Metoda wysokoprzepustowego wykrywania wirusa grypy

Ogólnym celem niniejszej procedury jest efektywne oznaczanie miana wirusa grypy w drogach oddechowych zakażonych myszy. Myszy są najpierw inokulowane donosowo wirusem grypy w wybranych punktach czasowych po zakażeniu.

Myszom uśmierca się organizmy i pobiera płyn z przemywania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL). Następnie płyn BAL jest wykorzystywany do zakażenia komórek MDCK. Zakażone komórki można następnie barwić w celu wykrycia białek wirusowych przy użyciu specyficznych przeciwciał pierwszorzędowych, a następnie przeciwciał wtórnych sprzężonych z markerem podczerwonym.

Sygnały podczerwone są odczytywane za pomocą skanera Lycor Odyssey, a oprogramowanie Odyssey może być wykorzystywane do określania mian wirusa. Dzięki zastosowaniu krzywej wzorcowej możliwe jest ilościowe oznaczenie mian wirusa. Głównymi zaletami tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami są precyzyjna kwantyfikacja mian wirusa, powtarzalność oraz niewielka objętość próbki wymagana do przeprowadzenia tego testu.

Zastosowania tej techniki można rozszerzyć na diagnostykę i terapię różnych wirusowych chorób układu oddechowego, ponieważ po przeprowadzeniu tej procedury może ona służyć do ilościowego określania miana wirusa w próbkach klinicznych. W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak liczba kopii wirusa, można przeprowadzić inne metody, np. qPCR. Podczas stosowania tej techniki ważne jest, aby pamiętać o sprawdzeniu kontrolnego wirusa standardu miana po zakończeniu tego etapu.

Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny wirusologii do oznaczania miana wirusa lub barwienia białek wirusowych w próbkach klinicznych. Po opanowaniu metody, można ją przeprowadzić w ciągu 17 godzin. Procedura przebiega następująco: myszy zakaża się donosowo 5 000 jednostek tworzących płytkę (PFU) wirusa grypy PR8 w 30 µL sterylnego PBS lub samym PBS jako kontrolą negatywną. W celu pobrania płynu BAL od uśpionych zwierząt, najpierw otwiera się jamę klatki piersiowej i za pomocą precyzyjnych sterylnych nożyczek wykonuje się nacięcie o długości 1 cm równolegle do tchawicy, aby ją odsłonić.

Wykonaj niewielkie nacięcie w tchawicy, wprowadź do niej 0,5 milliliters 1%BSA w PBS, a następnie delikatnie odessaj płyn z płukania. Przechowuj płyny BAL w temperaturze negative 20 degrees centigrade w celu oznaczenia miana wirusa w płynach z płukania. Najpierw hoduj 5 million komórek MDCK w 20 milliliters pełnej pożywki RPMI w kolbie T 75 przez noc w temperaturze 37 degrees centigrade; następnego dnia zbierz komórki i wysiej je na czarną 96-dołkową płytkę optyczną z płaskim dnem w zagęszczeniu 10 000 komórek na dołek.

Następnie inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37°C. Po zakończeniu inkubacji ostrożnie odessać nadsącz i dwukrotnie przemyć komórki w pełnym, ale bezzserwatkowym DMEM zawierającym 0,2% BSA zamiast FBS. Po przemyciu komórek dodać do każdego dołka 50 µL płynu BAL lub 50 µL zawiesiny zawierającej znane stężenie wirusa.

Następnie do każdej studni dodaje się 50 µL DMEM, pożywki zawierającej trypsynę traktowaną TPCK w stężeniu 0,2 µg/mL, aby usprawnić przyleganie, wnikanie i replikację wirusa. Komórki inkubuje się przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C, aby umożliwić adsorpcję wirusa. Następnie do każdej studni dodaje się 100 µL kompletnej pożywki RPMI z FBS i hoduje komórki przez noc, aby umożliwić propagację infekcji po zakończeniu inkubacji nocnej.

Przemyj komórki 100 µL 1% B-S-A-P-B-S. Po przemyciu komórek dodaj 100 µL na dołek 1% paraformaldehydu i inkubuj płytki przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby utrwalić komórki. Następnie przemyj je 100 µL na dołek 1% B-S-A-P-B-S i inkubuj komórki przez kolejne 30 minut w celu blokowania. Po zablokowaniu komórek dodaj 50 µL na dołek przeciwciał pierwszorzędowych antyviralnych M2 rozcieńczonych w stosunku 1:1000 i inkubuj płytki przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, aby zabarwić obecne białka wirusowe. Po inkubacji przemyj komórki trzy razy w 1% B-S-A-P-B-S i inkubuj je z 100 µL na dołek przeciwciał wtórnych sprzężonych z barwnikiem podczerwonym w rozcieńczeniu 1:200 przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Po zabarwieniu komórek przemyj je trzy razy w sposób opisany wcześniej.

Następnie umieść płytki na szklanej platformie odczytowej skanera podczerwieni Licor Odyssey. W oprogramowaniu Licor Odyssey wybierz ustawienie dla płytki 96-dołkowej. Zidentyfikuj dołki kontrolne ujemne (blank), a następnie zmierz fluorescencję z całej płytki.

Użyj narzędzia do rysowania kształtów automatycznych, aby wyznaczyć obszar zainteresowania (ROI) w centrum dołka testowego. Wykorzystaj ROI z kontroli negatywnej, aby ustawić bazową wartość fluorescencji dla testu, a następnie wprowadź w obrębie ROI dwa przeciwstawne krzyże celownicze dostarczone przez oprogramowanie Odyssey, aby zmierzyć intensywność fluorescencji w całym dołku.

Następnie należy przeskanować płytkę, używając kanału 780 nanometrów do detekcji i 680 nanometrów jako długości fali referencyjnej. Po aktywacji polecenia odczytu zmierzone zostaną intensywności fluorescencji w równomiernych odstępach w obrębie ROI, a następnie zintegrowane zostaną zgromadzone punkty danych.

Mnożnik odchylenia standardowego określi poziom sygnału powyżej linii bazowej, który zostanie uwzględniony w ROI; należy wybrać opcję zintegrowanej intensywności do obliczeń, ponieważ reprezentuje ona całkowitą objętość pikseli dla zdefiniowanych obszarów, niezależnie od ich rozmiaru. Fluorescencję tła zostanie określona na podstawie kontroli pozornie zainfekowanych i zostanie wykorzystana do oszacowania zintegrowanej intensywności w dołkach testowych. Fluorescencja w podczerwieni z podwójnych dołków zawierających seryjne rozcieńczenia miareczonego wirusa służy do stworzenia krzywej wzorcowej.

Krzywą standardową można następnie wykorzystać do oznaczenia mian wirusa w płycie BAL pobranej od zainfekowanych myszy. W tym eksperymencie zaobserwowano istotny wzrost ładunku wirusowego w drugim i czwartym dniu. Jak pokazano tutaj, wirus został usunięty z organizmu do 10. dnia po infekcji.

Miana wirusów zmierzone za pomocą tego testu dobrze korelują z utratą masy ciała myszy po zakażeniu. Technikę tę można zastosować również do próbek ludzkich. Przedstawiono tutaj kwantyfikację wirusa H1N1 z ludzkiego wymazu z nosa.

Granica wykrywalności w tym przypadku wynosi 10³ TCID (dawka zakaźna dla kultur tkankowych). Po obejrzeniu tego filmu będą Państwo mieli również dobrą wiedzę na temat szacowania miana wirusa grypy przy użyciu testu opartego na barwniku podczerwonym. Wizualna prezentacja tej techniki jest kluczowa, ponieważ obsługa obrazownika CORBA może być trudna, a materiał ten pomoże uprościć i zademonstrować nasze metody ilościowego oznaczania mian wirusa na płytkach 96- lub 384-dołkowych.

I na koniec, należy pamiętać, że praca z wirusami może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy stosować środki ochrony osobistej.