Analiza migracji i różnicowania grzebieni nerwowych przez przeszczep międzygatunkowy

Ogólnym celem tej procedury jest przeszczepienie grzbietowej cewy nerwowej z zarodka przepiórki do etapowo dopasowanego zarodka kurczaka, aby prześledzić migrację i los komórek grzebienia nerwowego. Osiąga się to poprzez najpierw wyrwanie małego otworu w błonie IGN zarodka kurczaka gospodarza, aby uzyskać dostęp do cewy nerwowej. Zarodek przepiórczy dawcy jest następnie usuwany z jaja, aby przygotować go do wycięcia przeszczepu.

W kolejnym kroku obszar zainteresowania jest wycinany z cewy nerwowej zarodka gospodarza. Podobny obszar jest następnie wycinany z cewy nerwowej dawcy w celu przeszczepu. Następnie cewa nerwowa dawcy jest przeszczepiana do cewy nerwowej gospodarza.

Na koniec zarodek chimeryczny jest inkubowany do pożądanego etapu w celu wykrycia komórek grzebienia nerwowego w wybranym narządzie. Ostatecznie migrację i różnicowanie komórek grzebienia nerwowego pochodzących od dawcy do różnych miejsc w zarodku gospodarza można uwidocznić za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy mikropreparacji i szczepienia wymagają bardzo małych umiejętności motorycznych, co utrudnia ich nauczenie.

Zacznij od umycia wszelkich zanieczyszczeń z jaj piskląt letnią wodą. Ułóż jaja poziomo na tacy, a następnie zaznacz boki skierowane do góry ołówkiem, aby zaznaczyć obszar, w którym zostanie zlokalizowany zarodek. W celu przygotowania zarodków dawcy X ovo należy inkubować nogi przepiórcze stroną.

Następnie umieść jaja w inkubatorze z wilgotnością 38 stopni Celsjusza i włącz funkcję bujania. Po zakończeniu jaj, inkubacji wysterylizuj wierzchołki, spryskując je 70% etanolem, a następnie szybko wycierając chusteczką Kim Aby uniknąć wchłaniania przez jajko, skorupkę umieść każde wysterylizowane jajko na indywidualnym uchwycie na jajka, podobnie jak szalka Petriego wyłożona złożonymi chusteczkami Kim widocznymi tutaj. Następnie za pomocą wysterylizowanych kleszczy AA wbij mały otwór w górną powierzchnię skorupki jajka na spiczastym końcu jajka.

Wyposażyć pięciomililitrową strzykawkę w igłę podskórną o rozmiarze 18 i pół mm. Następnie, ze skosem skierowanym w stronę spiczastego końca jajka, włóż igłę pionowo do otworu w skorupce jajka. Aby uniknąć przypadkowego uszkodzenia żółtka przez zasysanie, wyczyść otwór 70% etanolem jak poprzednio i uszczelnij otwór taśmą klejącą.

Następnie za pomocą podwójnych kleszczyków A wbij kolejny otwór w zaznaczoną górną powierzchnię poziomej nogi, nie do końca na wierzchołku. Następnie włóż jedną stronę zakrzywionych kleszczyków tęczówki do otworu równoległego do jajka. Skorupa następnie ściska skorupę i pracuje ruchem okrężnym.

Rozbij okno o średnicy dwóch centymetrów w jaju kurzym, skorupkę, wyrzuć usuniętą skorupkę jajka. Zarodek powinien wyglądać jak nieprzezroczysty krążek na wierzchu żółtka. Wyrzuć wszelkie niezapłodnione jaja, które można rozpoznać po małej białej plamce na powierzchni żółtka lub braku skóry właściwej blastera.

Teraz, nosząc odpowiednią ochronę oczu, zegnij igłę podskórną o rozmiarze 26 i pół pod kątem 45 stopni, zaczynając od podstawy igły. Po przymocowaniu zgiętej igły skośnej strony do strzykawki o pojemności jednego mililitra, napełnij igłę rozcieńczonym atramentem indyjskim. Nakłuć błonę żółtkową na zewnątrz obwodu blastera i wsunąć końcówkę igły pod zarodek, blisko powierzchni żółtka, ale nie w warstwach zarodkowych.

Następnie wstrzyknij tylko tyle atramentu, aby obrysować zarodek i unikaj wstrzykiwania pęcherzyków. Ostrożnie wyjąć igłę. Teraz przy użyciu mikroskopu stereoskopowego i źródła światła o ograniczonym obciążeniu cieplnym, takiego jak pokazana tutaj lampa światłowodowa na gęsiej szyi.

Ułóż zarodki według hamburgera i Hamiltona. Nagraj etap na skorupkach jaj. Następnie nałóż dwie do trzech kropli ciepłego, sterylnego roztworu pierścienia na powierzchnię zarodków, aby zapobiec odwodnieniu i zanieczyszczeniu.

Następnie rozciągnij folię para na powierzchni jaj, aby tymczasowo uszczelnić okna. Następnie przygotuj jaja przepiórcze do przeszczepu. Przed wyjęciem jaj z inkubatora napełnij szalkę Petriego roztworem Ringera.

Następnie otwórz jaja po stronie za pomocą zakrzywionych kleszczy, aby odsłonić zarodek. Za pomocą nożyczek preparacyjnych wykonaj cztery nacięcia w kształcie kwadratu przez błonę vili i skórę blastera na zewnątrz zarodka, upewniając się, że wszystkie nacięcia się spotykają. Następnie za pomocą zakrzywionych kleszczyków do tęczówki delikatnie chwyć jedną odciętą krawędź i wyjmij zarodek z jaja i przenieś go na przygotowaną szalkę Petriego.

Na koniec delikatnie usuń błonę witelinową za pomocą kleszczy numer pięć, a następnie umieść zarodki pod mikroskopem preparacyjnym. Usunąć folię para z zarodka pisklęcia żywiciela. Następnie za pomocą zaostrzonej igły wolframowej oderwij mały otwór w błonie VII w żądanym obszarze cewy nerwowej.

Dodaj kroplę roztworu dzwonka do zarodka. Następnie, w przypadku przeszczepów jednostronnych, takich jak ten wykonywany w tym filmie, użyj wylanej szklanej igły, aby ostrożnie wykonać poprzeczne nacięcia rostralne i sercowe w obszarze śródmózgowia cewy nerwowej, nie wychodząc poza światło. Następnie przeciąć obustronnie między grzbietową cewą nerwową a mezodermą parialną.

Na koniec należy ostrożnie oddzielić wycięty ex explan od cewy nerwowej, a następnie usunąć go z zarodka poprzez zassanie go do szklanej mikropipety. Najpierw użyj zarodka przepiórczego dopasowanego do etapu. Następnie wyciąć obszar cewy nerwowej o podobnej wielkości, jak pokazano powyżej, i odessać dawcę X explan do szklanej mikropipety zawierającej roztwór dzwonka.

Przenieś plan X przylegający do wyciętego obszaru gospodarza pisklęcia. Następnie za pomocą wyciągniętej szklanej igły delikatnie ustaw eksplan eksplanu, prowadząc go do obszaru ablacji. Ostrożnie dodaj kilka kropli roztworu Ringera do zarodka, aby zapobiec odwodnieniu.

Na koniec uszczelnij okno taśmą pakową, upewniając się, że taśma uszczelnia cały obszar jaja z okienkiem, włóż jajo z powrotem do inkubatora do pożądanego etapu, wyłączając funkcję kołysania podczas inkubacji kyira, X można delikatnie obracać ręcznie dwa razy dziennie, aby zwiększyć ich żywotność. Jeśli ukierunkowane są późniejsze etapy rozwoju, ten reprezentatywny obraz przeszczepionego obszaru cewy nerwowej po sześciu godzinach od ponownej inkubacji do HH 11 pokazuje oczekiwane włączenie przeszczepionej tkanki dawcy przepiórki do cewy nerwowej pisklęcia gospodarza. Ten przekrój przez przeszczepiony region w HH 11 pokazuje komórki grzebienia nerwowego oznaczone hnk, z których jedna migruje bocznie od cewy nerwowej.

Komórki przepiórcze przyczyniające się do strumienia migracyjnego komórek grzebienia nerwowego i cewy nerwowej są wyraźnie oznaczone QCPN. Na późniejszych etapach komórki pochodzące z komórek grzebienia nerwowego przepiórki można prześledzić do ich końcowej tkanki docelowej. Jak widać na tym rysunku, komórki znakowane QCPN są przeplatane w zarodku pisklęcia meen chi wyrostka szczękowego W E pięć przeciwciało QCPN można łatwo połączyć z innymi przeciwciałami w celu zbadania różnicowania komórek grzebienia nerwowego pochodzących z przepiórek.

W środowisku hosta. Jak widać tutaj, neurony czuciowe nerwu nerwowego przepiórki pochodzące z komórek grzebienia nerwu trójdzielnego są znakowane przeciwciałami QCPN i T UJ one. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak immunohistochemia i hybrydyzacja in situ, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, jakie tkanki powstają w komórkach grzebienia nerwowego i jakie geny wyrażają komórki grzebienia nerwowego, gdy różnicują się w różne tkanki.