mezodermą kątową.Na koniec ostrożnie oddziel wycięty eksplant X od rurki nerwowej, a następnie usuń go z embrionu, odsysając go do szklanej mikropipety. Najpierw użyj embrionu przepiórczego o odpowiadającym stadium rozwoju. Następnie wycięnij obszar rurki nerwowej o podobnej wielkości, jak pokazano przed chwilą, i odessij eksplant X od dawcy do szklanej mikropipety zawierającej roztwór Ringera.Przenieś eksplant X w bezpośrednie sąsiedztwo wyciętego obszaru gospodarza (zarodka pisklęcia). Następnie, używając wyciągniętej szklanej igły, zorientuj eksplant, delikatnie wprowadzając go w obszar ablacji. Ostrożnie dodaj do zarodka kilka kropli roztworu Ringera, aby zapobiec odwodnieniu.Na koniec zaklej okno taśmą pakową, upewniając się, że taśma uszczelnia cały obszar okna w jajku, a następnie umieść jajko z powrotem w inkubatorze aż do osiągnięcia pożądanego stadium; podczas inkubacji wyłącz funkcję kołysania, przy czym jajka można delikatnie obracać ręcznie dwa razy dziennie, aby zwiększyć ich żywotność. Jeśli celem są późniejsze stadia rozwoju, ten reprezentatywny obraz regionu szczepionego rurki neurulowej po sześciu godzinach ponownej inkubacji do stadium HH 11 pokazuje oczekiwaną inkorporację szczepionej tkanki dawcy z przepiórnika do rurki neurulowej kurczaka biorcy. Ten przekrój poprzeczny przez region szczepiony w stadium HH 11 pokazuje komórki grzebienia neuronalnego znakowane hnk, z których jedna migruje bocznie, oddalając się od rurki neurulowej.Komórki przepiórki uczestniczące w strumieniu migracyjnym komórek grzebienia neuronalnego oraz w cewiet przeznaczonej na układ nerwowy są wyraźnie znakowane za pomocą QCPN. Na późniejszych etapach komórki pochodzące z komórek grzebienia neuronalnego przepiórki mogą być śledzone aż do ich docelowych tkanek. Jak widać na tej rycinie, komórki znakowane QCPN są rozproszone w obrębie procesu szczękowego zarodka kurczaka. W stadium E5 przeciwciało QCPN można łatwo łączyć z innymi przeciwciałami w celu zbadania różnicowania komórek grzebienia neuronalnego pochodzenia przepiórki.W środowisku gospodarza. Jak widać tutaj, neurony czuciowe nerwu trójdzielnego pochodzące z komórek grzebienia neuronalnego przepiórki są znakowane przeciwciałami QCPN oraz T UJ one. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak immunohistochemia i hybrydyzacja in situ, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. jakie tkanki powstają z komórek grzebienia neuronalnego oraz jakie geny wykazują te komórki podczas różnicowania się w różne tkanki.

analysis-neural-crest-migration-differentiation-cross-species

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Analiza migracji i różnicowania grzebienia nerwowego poprzez przeszczepy międzygatunkowe

Do hodowli komórek macierzystych grzebienia neuronalnego (NCSC) in vitro wymagane jest specjalne medium (NCSCM). Niezbędnym składnikiem NCSCM jest ekstrakt z embrionu kurczaka (CEE). Opisujemy tutaj precyzyjne techniki pozwalające na uzyskanie maksymalnej ilości czystego i wysokiej jakości CEE, w tym szczegóły dotyczące procesów izolacji, maceracji, wirowania oraz filtracji.

Wytwarzanie ekstraktu z zarodka kurczaka do hodowli mysich komórek macierzystych grzebienia neuronalnego

Opisano metodę analizy migracji wyizolowanych komórek (komórek grzbietu neuronalnego tułowia). Metoda ta jest niedroga, łagodna i pozwala odróżnić chemotaksję zarówno od chemokinezy, jak i od innych czynników wpływających na polaryzację migracyjną, takich jak oddziaływania międzykomórkowe w pierwotnej kulturze komórek grzbietu neuronalnego tułowia.

Analiza migracji komórek grzbietowych neuralnych tułowia z wykorzystaniem zmodyfikowanego testu w komorze Zigmonda

Izolacja embrionalnej grzebieni neuralnej z rurki neuralnej umożliwia zastosowanie metod in vitro do badania migracji, samoodnawiania oraz multipotencji grzebieni neuralnej.

Izolacja i hodowla komórek grzebienia neuronalnego z zarodkowej rurki nerwowej myszy

Mezenchyma czaszki ulega gwałtownym ruchom morfogenetycznym, które prawdopodobnie stanowią siłę napędową dla uniesienia fałdów neuronalnych.1,2W niniejszym opracowaniu opisujemy prostą ex vivo test z eksplantem w celu charakterystyki zachowań komórkowych mezenchymy czaszki podczas neurulacji. Metoda ta znajduje liczne zastosowania, w tym możliwość wprowadzania manipulacji farmakologicznych oraz przeprowadzania analiz z wykorzystaniem obrazowania na żywo.

Test eksplantacyjny do oceny zachowania komórkowego mezenchymy czaszki

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić preparację premigracyjnego grzebienia nerwowego czaszki (NC) od Xenopus laevis neurulas. Te eksplantaty można posiewać na fibronektynie i hodować in vitro lub przeszczepiać z powrotem do zarodków gospodarza. Technika ta pozwala na badanie mechanizmów przejścia, migracji i różnicowania nabłonka NC do mezenchymy.

Rozwarstwienie grzebienia nerwowego Xenopus laevis do hodowli eksplantatów in vitro lub przeszczepu in vivo

Kombinacja zaawansowanych technik optycznych laserowej mikroskopii skaningowej z wzbudzeniem fluorescencji wielofotonowej o długich falach została zaimplementowana do przechwytywania wysokiej rozdzielczości, trójwymiarowego obrazowania w czasie rzeczywistym migracji grzebieni nerwowych w zarodkach zebry pręgowanego Tg(sox10:EGFP) i Tg(foxd3:GFP).

Wielofotonowe obrazowanie poklatkowe w celu wizualizacji rozwoju w czasie rzeczywistym: wizualizacja migrujących komórek grzebienia nerwowego w zarodkach danio pręgowanego

Ten protokół opisuje sekcję i hodowlę komórek grzebienia nerwowego czaszki z modeli mysich, głównie do badania migracji komórek. Opisujemy stosowane techniki obrazowania na żywo oraz analizę zmian prędkości i kształtu komórek.

Sekcja, hodowla i analiza pierwotnych komórek grzebienia nerwowego czaszki od myszy w celu zbadania delaminacji i migracji komórek grzebienia nerwowego

Ten artykuł opisuje technikę przeszczepu tkanek, która została zaprojektowana w celu przetestowania właściwości sygnalizacyjnych i wzorcowych podstawy przodomózgowia podczas rozwoju twarzoczaszki.

Tworzenie ptasich chimer przodomózgowia w celu oceny rozwoju twarzy

Ten wszechstronny protokół opisuje izolację premigrujących komórek grzebienia nerwowego (NCC) poprzez wycięcie fałdów nerwowych czaszki z zarodków piskląt. Po posiewie i inkubacji migrujące NCC wyłaniają się z eksplantatów fałdów nerwowych, co pozwala na ocenę morfologii i migracji komórek w uproszczonym środowisku 2D.

Przygotowanie i analiza morfologiczna kultur komórek grzebienia nerwowego czaszki piskląt

Prezentujemy trójwymiarowy (3D) protokół różnicowania in vitro, generujący neurosfery o powtarzalnych rozmiarach do produkcji komórek grzebienia nerwowego czaszki z embrionalnych komórek macierzystych myszy. Pokazujemy, że ta metodologia zmniejsza zmienność w porównaniu z poprzednimi protokołami i jak można ją wykorzystać do testu multipleksowego do badania rozwoju komórek grzebienia nerwowego czaszki.

Komórki grzebienia nerwowego czaszki Trójwymiarowy protokół różnicowania in vitro do testu multipleksowego

Poznaj metodę przeszczepu międzygatunkowego do analizy migracji i różnicowania komórek grzebienia nerwowego w zarodkach przepiórczo-kurzych. Technika ta umożliwia śledzenie komórek w czasie ich migracji i różnicowania.

Analiza migracji i różnicowania grzebienia neuronalnego za pomocą transplantacji międzygatunkowej

Przeglądaj więcej filmów