Wysokoprzepustowa metoda wykrywania wirusa grypy

Ogólnym celem tej procedury jest skuteczne ilościowe określenie miana wirusa grypy w drogach oddechowych zakażonych myszy. Myszy są najpierw inokulowane donosowo wirusem grypy w wybranym czasie. Punkty po zakażeniu.

M są uśmiercane i pobiera się płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe lub płyn BAL. Następnie płyn BAL służy do infekowania komórek MDCK. Zainfekowane komórki można następnie wybarwić pod kątem obecności białek wirusowych za pomocą specyficznych przeciwciał pierwotnych, a następnie przeciwciał drugorzędowych sprzężonych w podczerwieni.

Sygnały w podczerwieni są odczytywane za pomocą skanera Lycor Odyssey, a oprogramowanie Odyssey może być używane do określania mian wirusów. Za pomocą krzywej wzorcowej można uzyskać ilościowe oznaczenie miana wirusa. Głównymi zaletami tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest precyzyjna kwantyfikacja miana wirusa, odtwarzalność i niewielka objętość wymagana do przeprowadzenia tego testu.

Implikacje tej techniki można rozszerzyć na diagnostykę i terapię różnych chorób wirusowych układu oddechowego, ponieważ można ją wykorzystać do ilościowego określenia miana wirusa w próbkach klinicznych Po tej procedurze. Inną metodę, taką jak QPCR, można wykonać, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak liczba kopii wirusa. Podczas próbowania tej techniki ważne jest, aby pamiętać, aby sprawdzić standardowe miano wirusa kontrolnego po tym rozwoju.

Technika ta toruje drogę badaczom w dziedzinie logiki wirusowej do badania miana wirusa lub skręcania białka wirusowego barwienia w próbkach klinicznych. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 17 godzin. Działał precyzyjnie: Infekuj myszy donosowo za pomocą 5 000 jednostek platformowych lub PFU wirusa grypy PR osiem w 30 mikrolitrach sterylnego PBS lub samym PBS jako negatywną kontrolę do pobierania płynu BAL od zwierząt poddanych eutanazji, najpierw przetnij jamę piersiową i wykonaj jednocentymetrowe nacięcie równolegle do tchawicy, aby odsłonić ją cienkimi sterylnymi nożyczkami.

Wykonaj małe nacięcie w tchawicy, wstrzyj tchawicę 0,5 mililitra 1% BSA zawierającego PBS i delikatnie odessaj płyn z płukania. Przechowuj płyny BAL w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w celu ilościowego określenia miana wirusa w płynach popłuczynowych. Najpierw posadź 5 milionów komórek MDCK w 20 mililitrach pełnego RPMI w kolbie T 75 przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza następnego dnia, zbierz komórki i umieść je na optycznej czarnej 96-dołkowej płytce z płaskim dnem w 10 000 komórek na studzienkę.

Następnie inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza po inkubacji. Delikatnie odessać supernatant i dwukrotnie umyć komórki w całkowitym, ale wolnym od surowicy DMEM zawierającym 0,2% BSA zamiast FBS. Po umyciu komórek dodać 50 mikrolitrów płynu BAL lub 50 mikrolitrów zawiesiny zawierającej znane stężenie wirusa na studzienkę.

Następnie dodaj 50 mikrolitrów na studzienkę DMEM, pożywki zawierającej trypsynę traktowaną TPCK w ilości 0,2 mikrograma na mililitr, aby zwiększyć przyczepienie, wnikanie i replikację wirusa. Inkubuj komórki przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby wirus mógł się wchłonąć. Następnie dodaj 100 mikrolitrów FBS zawierającego pełne RPMI do każdej studzienki, hoduj komórki przez noc, aby umożliwić rozprzestrzenianie się infekcji po całonocnej inkubacji.

Umyj komórki 100 mikrolitrami 1%B-S-A-P-B-S. Po umyciu komórek dodaj 100 mikrolitrów na studzienkę 1% paraformaldehydu i inkubuj płytki przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby utrwalić komórki Następnie przemyj 100 mikrolitrami na studzienkę 1% B-S-A-P-B-S i inkubuj komórki przez kolejne 30 minut w celu zablokowania. Po zablokowaniu komórek dodać 50 mikrolitrów na studzienkę pierwszorzędowego przeciwciała przeciwwirusowego M 2 rozcieńczonego w stosunku 1 do 1000 i inkubować płytki przez godzinę w temperaturze pokojowej, aby zabarwić wszelkie białka wirusowe obecne po inkubacji, umyć komórki trzykrotnie w 1% B-S-A-P-B-S i inkubować je w 100 mikrolitrach na studzienkę przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z barwnikiem w podczerwieni w rozcieńczeniu od 1 do 200 przez godzinę w temperaturze pokojowej W ciemności, gdy komórki są zabarwione, umyj je trzy razy, tak jak poprzednio.

Następnie umieść płytki na platformie szkła do czytania skanera podczerwieni Licor Odyssey. Wybierz ustawienie płytki 96-dołkowej w czytniku za pomocą oprogramowania Licor Odyssey. Zidentyfikuj ślepe studzienki kontroli ujemnej, a następnie określ ilościowo fluorescencję z całej płytki.

Użyj narzędzia automatycznego kształtu, aby narysować obszar zainteresowania lub ROI w trakcie testu. Cóż, wykorzystaj zwrot z inwestycji z kontroli negatywnej. Cóż, aby ustawić podstawową wartość fluorescencji dla testu, wprowadź dwa przeciwstawne krzyże nitkowate dostarczone przez oprogramowanie Odyssey w ROI, aby zmierzyć intensywność fluorescencji w dołku.

Następnie zeskanuj płytkę, używając kanału 780 nanometrów do wykrywania i 680 nanometrów jako referencyjnej długości fali. Po aktywowaniu polecenia odczytu mierzone będą intensywności fluorescencji w jednolitych odstępach czasu ROI. A następnie zebrane punkty danych zostały zintegrowane.

Mnożnik odchylenia standardowego określi poziom sygnału powyżej linii bazowej, która jest uwzględniona w ROI, pamiętaj, aby wybrać opcję zintegrowanej intensywności do obliczeń, ponieważ reprezentuje ona objętość pikseli netto dla zdefiniowanych obszarów niezależnie od rozmiaru. Fluorescencja tła zostanie określona ilościowo z pozorowanych zakażonych kontroli i zostanie wykorzystana do oszacowania zintegrowanej intensywności w studzienkach testowych. Fluorescencja w podczerwieni ze zduplikowanych studzienek zawierających seryjne rozcieńczenia miareczkowanego wirusa jest wykorzystywana do skonstruowania krzywej standardowej.

Krzywa standardowa może być następnie wykorzystana do określenia mian płynu BAL od zakażonych myszy. W tym eksperymencie zaobserwowano znaczny wzrost wiremii w drugim i czwartym dniu. Wirus po infekcji został usunięty do 10 dnia, jak pokazano tutaj.

Miana wirusów mierzone za pomocą tego testu dobrze korelują z utratą masy ciała myszy po zakażeniu. Technikę tę można również zastosować do próbek pobranych przez ludzi. Pokazano tutaj ilościowe oznaczenie wirusa H, jeden, N, jednego z ludzkiego wymazu z nosa.

Granica wykrywalności wynosi tutaj od 10 do trzeciej dawki TCID lub dawki zakaźnej posiewu tkankowego. Po obejrzeniu tego filmu dobrze rozumiesz również, jak oszacować miano wirusa grypy za pomocą testu opartego na matrycy w podczerwieni. Wizualna demonstracja tej techniki ma kluczowe znaczenie, ponieważ korzystanie z obrazowania corp może być trudne, a to pomoże uprościć i zademonstrować nasze metody ilościowego oznaczania miana wirusa na płytce 96 lub 384-dołkowej.

I wreszcie, nie zapominaj, że praca z wirusem może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zabierać ze sobą prekursory, takie jak środki ochrony osobistej.