Name: Wysokoprzepustowa metoda wykrywania wirusa grypy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Poznaj wysokoprzepustową metodę wykrywania wirusa grypy H1N1 w płynie BAL z myszy z użyciem barwnika podczerwieni i skanera Licor Odyssey. Technika ta umożliwia precyzyjną ilościową analizę w małych objętościach próbek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta jest częściowo finansowana z grantów NIH R01 A1064826-01, U19 AI062627-01, NO1-HHSN26600500032C (przyznanych S.M.). Dziękujemy członkom naszego laboratorium za dyskusje i pomoc techniczną oraz Tinie Heil za krytyczny przegląd manuskryptu. Chcielibyśmy podziękować Davidowi Binie z Laboratorium Departamentu Zdrowia w Milwaukee za hodowlę wirusa i PCR.

<ol><li>Hirst, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+agglutination+of+red+cells+by+allantoic+fluid+of+chick+embryos+infected+with+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The agglutination of red cells by allantoic fluid of chick embryos infected with influenza virus.</a> Science. 94, 22-23 (1941).</li>
<li>Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+polymerase+chain+reaction+as+a+rapid+and+efficient+alternative+to+estimation+of+picornavirus+titers+by+tissue+culture+infectious+dose+50%25+or+plaque+forming+units%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units.</a> Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).</li>
<li>Kalter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemagglutinating+Behavior+of+Mouse+and+Egg-adapted+Type+A+%28PR8%29+Influenza+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hemagglutinating Behavior of Mouse and Egg-adapted Type A (PR8) Influenza Virus.</a> Science. 110, 184-184 (1949).</li>
<li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Plaques+in+Monolayer+Tissue+Cultures+by+Single+Particles+of+an+Animal+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Production of Plaques in Monolayer Tissue Cultures by Single Particles of an Animal Virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 38, 747-752 (1952).</li>
<li>Deyde, V. M., Nguyen, T., Bright, R. A., Balish, A., Shu, B., Lindstrom, S., Klimov, A. I., Gubareva, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+molecular+markers+of+antiviral+resistance+in+influenza+A+%28H5N1%29+viruses+using+a+pyrosequencing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Detection of molecular markers of antiviral resistance in influenza A (H5N1) viruses using a pyrosequencing method.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 53, 1039-1047 (2009).</li>
<li>Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+polymerase+chain+reaction+as+a+rapid+and+efficient+alternative+to+estimation+of+picornavirus+titers+by+tissue+culture+infectious+dose+50%25+or+plaque+forming+units%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units.</a> Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).</li>
<li>Rahman, M., Kieke, B. A., Vandermause, M. F., Mitchell, P. D., Greenlee, R. T., Belongia, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+Directigen+flu+A%2BB+enzyme+immunoassay+and+direct+fluorescent+assay+for+detection+of+influenza+infection+during+the+2004-2005+season%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Microbiology+and+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Performance of Directigen flu A+B enzyme immunoassay and direct fluorescent assay for detection of influenza infection during the 2004-2005 season.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 58, 413-418 (2007).</li>
<li>Landry, M. L., Ferguson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suboptimal+detection+of+influenza+virus+in+adults+by+the+Directigen+Flu+A%2BB+enzyme+immunoassay+and+correlation+of+results+with+the+number+of+antigen-positive+cells+detected+by+cytospin+immunofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Suboptimal detection of influenza virus in adults by the Directigen Flu A+B enzyme immunoassay and correlation of results with the number of antigen-positive cells detected by cytospin immunofluorescence.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 3407-3409 (2003).</li>
<li>Herrmann, B., Larsson, C., Zweygberg, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+and+typing+of+influenza+viruses+A+and+B+by+a+nested+reverse+transcription-PCR%3A+comparison+to+virus+isolation+and+antigen+detection+by+immunofluorescence+and+optical+immunoassay+%28FLU+OIA%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection and typing of influenza viruses A and B by a nested reverse transcription-PCR: comparison to virus isolation and antigen detection by immunofluorescence and optical immunoassay (FLU OIA).</a> J. Clin. Microbiol. 39, 134-138 (2001).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> Am. J. Epidemiol. 27, 493-497 (1938).</li>
<li>Doerr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins%3A+into+the+infrared%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins: into the infrared.</a> Nat. Meth. 6, 482-483 (2009).</li>
<li>Shu, B., Wu, K. H., Emery, S., Villanueva, J., Johnson, R., Guthrie, E., Berman, L., Warnes, C., Barnes, N., Klimov, A., Lindstrom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+performance+of+the+CDC+real-time+reverse+transcriptase+PCR+swine+flu+panel+for+detection+of+2009+A+%28H1N1%29+pandemic+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 2614-2619 (2011).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Niedawny wybuch epidemii grypy ptaków w Azji Południowo-Wschodniej oraz globalny strach przed pandemią grypy świń budzą ogromne obawy w zakresie zdrowia i bezpieczeństwa publicznego. Kluczową uwagę poświęcono opracowaniu szczepionek przeciwko istniejącym i nowym szczepom wirusa grypy. Dostępność szybkich technologii wysokoprzepustowych do precyzyjnej detekcji i dokładnych obliczeń miana wirusa znacząco usprawni leczenie. Do najczęściej stosowanych technik służących do obliczania miana wirusa należą testy tworzenia placków oraz testy hemaglutynacji wirusa grypy. Metodę tworzenia placków opracowano pierwotnie w celu oszacowania miana bakteriofagów, a następnie została ona zaadaptowana przez Renato Dulbecco do obliczania miana wirusów zwierzęcych 4. Aby wykonać ten test, przygotowuje się 10-krotne rozcieńczenia zapasu wirusa grypy lub próbek zwierzęcych, takich jak płyn z BAL, a następnie 0,1 ml aliquoty inokuluje się na monowarstwę komórek MDCK w płytkach 6-dołkowych. Wirusowi pozwala się zaadsorbować na komórkach MDCK, po czym dodaje się pożywkę odżywczą i agarozę. Podczas inkubacji pierwotnie zakażone komórki uwalniają potomstwo wirusa, które rozprzestrzenia się wyłącznie na komórki sąsiednie. Efekt cytopatogenny infekcji wirusem grypy powoduje powstanie kolistej strefy zakażonych komórek, zwanej plackiem. Każdy plack powstaje prawdopodobnie po zakażeniu pojedynczej komórki pojedynczą cząsteczką wirusa, a następnie w wyniku replikacji wirusa. Kontrast między żywymi komórkami a plackami można wzmocnić za pomocą barwników, takich jak fiolet krystaliczny. Główną wadą tej metody jest brak powtarzalności i duże różnice w obrębie poszczególnych doświadczeń. Innym testem stosowanym do określania miana wirusa grypy jest test hemaglutynacji. Białko hemaglutynina obecne na powierzchni wirusa grypy efektywnie wiąże się z białkami zawierającymi kwas N-acetyloneuraminowy w erytrocytach ssaków i ptaków 1. Oddziaływanie to między wirusem grypy a erytrocytami prowadzi do aglutynacji w formie sieci. Poziom aglutynacji jest wykorzystywany do oszacowania miana wirusa grypy w badanych próbkach. Test aglutynacji erytrocytów jest stosowany wyłącznie do określania miana znanego wirusa i nie może być użyty do identyfikacji szczepów. Ponieważ test ten nie odróżnia wirusów żywych od martwych, trudno jest uzyskać precyzyjne obliczenia miana wirusów.
Obecna diagnostyka kliniczna zakażeń grypą opiera się na badaniach serologicznych, reakcji polimerazy łańcuchowej, bezpośredniej immunofluorescencji próbek oraz hodowli komórkowych 1,6. Nowa metoda opisana w niniejszej pracy posiada również potencjał diagnostyczny w warunkach klinicznych i laboratoryjnych. Zestawy do wykrywania grypy Directigen FLU-A (BD Biosciences, San Jose, CA) oraz BinaxNow (Binax, Inc., Scarborough, ME) wykorzystują test immunochromatograficzny do wykrywania antygenów wirusowych, takich jak nukleoproteina 7. Przy użyciu tych zestawów wykrycie wirusa jest możliwe w ciągu 15 min; jednak wszystkie próbki negatywne muszą zostać poddane dalszej weryfikacji metodą hodowli komórkowych. W różnych badaniach zgłaszano również niską czułość tych zestawów, szczególnie w przypadkach przebiegu łagodnego lub niskiego poziomu zakażenia 8. W naszej metodzie konsekwentnie wykrywamy ładunek wirusa już na poziomie 100 PFU. Sugeruje to, że nasza technika jest użyteczna w wykrywaniu wirusa H1N1 w próbkach klinicznych, nawet przy łagodnym przebiegu infekcji. Opisano metodę opartą na fluorescencji do wykrywania antygenów wirusowych, w której analizowano bezpośrednio aspiraty z nosogardzieli lub inokulowano je na monowarstwę podatnych komórek w celu namnożenia wirusa i późniejszych analiz 9. Jednak metody te mają ograniczone zastosowanie diagnostyczne i nie nadają się do obliczania miana wirusa. qPCR pomaga zidentyfikować obecność wirusowego RNA, ale nie szacuje zakaźności żywych wirusów. W porównaniu z tymi analizami, system testowy oparty na barwniku IR pomoże w wykrywaniu i oznaczaniu miana wirusa w próbkach klinicznych i laboratoryjnych. W przypadku epidemii grypy kluczowe jest zdiagnozowanie tysięcy próbek w krótkim czasie. Nasza metoda, oparta na płytce 384-dołkowej i skanerze IR, umożliwia skanowanie 6 płytek jednocześnie (&gt;2 000 próbek), co daje znaczną przewagę nad innymi bezpośrednimi metodami fluorescencyjnymi. Możliwość szybkiego przetwarzania tysięcy próbek klinicznych mogłaby zmniejszyć zmienność testów, czas trwania analizy oraz koszty. Zastosowanie przeciwciała specyficznego dla białka M2 daje korzyść w postaci niezależności od różnic szczepowych w białkach H i N. Białko M2 jest stosunkowo konserwatywne w większości szczepów grypy zakażających ludzi. Jeśli przeciwciała specyficzne dla krążących szczepów zostaną połączone z naszym systemem, można będzie zmierzyć miano wirusa oraz zidentyfikować szczep. Jednakże, ponieważ M2 jest celem dla leków podobnych do amantadyny, mogą pojawić się mutanty, które mogą zmienić miejsce wiązania dla użytego tutaj mAb. Stanowi to potencjalne ograniczenie tego systemu u osób leczonych tymi lekami.
Do oznaczania mian wirusa grypy w próbkach testowych stosuje się wiele testów. W celu obliczenia miana wirusa powszechnie wykorzystuje się 50% zakaźną dawkę tkankową (TCID50) oraz testy oparte na płynie allantoicznym jaj 1,10. Jednakże konieczność prowadzenia badań przez wiele dni sprawia, że metody te są mniej wiarygodne. Co więcej, w tych metodach obliczenia oparte na 50% zmianie liczby placków dają wyniki teoretyczne, a nie dokładne miana wirusa. Testy tworzenia placków można przeprowadzić w ciągu 96 godzin, jednak głównym problemem w obliczeniach miana wirusa jest brak powtarzalności. Opisana tutaj technika posiada kilka wyraźnych zalet. Po pierwsze, jest to technika wysoce powtarzalna, dająca spójne wyniki. Po drugie, obliczenia miana wirusa opierają się na prostej kwantyfikacji intensywności fluorescencji, które są porównywane z określonymi krzywymi wzorcowymi. Po trzecie, do diagnostyki wielu serotypów w danej próbce można użyć dwóch lub więcej przeciwciał pierwszorzędowych. Ponadto przeciwciała sprzężone z barwnikami IR wykazują minimalną autofluorescencję i są stosowane do obrazowania komórek 11. Promieniowanie UV lub światło widzialne (300-600 nM) powoduje wysoką autofluorescencję komórkową ze względu na obecność endogennych fluoroforów o wysokiej wydajności kwantowej. Należą do nich aromatyczne aminokwasy, lipopigmenty, nukleotydy pirydynowe (NADPH), elastyna, kolagen i koenzymy flawinowe. Ta immanentna właściwość komórek utrudnia wykorzystanie tych źródeł promieniowania jako sond do ilościowego oznaczania ekspresji specyficznych białek. W przeciwieństwie do nich, barwniki bliskiej podczerwieni (near-IR) pobudzają i emitują światło w zakresie 670-1000 nm. Wiele cząsteczek komórkowych gospodarza i węglowodorów poliaromatycznych nie ulega pobudzeniu przy tej długości fali i ze względu na zredukowane rozpraszanie światła emituje niezwykle niską fluorescencję tła. Co więcej, okno między tłem a specyficzną detekcją jest znacznie szersze dzięki wysokiemu współczynnikowi ekstynkcji fluoroforów bliskiej podczerwieni. Fotostabilność oraz lepszy stosunek sygnału do szumu są niezwykle istotne w kwantyfikacji mian wirusa. Zastosowanie komór mikroprzepływowych zautomatyzuje proces przesiewowy dzięki sterowaniu robotycznemu i mogłoby umożliwić nam łatwe badanie wysoce zaraźliwych próbek klinicznych. Zatem wykorzystanie barwników bliskiej podczerwieni w tych metodach jest optymalne i wysoce wiarygodne w celu oznaczania mian wirusa w próbkach tkanek.

<table><tbody><tr><td>Seryjna albumina wołowa</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11750</td><td></td></tr><tr><td>Wirus PR8</td><td></td><td></td><td>Od dr. Thomasa M. Morana</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-mysie IRDye@800</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-32210</td><td>roztwór 1:200</td></tr><tr><td>Skaner IR LI-COR Odyssey</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>9201-01</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 384-dołkowa z płaskim dnem</td><td>Nalge Nunc international</td><td>164730</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa z płaskim dnem</td><td>Nalge Nunc international</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965126</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka RPMI</td><td>Invitrogen</td><td>11875135</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Invitrogen</td><td>25080</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina 100x</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>R001100</td><td></td></tr><tr><td>Piwczan sodu</td><td>Invitrogen</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-M-2</td><td></td><td></td><td>Od dr. Thomasa M. Morana</td></tr><tr><td>mAb anty-NP</td><td>CDC</td><td>V2S2208</td><td>Uzyskano na podstawie MTA</td></tr></tbody></table>

metoda wysokoprzepustowego wykrywania wirusa grypy

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Wirus grypy jest patogenem układu oddechowego, który każdego roku powoduje wysoką zapadalność i śmiertelność w wielu częściach świata. Dlatego precyzyjna diagnostyka zakażającego szczepu oraz szybki, wysokoprzepustowy screening ogromnej liczby próbek klinicznych są kluczowe dla opanowania rozprzestrzeniania się infekcji pandemicznych. Obecna diagnostyka kliniczna zakażeń grypą opiera się na testach serologicznych, reakcji łańcuchowej polimerazy, bezpośredniej immunofluorescencji preparatów oraz hodowlach komórkowych 1,2.
W niniejszej pracy przedstawiamy opracowanie nowej techniki diagnostycznej służącej do wykrywania żywych wirusów grypy. W celu przetestowania skuteczności tej metody z wykorzystaniem komórek MDCK 4 zastosowaliśmy zaadaptowany do myszy ludzki wirus A/PR/8/34 (PR8, H1N1) 3. Komórki MDCK (104 lub 5 x 103 na dołek) hodowano na płytkach 96- lub 384-dołkowych, zainfekowano wirusem PR8, a następnie białka wirusowe wykrywano za pomocą przeciwciał anty-M2 oraz sprzężonego z barwnikiem IR przeciwciała wtórnego. M2 5 oraz hemaglutynina 1 to dwa główne białka markerowe stosowane w wielu różnych testach diagnostycznych. Zastosowanie przeciwciał wtórnych sprzężonych z barwnikiem IR zminimalizowało autofluorescencję występującą przy użyciu innych barwników fluorescencyjnych. Użycie przeciwciał anty-M2 pozwoliło na wykorzystanie intensywności fluorescencji specyficznej dla antygenu jako bezpośredniej miary ilości wirusa. Do pomiaru intensywności fluorescencji wykorzystano skaner IR oparty na systemie LI-COR Odyssey. System ten wykorzystuje dwukanałową detekcję IR opartą na laserach w celu identyfikacji fluoroforów i odróżnienia ich od szumu tła. Pierwszy kanał wzbudza przy 680 nm i emituje przy 700 nm, co pomaga w kwantyfikacji tła. Drugi kanał wykrywa fluorofory, które wzbudzają przy 780 nm i emitują przy 800 nm. Skanowanie zakażonych PR8 komórek MDCK w skanerze IR wykazało jasną fluorescencję zależną od miana wirusa. Spójnie obserwowano dodatnią korelację intensywności fluorescencji z mianem wirusa w zakresie od 102 do 105 PFU. Minimalna, lecz wykrywalna pozytywność, stale obserwowana przy mianach wirusa PR8 rzędu 102-103 PFU, wykazała wysoką czułość barwników bliskiej podczerwieni (near-IR). Stosunek sygnału do szumu określono poprzez porównanie z komórkami MDCK zainfekowanymi pozornie (mock-infected) lub traktowanymi przeciwciałami izotypowymi.
Wykorzystując intensywność fluorescencji z formatów płytek 96- lub 384-dołkowych, skonstruowano standardowe krzywe miareczkowania. W obliczeniach tych pierwszą zmienną był miano wirusa, a drugą zmienną intensywność fluorescencji. W związku z tym zastosowano rozkład wykładniczy do dopasowania krzywej w celu określenia zależności wielomianowej między mianami wirusów a intensywnościami fluorescencji. Podsumowując, wyciągnięto wniosek, że system detekcji białek oparty na barwnikach IR może pomóc w diagnozowaniu zakażających szczepów wirusa i precyzyjnym oznaczaniu miana zakaźnych patogenów.

Metoda ta opisuje zastosowanie systemu obrazowania opartego na barwnikach w podczerwieni do wykrywania H1N1 w płyku z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) zakażonych myszy z wysoką czułością. Metodykę tę można przeprowadzić na płytce 96- lub 384-dołkowej, wymaga ona objętości materiału badawczego &lt;10 μl i umożliwia jednoczesny screening wielu patogenów.

Metoda wysokoprzepustowego wykrywania wirusa grypy

Wirus grypy jest patogenem układu oddechowego, który każdego roku powoduje wysoką zachorowalność i śmiertelność w wielu częściach świata. W związku z tym...

Ogólnym celem tej procedury jest efektywne oznaczanie miana wirusa grypy w drogach oddechowych zainfekowanych myszy. Myszy są najpierw inokulowane donosowo wirusem grypy w wybranych punktach czasowych po infekcji.Myszy są uśmiercane, a następnie pobiera się płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL). Następnie płyn BAL jest wykorzystywany do zakażenia komórek MDCK. Zakażone komórki można następnie barwić w celu wykrycia białek wirusowych przy użyciu specyficznych przeciwciał pierwszorzędowych, a następnie przeciwciał wtórnych sprzężonych z barwnikiem podczerwonym.Sygnały podczerwone są odczytywane przy użyciu skanera Lycor Odyssey, a oprogramowanie Odyssey może być wykorzystane do oznaczenia miana wirusa. Dzięki zastosowaniu krzywej wzorcowej możliwe jest ilościowe określenie miana wirusa. Głównymi zaletami tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami są precyzyjna kwantyfikacja miana wirusa, powtarzalność oraz mała objętość próbki wymagana do przeprowadzenia tego testu.Zastosowania tej techniki można rozszerzyć na diagnostykę i terapię różnych wirusowych chorób układu oddechowego, ponieważ po przeprowadzeniu tej procedury może ona służyć do oznaczania miana wirusa w próbkach klinicznych. W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak liczba kopii wirusa, można przeprowadzić inne metody, np. qPCR. Podczas stosowania tej techniki ważne jest, aby pamiętać o sprawdzeniu wirusa kontrolnego o znanym mianie po zakończeniu procesu.Technika ta otwiera przed badaczami w dziedzinie wirusologii możliwość określania miana wirusa lub barwienia białek wirusowych w próbkach klinicznych. Po opanowaniu metody, procedura ta może zostać wykonana w ciągu 17 godzin. Wykonuje się ją w następujący sposób: najpierw należy zainfekować myszy donosowo 5 000 jednostek tworzących płytkę lub PFU wirusa grypy PR8 w 30 µL sterylnego PBS lub samym PBS jako kontrolą negatywną. W celu pobrania płynu BAL od uśpionych zwierząt, należy najpierw otworzyć jamę klatki piersiowej i za pomocą precyzyjnych sterylnych nożyczek wykonać nacięcie o długości 1 cm równolegle do tchawicy, aby ją odsłonić.Wykonaj niewielkie nacięcie w tchawicy, wprowadź do niej 0,5 milliliters 1%BSA w PBS, a następnie delikatnie odessij płyn z płukania. Płyny z BAL przechowuj w temperaturze negative 20 degrees centigrade w celu ilościowego oznaczenia miana wirusa w płynach z płukania. Najpierw wysiej 5 million komórek MDCK w 20 milliliters kompletnego medium RPMI w kolbie T 75 i inkubuj przez noc w temperaturze 37 degrees centigrade; następnego dnia zbierz komórki i wysiej je na optyczną czarną płytkę 96-dołkową z płaskim dnem w zagęszczeniu 10 000 cells per well.Następnie inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37°C. Delikatnie odessać nadsącz i dwukrotnie przemyć komórki w pełnej, ale bezzbiżkowej pożywce DMEM zawierającej 0,2% BSA zamiast FBS. Po przemyciu komórek dodać do każdego dołka 50 µL płynu BAL lub 50 µL zawiesiny zawierającej znane stężenie wirusa.Następnie do każdej dołki dodaje się 50 µL pożywki DMEM zawierającej trypsynę traktowaną TPCK w stężeniu 0,2 µg/mL w celu zwiększenia przylegania, wnikania i replikacji wirusa. Komórki inkubuje się przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C, aby umożliwić absorpcję wirusa. Następnie do każdej kultury w dołkach dodaje się 100 µL kompletnej pożywki RPMI z dodatkiem FBS i inkubuje komórki przez noc, aby umożliwić propagację infekcji po zakończeniu inkubacji nocnej.Przemyj komórki 100 µL 1% B-S-A-P-B-S. Po przemyciu komórek dodaj do każdej studni 100 µL 1% paraformaldehydu i inkubuj płytki przez pięć minut w temperaturze pokojowej w celu utrwalenia komórek. Następnie przemyj komórki 100 µL 1% B-S-A-P-B-S na studnię i inkubuj przez kolejne 30 minut w celu blokowania. Po zablokowaniu komórek dodaj do każdej studni 50 µL przeciwciała pierwszorzędowego przeciwciała antyviralnego M two rozcieńczonego w stosunku 1:1000 i inkubuj płytki przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, aby wybarwić obecne białka wirusowe. Po inkubacji przemyj komórki trzykrotnie w 1% B-S-A-P-B-S i inkubuj je z 100 µL na studnię przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z barwnikiem podczerwonym w rozcieńczeniu 1:200 przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Po wybarwieniu komórek przemyj je trzykrotnie w sposób opisany wcześniej.Następnie umieść płytki na szklanej platformie odczytowej skanera podczerwieni Licor Odyssey. W oprogramowaniu Licor Odyssey wybierz w czytniku ustawienie dla płytki 96-dołkowej. Zidentyfikuj dołki kontrolne ujemne (blank), a następnie zmierz fluorescencję całej płytki.Użyj narzędzia do rysowania automatycznych kształtów, aby zaznaczyć obszar zainteresowania (ROI) w centrum dołka testowego. Wykorzystaj ROI z kontroli negatywnej, aby ustawić bazową wartość fluorescencji dla analizy, a następnie wprowadź do ROI dwa przeciwległe krzyżyki pomiarowe dostępne w oprogramowaniu Odyssey, aby zmierzyć intensywność fluorescencji w obrębie dołka.Następnie należy przeskanować płytkę, używając kanału 780 nanometrów do detekcji oraz 680 nanometrów jako długości fali referencyjnej. Po aktywacji polecenia odczytu zmierzone zostaną intensywności fluorescencji w równych odstępach w obrębie ROI, a następnie zintegrowane zostaną zebrane punkty danych.Mnożnik odchylenia standardowego określi poziom sygnału powyżej linii bazowej, który zostanie uwzględniony w ROI; przy obliczeniach należy wybrać opcję zintegrowanej intensywności (integrated intensity), ponieważ reprezentuje ona netto objętość pikseli dla zdefiniowanych obszarów niezależnie od ich wielkości. Fluorescencja tła zostanie ilościowo określona na podstawie kontroli z pozorowaną infekcją (mock infected controls) i zostanie wykorzystana do oszacowania zintegrowanej intensywności w studzienkach testowych. Podczerwona fluorescencja z powtórzonych studzienek zawierających seryjne rozcieńczenia miareowanego wirusa służy do stworzenia krzywej wzorcowej.Krzywą wzorcową można następnie wykorzystać do oznaczenia mian wirusa w płynie z BAL pobranym od zainfekowanych myszy. W tym eksperymencie zaobserwowano znaczący wzrost ładunku wirusowego w drugim i czwartym dniu. Po zakażeniu wirus został usunięty do 10. dnia, co przedstawiono tutaj.Miana wirusa zmierzone za pomocą tego testu dobrze korelują z utratą masy ciała u myszy po zakażeniu. Technikę tę można zastosować również do próbek ludzkich. Przedstawiono tutaj ilościowe oznaczenie wirusa H1N1 z ludzkiego wymazu z nosa.Granica wykrywalności w tym przypadku wynosi 10³ TCID (dawka zakaźna dla kultur tkankowych). Po obejrzeniu tego filmu zdobędą Państwo również wiedzę na temat szacowania miana wirusa grypy za pomocą testu opartego na barwniku podczerwonym. Wizualna demonstracja tej techniki jest kluczowa, ponieważ obsługa obrazownika Corp może być trudna, a materiał ten pomoże uprościć i zaprezentować nasze metody ilościowego oznaczania mian wirusowych na płytkach 96- lub 384-dołkowych.I na koniec, należy pamiętać, że praca z wirusami może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy stosować środki ochrony osobistej.

high-throughput-detection-method-for-influenza-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Metoda wykrywania dużej liczby próbek dla wirusa grypy

Odzyskiwanie wirusów grypy typu A z plazmidowego DNA jest podstawową i niezbędną techniką eksperymentalną, która pozwala badaczom grypy na generowanie wirusów rekombinowanych w celu badania wielu aspektów biologii wirusa grypy, a także do wykorzystania ich jako potencjalnych wektorów lub szczepionek.

Generowanie rekombinowanego wirusa grypy z plazmidowego DNA

Technologia detekcji kolorymetrycznej ampliPHOX jest przedstawiona jako niedroga alternatywa dla detekcji fluorescencyjnej w macierzach mikroukładów. W oparciu o fotopolimeryzację, ampliPHOX wytwarza stałe polimerowe plamki widoczne gołym okiem w zaledwie kilka minut. Wyniki są następnie obrazowane i automatycznie interpretowane za pomocą prostego, a zarazem wydajnego pakietu oprogramowania.

Kolorymetryczna detekcja ampliPHOX na mikrotablicy DNA do wykrywania grypy

Niniejsze badanie opisuje diagnostykę grypy ptaków u dzikiego ptactwa z wykorzystaniem przenośnego systemu rRT-PCR. Metoda ta wykorzystuje liofilizowane odczynniki do badania dzikich ptaków w warunkach poza laboratoryjnymi, typowych dla scenariusza ogniska choroby. Zastosowanie narzędzi molekularnych zapewnia dokładne i czułe alternatywy dla szybkiej diagnostyki.

Szybka diagnostyka wirusa grypy ptaków u dzikich ptaków: wykorzystanie przenośnego urządzenia rRT-PCR i liofilizowanych odczynników w warunkach terenowych

W tym filmie omawiamy korelację między CIT50 a mnogością infekcji wirusowych. Komórki zakażone wirusem wykazują działanie cytopatyczne, powodując ich śmierć i oderwanie od złotej mikroelektrody, co z kolei zmniejsza impedancję.

Test komórkowy oparty na impedancji do pomiaru wielości infekcji wirusem grypy

Film demonstruje test do ilościowego oznaczania wirusów grypy A i B. Test ten wykorzystuje namnażanie endonukleazy za pomocą starterów specyficznych dla grypy i wykrywanie celów za pomocą sond molekularnych.

Test molekularny do ilościowego oznaczania wirusów grypy A i B

Zintegrowany mikroprzepływowy układ termoplastyczny został opracowany do użytku jako diagnostyka molekularna. Chip wykonuje ekstrakcję kwasów nukleinowych, odwrotną transkryptazę i PCR. Opisano metody wytwarzania i uruchamiania chipa.

Wytwarzanie chipów mikroprzepływowych i metoda wykrywania grypy

Korzystając z drukowanej strategii mikromacierzy glikanowej, konwencjonalny test na 96-dołkowej płytce został zminiaturyzowany do analizy awidności hemaglutyniny wirusa grypy A i swoistości dla receptorów zawierających kwas sjalowy.

Zminiaturyzowany test mikromacierzy glikanów do oceny awidności i swoistości hemaglutynin wirusa grypy A

Opisujemy szybki, molekularny test na grypę A i B. Test grypy wykrywa każdy cel w ciągu 15 minut, stosując amplifikację izotermiczną za pomocą starterów specyficznych dla grypy, a następnie wykrywanie celu za pomocą molekularnych sond ostrzegawczych. Test na grypę A i B jest przyjazny dla użytkownika i wymaga minimalnego czasu na wykonanie.

Szybkie wykrywanie molekularne i różnicowanie wirusów grypy A i B

Wysokoprzepustowe testowanie patogenów opartych na DNA i RNA za pomocą nanoskalowego PCR jest opisane za pomocą syndromicznego panelu PCR na psach i koniach.

Wysokoprzepustowe wykrywanie patogenów układu oddechowego w próbkach zwierzęcych metodą nanoscale PCR

To badanie opisuje test mikroneutralizacji oparty na obrazowaniu, aby przeanalizować relacje antygenowe między wirusami. Protokół wykorzystuje skaner płaski i składa się z czterech etapów, w tym miareczkowania, miareczkowania, neutralizacji i kwantyfikacji neutralizacji. Test działa dobrze z obecnymi krążącymi wirusami grypy A(H1N1)pdm09, A(H3N2) i B.

Optymalizacja ilościowego testu mikroneutralizacji

Opisujemy użycie fenotypowego testu hamowania neuraminidazy opartego na fluorescencji do oceny podatności wirusów grypy A i B na inhibitory neuraminidazy klasy leków przeciwwirusowych.

Test hamowania neuraminidazy oparty na fluorescencji w celu oceny wrażliwości wirusów grypy na grupę inhibitorów neuraminidazy leków przeciwwirusowych

Poznaj wysokoprzepustową metodę wykrywania wirusa grypy H1N1 w płynie BAL z myszy z użyciem barwnika podczerwieni i skanera Licor Odyssey. Technika ta umożliwia precyzyjną ilościową analizę w małych objętościach próbek.

Metoda wysokoprzepustowego wykrywania wirusa grypy

Przeglądaj więcej filmów