Name: Ekspansja cytotoksycznych limfocytów T z krwi pępowinowej, które są ukierunkowane na wirusa cytomegalii, wirusa Epsteina-Barr i adenowirusa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: Poznaj metodę generowania cytotoksycznych limfocytów T z krwi pępowinowej ukierunkowanych na wirusy CMV, EBV i adenowirusy. Technika zgodna z GMP umożliwia produkcję komórek do zastosowań klinicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niniejsza praca została sfinansowana z grantu badawczego Dan L. Duncan (C.M.B i E.J.S), Narodowego Instytutu Serca, Płuc i Krwi (US4HL081007), nagrody Clinical Research Scholar przyznanej przez Leukemia and Lymphoma Society (C.M.B) oraz Narodowy Instytut Nowotworów (RO1 CA06150816; E.J.S).

1. Izolacja komórek mononuklearnych (dzień 0)
 <ol>
 <li>Wprowadź kolec żeńskiego adaptera Luera do portu wylotowego frakcji 20% jednostki krwi pępowinowej, podłącz strzykawkę i odessij krew. Przenieś rozmrożoną krew do 20 mL podgrzanego medium RPMI w probówce wirówkowej o pojemności 50 mL. Przepłucz worek z krwią pępowinową 5 mL RPMI i przenieś płuczkę do tej samej probówki wirówkowej.</li>
 <li>Wiruj komórki przez 10 minut przy 400 x g. Odessij supernatant.</li>
 <li>Resuspenduj komórki w 20 mL ciepłego RPMI. Nanieś komórki warstwą na 15 mL Lymphoprep w probówce wirówkowej o pojemności 50 mL. Wiruj przez 40 minut przy 400 x g.</li>
 <li>Zbierz warstwę graniczną zawierającą komórki mononuklearne i przemyj je w 20 mL RPMI.
Wiruj przez 10 minut przy 450 x g.
</li>
 <li>Odessij supernatant i przemyj komórki w 20 mL RPMI. Policz komórki i wiruj przez 5 minut przy 400 x g.</li>
 <li>Odessij supernatant i resuspenduj komórki w stężeniu 5 x 106 komórek mononuklearnych/mL w medium Cellgenix DC (bezwerserumowe). Pobierz 1 mL do generowania EBV-LCL i przenieś do probówki wirówkowej o pojemności 15 mL.</li>
 </ol>
2. Generowanie komórek dendrytycznych (rozpoczęcie w dniu 0)
 <ol>
 <li>Do każdej studni płytki 6-dołkowej nanieść 2 mL komórek (o stężeniu 5 x 106 komórek/mL w pożywce DC). Inkubować przez 1-2 godziny.</li>
 <li>Po 1-2 godzinach usunąć komórki nieprzylegające, płcząc 3-4 razy PBS. Zebrać komórki nieprzylegające i zamrozić. Do każdej studni dodać 2 mL pożywki DC zawierającej 1000 U/mL IL-4 oraz 800 U/mL GM-CSF.</li>
 <li>3-4 dni po inicjacji DC uzupełnić IL-4 oraz GM-CSF, dodając 100 μL/studnię pożywki o końcowym stężeniu 1000 U/mL IL-4 i 800 U/mL GM-CSF.</li>
 <li>W 5. lub 6. dniu zebrać DC, zeskrobując je ze studni za pomocą pipety transferowej. Policzyć duże komórki i odwirować przez 5 minut przy 400 x g. Odessać pożywkę i resuspender DC w pożywce DC w stężeniu 2x106 komórek/mL. Przenieść po 0,5 mL na studnię do płytki 24-dołkowej.</li>
 <li>Przeprowadzić transdukcję DC przy użyciu wektora Ad5f35pp65 przy MOI wynoszącym 10 jednostek infekcyjnych na komórkę. Dodać wektor do każdej studni w płytce 24-dołkowej. Inkubować komórki przez 1,5 godziny. Po 1,5 godziny dodać 1,5 mL/studnię pożywki DC zawierającej: 1000 U/mL IL-4, 800 U/mL GM-CSF, 10 ng/mL TNF-alpha, 1 μg/mL PGE-1, 100 ng/mL IL-6 oraz 10 ng/mL IL-1beta. Cytokiny te służą do dojrzewania komórek DC.</li>
</ol>
3. Generowanie EBV-LCL (począwszy od dnia 0)
 <ol>
 <li>Odwiruj probówkę zawierającą 5 x 106 komórek jednojądrowych. Dodaj 200 μL skoncentrowanego supernatantu EBV B95.8 oraz 1,8 mL pełnej pożywki (RPMI + 10% FBS + 2mM L-glutaminy) zawierającej cyklosporynę (1 μg/mL).</li>
 <li>Rozdziel komórki w aliquotach po 100 μL do 10 studzienek płytki 96-dołkowej oraz po 200 μL do 5 studzienek. Do studzienek zawierających jedynie 100 μL komórek dodaj 100 μL pełnej pożywki z cyklosporyną. Pozostałe studzienki wypełnij sterylną wodą.</li>
 <li>Dokarmiaj LCL co tydzień i przenieś hodowlę z płytki 96-dołkowej do płytki 24-dołkowej po około 2 tygodniach. Po kolejnym tygodniu przenieś komórki do kolby T25, a w następnym tygodniu do kolby T75. Na tym etapie zaleca się zamrożenie aliquotów LCL. Wygenerowanie wystarczającej liczby LCL zajmuje zazwyczaj 1 miesiąc.</li>
 </ol>
4. Inicjacja CTL – 7 dni po inicjacji komórek DC
 <ol>
 <li>Zebrać komórki DC i napromieniować dawką 30 Gy. Przemyć 4 razy i policzyć. Resuspendować DC w pożywce do limfocytów T zawierającej surowicę ludzką (45% RPMI, 45% CLICK's, 10% surowicy ludzkiej, 2mM L-glutaminy) w stężeniu 1 x 105 DCs/mL.</li>
 <li>Rozmrozić komórki nieprzylegające z kroku 2.2. Przemyć komórki i policzyć. Resuspendować w stężeniu 2 x 106 komórek nieprzylegających/mL w pożywce do limfocytów T zawierającej surowicę ludzką. Dodać 10 ng/mL IL-7 i IL-12 oraz 5 ng/mL IL-15. Przenieść po 1 mL komórek do każdej studni płytki 24-dołkowej. Dodać 1 mL komórek DC do każdej studni. Puste studnie płytki 24-dołkowej wypełnić wodą sterylną. 
</li>
 <li>7 dni po inicjacji limfocytów T dokarmić i/lub przesiewać komórki, używając pożywki do limfocytów T zawierającej surowicę ludzką.</li>
 <li>9-12 dni po inicjacji limfocytów T zamrozić limfocyty T do czasu przygotowania linii LCL.</li>
 <li>Po namnożeniu i pasażowaniu LCL w kolbach T75, przeprowadzić transdukcję LCL poprzez wirowanie przez 5 minut przy 400 x g. Dodać wektor do osadu komórkowego przy MOI wynoszącym 100 jednostek zakaźnych na komórkę. Inkubować przez 1,5 godziny. Po 1,5 godzinach resuspendować w pożywce kompletnej w stężeniu 5 x 105 LCL/mL i dodać po 2 mL do każdej studni płytki 24-dołkowej.12</li>
 <li>Po 2 dniach zebrać LCL i napromieniować dawką 40 Gy. Przemyć 4 razy i policzyć. Resuspendować LCL w pożywce do limfocytów T zawierającej surowicę ludzką w stężeniu 2,5 x 105 komórek/mL. Dodać 1 mL LCL do każdej studni płytki 24-dołkowej. Dodatkowo przenieść 5 x 106 LCL do urządzenia hodowlanego Grex40 oraz dodać 5 ng/mL IL-15.13</li>
 <li>Zebrać limfocyty T. Wirować przez 5 minut przy 400 x g, odprowadzić naddestylat i resuspendować w pożywce do limfocytów T zawierającej surowicę ludzką w stężeniu 1 x 106 limfocytów T/mL. Dodać 5 ng/mL IL-15 i przenieść po 1 mL/studnię limfocytów T (łącznie 1 x 106 limfocytów T) do LCL znajdujących się już w płytce 24-dołkowej. W urządzeniu Grex40 uzupełnić całkowitą objętość pożywki do 30 mL.</li>
 <li>W 3-4 dniu po stymulacji, jeśli komórki osiągnęły konfluencję, przesiewać je (na płytce) w stosunku 1:1 i dodać świeżą pożywkę zawierającą 50 U/mL IL-2. Jeśli nie osiągnęły konfluencji, po prostu odprowadzić ½ pożywki i zastąpić ją pożywką zawierającą 50 U/mL IL-2. W urządzeniu Grex40 odprowadzić połowę pożywki, zastąpić świeżą pożywką i dodać 50 U/mL IL-2.</li>
 <li>W 7 dniu powtórzyć czynność zgodnie z krokiem 4.6, ale w dniu stymulacji zastosować IL-2 zamiast IL-15.</li>
 </ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Schemat zgodnego z GMP i zatwierdzonego przez FDA protokołu produkcyjnego przedstawiono na Rysunku 1. Proces ten trwa około 50 dni. Typowe metody generowania limfocytów T swoistych dla wirusa opierają się na namnażaniu istniejących limfocytów T pamięci; jednak krew pępowinowa nie zawiera limfocytów T z doświadczeniem wirusowym, dlatego konieczne jest pobudzenie naiwnych limfocytów T ex vivo. W tym celu wykorzystujemy komórki dendrytyczne oraz cytokiny IL-7, IL-12 i IL-15, które są niezbędne do wygenerowania swoistości wirusowej.
Po 3 stymulacjach wydajność powinna przekroczyć 100x106 komórek. Jeśli nie uzyskano wystarczającej liczby komórek, można przeprowadzić dodatkowe stymulacje, aż do uzyskania pożądanej liczby CTL. Większość tych komórek powinna być CD3+, z mieszaniną limfocytów T CD4+ i CD8+. Odsetek komórek NK (CD3-/CD56+) powinien wynosić mniej niż 15%, a limfocytów B CD19+ mniej niż 1% (Rysunek 2).
Rozszerzone CTL powinny rozpoznawać antygen pp65 z CMV, hekson i penton z adenowirusa, a także liczne antygeny EBV wykazujące ekspresję na EBV-LCL. W teście ELISPOT CTL powinny wydzielać więcej IFN-? w odpowiedzi na te antygeny niż na antygeny nieistotne (Rysunek 3).
Limfocyty CTL powinny również lizować cele pulsowane peptydami wirusowymi, takie jak blasty PHA. W teście uwalniania 51Cr limfocyty CTL powinny lizować LCL pulsowane CMVpp65 oraz cele pulsowane heksonem i/lub pentonem adenowirusa, ale nie cele pulsowane nieistotnymi peptydami (Rycina 4).
<img src="/files/ftp_upload/3627/3627fig1.jpg" alt="Schemat procesu dojrzewania DC przedstawiający izolację PBMC, indukcję cytokin i tworzenie LCL." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1."> Rysunek 1. Generowanie CTL specyficznych dla wielu wirusów z krwi pępowinowej. Schemat przedstawiający cały proces wytwarzania CTL z krwi pępowinowej. Najpierw komórki mononuklearne krwi pępowinowej są izolowane z 20% frakcji rozwarstwionej jednostki krwi pępowinowej. Z wyjątkiem 5x106 komórek zarezerwowanych do generowania LCL, wszystkie komórki są następnie wysiewane w pożywce dla komórek dendrytycznych na 1-2 godziny, po czym zbiera się i mrozi komórki nieprzywierające. Następnie komórki DC są hodowane w pożywce DC zawierającej IL-4 i GM-CSF. Po 5 dniach hodowli komórki DC dojrzewają i są transdukowane wektorem adenowirusowym zawierającym immunodominujący antygen CMV pp65. Na początku komórki DC są łączone z komórkami nieprzywierającymi oraz cytokinami IL-7, IL-12 i IL-15. Podczas kolejnych stymulacji ten sam wektor adenowirusowy jest wykorzystywany do transdukcji EBV-LCL, które służą jako komórki prezentujące antygen. Podczas drugiej stymulacji stosuje się IL-15, a w dalszej kolejności IL-2.
<img src="/files/ftp_upload/3627/3627fig2.jpg" alt="Wykresy kropkowe z cytometrii przepływowej dla markerów CD3, CD4, CD8, CD19, CD56, pokazujące procentowe udziały populacji komórek." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2."> Rycina 2. Fenotyp uzyskanych limfocytów T. Przedstawiono procent żywych komórek w bramce limfocytów. CTL są CD3+ oraz CD4+ lub CD8+, lecz w przeważającej mierze CD3-/CD56- i CD19-.
<img src="/files/ftp_upload/3627/3627fig3.jpg" alt="Wykres słupkowy przedstawiający liczbę plamek IFN-γ/10^5 CTL; wyniki testu odpowiedzi immunologicznej dla CTL, IE-1, Ad Hexon, CMV pp65, EBV LCL." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3."> Rysunek 3. Funkcjonalność limfocytów T. Specyficzność limfocytów T badano za pomocą testu IFN- γELISPOT. Limfocyty T poddano inkubacji z nakładającymi się peptydami obejmującymi całe białka hexonu, pentonu, pp65 oraz nieistotnym antygenem IE-1. CTL alone oznacza zastosowanie samego medium. Autologiczne LCL zostały napromieniowane i dodane w ilości 1x105/studzienkę. Przedstawiono średnią liczbę komórek tworzących plamki z trzech powtórzeń.
<img src="/files/ftp_upload/3627/3627fig4.jpg" alt="Wpływ stosunku efektorów do celu na lizę komórek; wykres liniowy; porównanie IE-1, Ad Hexon, CMV pp65, EBV LCL." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4."> Rysunek 4. Aktywność cytolityczna CTL. Zdolność otrzymanych CTL do lizy celów wykazujących antygeny wirusowe została zbadana w teście z użyciem 51Cr. Autologiczne blasty PHA znakowane 51Cr poddano pulsacji nakładającymi się peptydami obejmującymi cały antygen lub autologiczne LCL znakowane 51Cr hodowano wspólnie z CTL. Po 4 godzinach zmierzono uwalnianie promieniowania gamma za pomocą licznika gamma.

<ol><li>Kennedy-Nasser, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparable+outcome+of+alternative+donor+and+matched+sibling+donor+hematopoietic+stem+cell+transplant+for+children+with+acute+lymphoblastic+leukemia+in+first+or+second+remission+using+alemtuzumab+in+a+myeloablative+conditioning+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Comparable outcome of alternative donor and matched sibling donor hematopoietic stem cell transplant for children with acute lymphoblastic leukemia in first or second remission using alemtuzumab in a myeloablative conditioning regimen.</a> Biol. Blood Marrow Transplant. 14, 1245-1245 (2008).</li>
<li>Hanley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+clinical+outcomes+using+adoptively+transferred+immune+cells+from+umbilical+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Improving clinical outcomes using adoptively transferred immune cells from umbilical cord blood.</a> Cytotherapy. 12, 713(2010).</li>
<li>Szabolcs, P., Cairo, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unrelated+umbilical+cord+blood+transplantation+and+immune+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Unrelated umbilical cord blood transplantation and immune reconstitution.</a> Semin. Hematol. 47, 22(2010).</li>
<li>Canto, E., Rodriguez-Sanchez, J. L., Vidal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+response+of+naive+lymphocytes+from+cord+blood+to+primary+activation+via+TCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinctive response of naive lymphocytes from cord blood to primary activation via TCR.</a> J. Leukoc. Biol. 74, 998-998 (2003).</li>
<li>Leen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoculture-derived+T+lymphocytes+specific+for+multiple+viruses+expand+and+produce+clinically+relevant+effects+in+immunocompromised+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Monoculture-derived T lymphocytes specific for multiple viruses expand and produce clinically relevant effects in immunocompromised individuals.</a> Nat. Med. 12, 1160-1160 (2006).</li>
<li>Riddell, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+viral+immunity+in+immunodeficient+humans+by+the+adoptive+transfer+of+T+cell+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Restoration of viral immunity in immunodeficient humans by the adoptive transfer of T cell clones.</a> Science. 257, 238(1992).</li>
<li>O'Reilly, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+antigen-specific+T-cells+of+donor+type+for+immunotherapy+of+viral+infections+following+allogeneic+hematopoietic+cell+transplants%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Res%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of antigen-specific T-cells of donor type for immunotherapy of viral infections following allogeneic hematopoietic cell transplants.</a> Immunol. Res. 38, 237-237 (2007).</li>
<li>Peggs, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+cellular+therapy+for+early+cytomegalovirus+infection+after+allogeneic+stem-cell+transplantation+with+virus-specific+T-cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Adoptive cellular therapy for early cytomegalovirus infection after allogeneic stem-cell transplantation with virus-specific T-cell lines.</a> Lancet. 362, 1375-1375 (2003).</li>
<li>Sili, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+expansion+of+dendritic+cell-primed+polyclonal+human+cytotoxic+T-lymphocyte+lines+using+lymphoblastoid+cell+lines+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Large-scale expansion of dendritic cell-primed polyclonal human cytotoxic T-lymphocyte lines using lymphoblastoid cell lines for adoptive immunotherapy.</a> J. Immunother. 26, 241(2003).</li>
<li>Bollard, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Good+manufacturing+practice-grade+cytotoxic+T+lymphocytes+specific+for+latent+membrane+proteins+%28LMP%29-1+and+LMP2+for+patients+with+Epstein-Barr+virus-associated+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Good manufacturing practice-grade cytotoxic T lymphocytes specific for latent membrane proteins (LMP)-1 and LMP2 for patients with Epstein-Barr virus-associated lymphoma.</a> Cytotherapy. 13, 518(2011).</li>
<li>Hanley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+active+virus-specific+T+cells+that+target+CMV%2C+adenovirus%2C+and+EBV+can+be+expanded+from+naive+T-cell+populations+in+cord+blood+and+will+target+a+range+of+viral+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Functionally active virus-specific T cells that target CMV, adenovirus, and EBV can be expanded from naive T-cell populations in cord blood and will target a range of viral epitopes.</a> Blood. 114, 1958(1958).</li>
<li>Hanley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+T+cells+targeting+multiple+antigens+of+cytomegalovirus%2C+Epstein-Barr+virus+and+adenovirus+to+provide+broad+antiviral+specificity+after+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Expansion of T cells targeting multiple antigens of cytomegalovirus, Epstein-Barr virus and adenovirus to provide broad antiviral specificity after stem cell transplantation.</a> Cytotherapy. , (2011).</li>
<li>Gerdemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Multivirus-specific+T+Cells+to+Prevent%2Ftreat+Viral+Infections+after+Allogeneic+Hematopoietic+Stem+Cell+Transplant%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant.</a> J. Vis. Exp. (51), e2736(2011).</li>
<li>Mori, T., Kato, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomegalovirus+infection%2Fdisease+after+hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Cytomegalovirus infection/disease after hematopoietic stem cell transplantation.</a> Int. J. Hematol. 91, 588(2010).</li>
<li>Einsele, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infusion+of+cytomegalovirus+%28CMV%29-specific+T+cells+for+the+treatment+of+CMV+infection+not+responding+to+antiviral+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Infusion of cytomegalovirus (CMV)-specific T cells for the treatment of CMV infection not responding to antiviral chemotherapy.</a> Blood. 99, 3916(2002).</li>
<li>Bao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+cytomegalovirus+pp65+and+IE-1+specific+cytotoxic+T+lymphocytes+for+cytomegalovirus-specific+immunotherapy+following+allogeneic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Expansion of cytomegalovirus pp65 and IE-1 specific cytotoxic T lymphocytes for cytomegalovirus-specific immunotherapy following allogeneic stem cell transplantation.</a> Biol. Blood Marrow Transplant. 14, 1156(2008).</li>
<li>Shpall, E. J., Bollard, C. M., Brunstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cord+blood+transplant+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Novel cord blood transplant therapies.</a> Biol. Blood Marrow Transplant. 17, Suppl 1. S39-S45 (2011).</li>
<li>Vera, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+production+of+antigen-specific+T+cells+for+preclinical+and+clinical+applications+using+gas-permeable+rapid+expansion+cultureware+%28G-Rex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex.</a> J. Immunother. 33, 305(2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Obecne strategie nakierowane na kontrolowanie infekcji wirusowych po CBT mogą być skuteczne, ale wiążą się ze znaczną toksycznością, są kosztowne i nie zapewniają długotrwałej ochrony przed późniejszym zakażeniem. W rzeczywistości stosowanie niektórych leków przeciwwirusowych może ograniczać ekspansję swoistych dla wirusa limfocytów T, które w przeciwnym razie działałyby ochronnie.14 Inną opcją jest infuzja limfocytów T swoistych dla wirusa pochodzących od dawcy. My oraz inni wykazaliśmy, że takie limfocyty T ...

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>21870-076</td><td></td></tr><tr><td>podłoże DC</td><td>CellGenix</td><td>20801-0500</td><td></td></tr><tr><td>EHAA (Click&amp;rsquo;pożywka Medium)</td><td>Irvine Scientific</td><td>9195</td><td></td></tr><tr><td>Surowica ludzka</td><td>Gemini Bio Products</td><td>&lt;silny&gt;100-110&lt;/strong&gt;&lt;silny&gt; &lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia hodowlane przepuszczalne dla gazów&lt;sup&gt;18&lt;/sup&gt; </td><td>Wilson Wolf Manufacturing</td><td>80040S</td><td></td></tr><tr><td>IL-2</td><td>Chiron (TCH Pharmacy)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-12</td><td>Krajowy Instytut Raka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-15</td><td>CellGenix</td><td>1013-050</td><td></td></tr><tr><td>IL-7</td><td>R&amp;D Systems</td><td>AFL207</td><td></td></tr><tr><td>IL-1beta</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AFL201</td><td></td></tr><tr><td>IL-6</td><td>CellGenix</td><td>1004-050</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Apteka TCH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>R&amp;D Systems</td><td>&lt;a href=&quot;**Zestaw ELISA do oznaczania ludzkiej interleukiny 2 (IL-2)**

**Przegląd**
Zestaw ELISA do oznaczania ludzkiej interleukiny 2 (IL-2) to zestaw typu „sandwich” (kanapkowy), przeznaczony do ilościowego oznaczania ludzkiej IL-2 w próbkach surowicy, osocza, medium hodowlanego lub innych płynach ustrojowych.

**Zasada działania**
W tym teście przeciwciało przeciwko ludzkiej IL-2 jest unieruchomione na płytce. Próbki i standardy zawierające ludzką IL-2 są dodawane do studzienek, gdzie IL-2 wiąże się z przeciwciałem. Po przemyciu studzienek dodaje się biotynilowane przeciwciało przeciwko ludzkiej IL-2, które wiąże się z kompleksem przeciwciało-antygem. Po kolejnym przemyciu dodaje się streptawidynę sprzężoną z peroksydazą chrzanową (HRP). Reakcja enzymatyczna z substratem TMB generuje sygnał kolorystyczny, który jest proporcjonalny do ilości IL-2 w próbce.

**Produkty**
Zestaw zawiera:
* Płytkę z unieruchomionym przeciwciałem przeciwko ludzkiej IL-2
* Standard ludzkiej IL-2
* Biotynilowane przeciwciało przeciwko ludzkiej IL-2
* Streptawidynę sprzężoną z HRP
* Bufor do rozcieńczania próbek
* Bufor do przemywania
* Substrat TMB
* Roztwór stopujący
* Wodę destylowaną

**Procedura**
1. **Przygotowanie standardów i próbek**: Rekonstruuj standard IL-2 zgodnie z instrukcją i przygotuj szereg rozcieńczeń w buforze do rozcieńczania próbek. Rozcieńcz próbki w odpowiednim buforze.
2. **Dodawanie próbek**: Wlej 100 $\mu$l standardów lub próbek do odpowiednich studzienek płytki. Inkubuj przez 2 godziny w temperaturze 37°C.
3. **Przemywanie**: Odessij ciecz i przemyj studzienki buforem do przemywania 3 razy.
4. **Dodawanie biotynilowanego przeciwciała**: Dodaj 100 $\mu$l biotynilowanego przeciwciała przeciwko ludzkiej IL-2 do każdej studzienki. Inkubuj przez 1,5 godziny w temperaturze 37°C.
5. **Przemywanie**: Odessij ciecz i przemyj studzienki buforem do przemywania 3 razy.
6. **Dodawanie sprzężenia**: Dodaj 100 $\mu$l streptawidyny sprzężonej z HRP do każdej studzienki. Inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37°C.
7. **Przemywanie**: Odessij ciecz i przemyj studzienki buforem do przemywania 5 razy.
8. **Rozwój sygnału**: Dodaj 100 $\mu$l substratu TMB do każdej studzienki. Inkubuj w ciemności przez około 30 minut.
9. **Zatrzymanie reakcji**: Dodaj 50 $\mu$l roztworu stopującego do każdej studzienki.
10. **Odczyt**: Zmierz absorbancję przy długości fali 450 nm za pomocą spektrofotometru.

**Analiza danych**
Wykreśl wartości absorbancji standardów w funkcji stężenia IL-2, aby stworzyć krzywą kalibracyjną. Oblicz stężenie ludzkiej IL-2 w próbkach, korzystając z tej krzywej i uwzględniając czynnik rozcieńczenia.

**Przechowywanie**
Przechowywać wszystkie komponenty w temperaturze 2-8°C. Nie zamrażać.&quot; Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.&quot;_puste&quot;&gt;AFL204&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>TNF-alfa</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AFL210</td><td></td></tr><tr><td>Ad5f35pp65</td><td>Zakład Produkcji Wektorów BCM CAGT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do transferu osocza z żelejącym adapterem luer</td><td>Charter Medical</td><td>89-550-66j</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Nycomed</td><td>1114550</td><td></td></tr></tbody></table>

ekspansja cytotoksycznych limfocytów t z krwi pępowinowej nakierowanych na cytomegalowirus, wirusa epstein-barr i adenowirusa

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Infekcje wirusowe po transplantacji komórek macierzystych należą do najczęstszych przyczyn zgonów, zwłaszcza po transplantacji krwi pępowinowej (CBT), ponieważ krew pępowinowa nie zawiera znaczącej liczby limfocytów T z doświadczeniem wirusowym, które mogłyby chronić biorcę przed infekcją.1-4 My oraz inni badacze wykazaliśmy, że wirusowo swoiste limfocyty CTL generowane z seropozytywnych dawców i przetaczane biorcy są bezpieczne i pełnią funkcję ochronną.5-8 Jednakże aż do niedawna nie było możliwe generowanie wirusowo swoistych limfocytów T z krwi pępowinowej, prawdopodobnie ze względu na brak wirusowo swoistych limfocytów T pamięci. 
W celu lepszego odwzorowania warunków primingu naiwnych limfocytów T in vivo, opracowaliśmy metodę wykorzystującą komórki dendrytyczne (DC) pochodzące z krwi pępowinowej (CB), transdukowane wektorem adenowirusowym (Ad5f35pp65) zawierającym immunodominujący antygen CMV pp65, co kieruje swoistość limfocytów T przeciwko CMV i adenowirusowi.9 Na początku wykorzystujemy te dojrzałe komórki DC oraz limfocyty T pochodzące z CB w obecności cytokin IL-7, IL-12 i IL-15.10 Podczas drugiej stymulacji zastosowano limfocyty B przekształcone przez EBV (EBV-LCL), które wykazują ekspresję zarówno latentnych, jak i litycznych antygenów EBV. EBV-LCL transdukowane Ad5f35pp65 są wykorzystywane do stymulacji limfocytów T w obecności IL-15 podczas drugiej stymulacji. Kolejne stymulacje przeprowadzane są z użyciem EBV-LCL transdukowanych Ad5f35pp65 oraz IL-2.
Z 50x106 mononuklearnych komórek krwi pępowinowej (CB) jesteśmy w stanie wygenerować ponad 150 x 106 limfocytów T specyficznych dla wirusa, które lizują cele stymulowane antygenem i uwalniają cytokiny w odpowiedzi na stymulację antygenową.11 Komórki te zostały wytworzone zgodnie z zasadami Dobrej Praktyki Wytwarzania (GMP), wykorzystując jedynie 20% frakcję z frakcjonowanej jednostki krwi pępowinowej, i zostały wdrożone do użytku klinicznego.

W niniejszej pracy opisujemy pierwszą zgodną z dobrą praktyką wytwarzania (GMP) metodę produkcji wirusowo-specyficznych cytotoksycznych limfocytów T (CTL) z krwi pępowinowej, która jest źródłem głównie naiwnych limfocytów T.

Ekspansja cytotoksycznych limfocytów T z krwi pępowinowej nakierowanych na cytomegalowirus, wirusa Epstein-Barr i adenowirusa

Infekcje wirusowe po transplantacji komórek macierzystych należą do najczęstszych przyczyn zgonów, szczególnie po transplantacji krwi pępowinowej (CB), w której ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wygenerowanie cytotoksycznych limfocytów T (CTL) pochodzących z krwi pępowinowej, które rozpoznają antygeny wielu wirusów. Jest to osiągane poprzez wstępną izolację mononuklearnych komórek krwi pępowinowej z frakcji 20% jednostki krwi pępowinowej. Drugim krokiem jest wykorzystanie komórek mononuklearnych do wygenerowania komórek dendrytycznych, linii komórkowych limfoblastów zakażonych wirusem Epsteina-Barr (E-B-V-L-C-L) oraz swoistych dla wirusa CTL.Komórki mononuklearne, zawierające limfocyty T, są stymulowane komórkami transdukowanymi wektorem A five F 35 PP 65. Ostatnim krokiem jest potwierdzenie swoistości wielowirusowych swoistych CTL oraz zamrożenie tych komórek. Ostatecznie swoistość ekspansji CTL w odniesieniu do co najmniej jednego antygenu wirusowego można ocenić za pomocą analizy ELISPOT oraz testów cytotoksyczności.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ objętość krwi rdzeniowej dostępna w frakcji 20% jest bardzo mała, co oznacza, że liczba komórek do analizy jest bardzo ograniczona. Procedura jest również dość złożona i obejmuje generowanie co najmniej trzech różnych typów komórek z tych o

expanding-cytotoxic-t-lymphocytes-from-umbilical-cord-blood-that

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ekspansja limfocytów T cytotoksycznych z krwi pępowinowej, które atakują wirusa cytomegalii, wirusa Epsteina-Barr i adenowirusa

Szybki, prosty i kosztowo efektywny protokół generowania pochodzących od dawcy wielowirusowych specyficznych limfocytów T cytotoksycznych (rCTL) do infuzji dla biorców allogenicznych przeszczepów komórek macierzystych krwi tworzącej (HSCT) będących w grupie ryzyka zakażeń CMV, Adv lub EBV. Ten proces wytwarzania jest zgodny z zasadami GMP i powinien zapewnić szersze wdrożenie immunoterapii limfocytami T poza wyspecjalizowanymi ośrodkami.

Generowanie wielowirusowych swoistych limfocytów T w celu zapobiegania i leczenia infekcji wirusowych po allogenicznym przeszczepieniu hematopoetycznych komórek macierzystych

Opisano nową metodę indukcji i ekspansji antygenowo swoistych limfocytów T, niezależną od komórek dendrytycznych (DC). Sztuczne komórki prezentujące antygen (aAPC) oparte na HLA A2-Ig są ładowane peptydami ograniczonymi przez HLA-A2 w celu efektywnej ekspansji CTL o różnej swoistości antygenowej. Technologia ta wykazuje duży potencjał w zastosowaniu w immunoterapii adoptywnej opartej na CTL.

Sztuczne komórki prezentujące antygen oparte na HLA-Ig dla efektywnej ekspansji ludzkich CTL ex vivo

Limfocyty T regulatorowe CD4+ są silnymi modulatorami immunologicznymi i pełnią ważne funkcje w homeostazie immunologicznej. Niedobór tych komórek we krwi obwodowej sprawia, że badania funkcjonalne są trudne, szczególnie w kontekście zakażenia HIV-1. Opisujemy tutaj metodę izolowania i namnażania funkcjonalnych limfocytów Treg CD4 + z krwi obwodowej od osób zakażonych wirusem HIV-1.

Nowe narzędzia do ekspansji limfocytów T regulatorowych od osób zakażonych wirusem HIV-1

Nowatorskie generacje testów funkcjonalnych, takich jak interferon gamma (IFN-γ) ELISpot, które wykrywają produkcję cytokin na poziomie pojedynczej komórki i zapewniają zarówno ilościową, jak i jakościową charakterystykę odpowiedzi limfocytów T, mogą być używane do oceny komórkowych odpowiedzi immunologicznych skierowanych przeciwko wirusowi ospy wietrznej i półpaśca (VZV).

Opracowanie testu ELISpot IFN-γ do oceny odporności komórkowej specyficznej dla wirusa ospy wietrznej i półpaśca po przeszczepieniu krwi pępowinowej

Celem tego protokołu jest produkcja specyficznych dla patogenów klinicznych limfocytów T przy użyciu laboratoryjnego, zautomatyzowanego urządzenia do wzbogacania komórek drugiej generacji, które zawiera zamknięty system wychwytywania cytokin i nie wymaga dedykowanego personelu ani korzystania z urządzenia GMP. Wygenerowane limfocyty T specyficzne dla wirusa cytomegalii pp65 mogą być bezpośrednio podawane pacjentom.

Zautomatyzowane wzbogacanie komórek limfocytów T specyficznych dla wirusa cytomegalii do zastosowań klinicznych przy użyciu systemu wychwytywania cytokin

Tutaj pokazujemy, jak monocyty są izolowane przez magnetyczne oddzielanie kulek od komórek jednojądrzastych krwi obwodowej po odwirowaniu w gradionym gradifikacji gęstości ludzkiej krwi antykoagulowanej. Po inkubacji przez 5 dni ludzkie monocyty różnicują się w niedojrzałe komórki dendrytyczne i są gotowe do procedur eksperymentalnych w warunkach nieklinicznych.

Wytwarzanie ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów z krwi pełnej

Prezentujemy tutaj aplikację do standardowej techniki immunologicznej (proliferacja OT-I barwiona CFSE) przeznaczonej do szybkiego monitorowania wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T (CTL) za pośrednictwem adiuwantów in vivo. To szybkie oszacowanie zdolności CTL jest przydatne do opracowywania szczepionek profilaktycznych przeciwko patogenom wewnątrzkomórkowym, a także terapeutycznych szczepionek przeciwnowotworowych.

Szybka ocena in vivo zdolności wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T adiuwantu w celu opracowania szczepionki

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania i stereotaktycznego podawania allogenicznych ludzkich limfocytów u myszy z niedoborem odporności z ortotopowymi ludzkimi pierwotnymi guzami mózgu. Badanie to dostarcza dowodów na słuszność koncepcji zarówno wykonalności, jak i skuteczności przeciwnowotworowej immunoterapii komórkowych dostarczanych do mózgu.

Stereotaktyczny transfer adoptywny cytotoksycznych komórek odpornościowych w mysich modelach ortotopowego ludzkiego glejaka wielopostaciowego ksenoprzeszczepów

Prezentowany tutaj jest protokół skutecznego tłumienia replikacji wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) u myszy poprzez wykorzystanie adoptywnego transferu komórek (ACT) limfocytów T specyficznych dla antygenu wirusowego (Ag) pochodzących z komórek macierzystych. Procedura ta może być dostosowana do potencjalnej immunoterapii zakażenia HBV opartej na ACT.

Limfocyty T specyficzne dla wirusa Ag pochodzące z komórek macierzystych hamują replikację HBV u myszy

Przedstawiamy 9-dniowy protokół transdukcji i ekspansji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej makaków rezusów, który daje komórki o doskonałej koekspresji interesujących genów w liczbie wystarczającej do badań infuzyjnych skuteczności komórek.

Transdukcja i ekspansja pierwotnych limfocytów T w ciągu dziewięciu dni z utrzymaniem fenotypu pamięci centralnej

Prezentowany jest protokół ekspansji produktu leczniczego limfocytów T Gamma-Delta (γδ). Limfocyty są izolowane przez elutriację i wzbogacane γδ kwasem zoledronowym i interleukiną-2. Limfocyty T alfa-beta są wyczerpywane za pomocą klinicznego urządzenia do separacji magnetycznej. Komórki γδ są hodowane wspólnie z pochodzącymi z K562, sztucznymi komórkami prezentującymi antygen i ekspandowane.

Ekspansja i wzbogacanie limfocytów T gamma-Delta (γδ) z aferezowanego produktu ludzkiego

Poznaj metodę generowania cytotoksycznych limfocytów T z krwi pępowinowej ukierunkowanych na wirusy CMV, EBV i adenowirusy. Technika zgodna z GMP umożliwia produkcję komórek do zastosowań klinicznych.

Ekspansja cytotoksycznych limfocytów T z krwi pępowinowej, które są ukierunkowane na wirusa cytomegalii, wirusa Epsteina-Barr i adenowirusa (Wideo) | JoVE Journal

Ekspansja cytotoksycznych limfocytów T z krwi pępowinowej nakierowanych na cytomegalowirus, wirusa Epstein-Barr i adenowirusa

Przeglądaj więcej filmów