Name: Model zwierzęcy CYP2D6: jak wywołać autoimmunologiczne zapalenie wątroby u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Poznaj metodę wywoływania autoimmunologicznego zapalenia wątroby u myszy poprzez infekcję adenowirusem CYP2D6. Model ten pozwala badać mechanizmy choroby i odpowiedzi immunologiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niniejsza praca jest wspierana przez Szpital Uniwersytecki Goethego we Frankfurcie oraz grant z Niemieckiej Fundacji Badawczej przyznany U.C.

<ol><li>Manns, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+autoimmune+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of autoimmune hepatitis.</a> Hepatology. 51, 2193-2213 (2010).</li>
<li>Czaja, A. J., Manns, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+Diagnosis%2C+Pathogenesis+and+Management+of+Autoimmune+Hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Advances in the Diagnosis, Pathogenesis and Management of Autoimmune Hepatitis.</a> Gastroenterology. 4, 429-443 (2010).</li>
<li>Christen, U., Hintermann, E., Jaeckel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+animal+models+for+autoimmune+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Liver+Dis%22%5BJournal%5D)">New animal models for autoimmune hepatitis.</a> Semin. Liver Dis. 29, 262-272 (2009).</li>
<li>Christen, U., Holdener, M., Hintermann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+autoimmune+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmun.+Rev%22%5BJournal%5D)">Animal models for autoimmune hepatitis.</a> Autoimmun. Rev. 6, 306-311 (2007).</li>
<li>Czaja, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+autoimmune+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Animal models of autoimmune hepatitis.</a> Expert Rev. Gastroenterol. Hepatol. 4, 429-443 (2010).</li>
<li>Holdener, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+tolerance+to+the+natural+human+liver+autoantigen+cytochrome+P450+2D6+by+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Breaking tolerance to the natural human liver autoantigen cytochrome P450 2D6 by virus infection.</a> J. Exp. Med. 205, 1409-1422 (2008).</li>
<li>Manns, M. P., Griffin, K. J., Sullivan, K. F., Johnson, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LKM-1+autoantibodies+recognize+a+short+linear+sequence+in+P450IID6%2C+a+cytochrome+P-450+monooxygenase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">LKM-1 autoantibodies recognize a short linear sequence in P450IID6, a cytochrome P-450 monooxygenase.</a> J. Clin. Invest. 88, 1370-1378 (1991).</li>
<li>Zanger, U. M., Hauri, H. P., Loeper, J., Homberg, J. C., Meyer, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+against+human+cytochrome+P-450db1+in+autoimmune+hepatitis+type+II%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Antibodies against human cytochrome P-450db1 in autoimmune hepatitis type II.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85, 8256-8260 (1988).</li>
<li>von Herrath, M. G., Fujinami, R. S., Whitton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microorganisms+and+autoimmunity%3A+making+the+barren+field+fertile%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microorganisms and autoimmunity: making the barren field fertile.</a> Nat. Rev. Microbiol. 1, 151-157 (2003).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim.+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab. Anim. (NY). 40, 155-160 (2011).</li>
<li>Forbes, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morbidity+and+mortality+rates+associated+with+serial+bleeding+from+the+superficial+temporal+vein+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim.+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Morbidity and mortality rates associated with serial bleeding from the superficial temporal vein in mice.</a> Lab. Anim. (NY). 39, 236-240 (2010).</li>
<li>Ehser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mimicry+rather+than+identity+beaks+T+cell+tolerance+in+the+CYP2D6+mouse+model+for+human+autoimmune+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Molecular mimicry rather than identity beaks T cell tolerance in the CYP2D6 mouse model for human autoimmune hepatitis.</a> , Forthcoming (2011).</li>
<li>Hintermann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+spreading+of+the+anti-CYP2D6+antibody+response+in+patients+with+autoimmune+hepatitis+and+in+the+CYP2D6+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Epitope spreading of the anti-CYP2D6 antibody response in patients with autoimmune hepatitis and in the CYP2D6 mouse model.</a> J. Autoimmun. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Ando, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+I-restricted+cytotoxic+T+lymphocytes+are+directly+cytopathic+for+their+target+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Class I-restricted cytotoxic T lymphocytes are directly cytopathic for their target cells in vivo.</a> J. Immunol. 152, 3245-3253 (1994).</li>
<li>Zierden, M., Kuhnen, E., Odenthal, M., Dienes, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+and+regulation+of+autoreactive+CD8%2B+T+cells+in+a+transgenic+mouse+model+of+autoimmune+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Effects and regulation of autoreactive CD8+ T cells in a transgenic mouse model of autoimmune hepatitis.</a> Gastroenterology. 139, 975-986 (2010).</li>
<li>Limmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+to+induce+organ-specific+autoimmunity+by+breaking+of+tolerance%3A+importance+of+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Failure to induce organ-specific autoimmunity by breaking of tolerance: importance of the microenvironment.</a> Eur. J. Immunol. 28, 2395-2406 (1998).</li>
<li>Voehringer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Break+of+T+cell+ignorance+to+a+viral+antigen+in+the+liver+induces+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Break of T cell ignorance to a viral antigen in the liver induces hepatitis.</a> J. Immunol. 165, 2415-2422 (2000).</li>
<li>Derkow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+priming+of+CD8+and+CD4+T-cells+in+animal+models+of+autoimmune+hepatitis+and+cholangitis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Differential priming of CD8 and CD4 T-cells in animal models of autoimmune hepatitis and cholangitis.</a> Hepatology. 46, 1155-1165 (2007).</li>
<li>Lapierre, P., Djilali-Saiah, I., Vitozzi, S., Alvarez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+type+2+autoimmune+hepatitis%3A+Xenoimmunization+with+human+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">A murine model of type 2 autoimmune hepatitis: Xenoimmunization with human antigens.</a> Hepatology. 39, 1066-1074 (2004).</li>
<li>Djilali-Saiah, I., Lapierre, P., Vittozi, S., Alvarez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+vaccination+breaks+tolerance+for+a+neo-self+antigen+in+liver%3A+a+transgenic+murine+model+of+autoimmune+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">DNA vaccination breaks tolerance for a neo-self antigen in liver: a transgenic murine model of autoimmune hepatitis.</a> J. Immunol. 169, 4889-4896 (2002).</li>
<li>Christen, U., Hintermann, E., Holdener, M., von Herrath, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+triggers+for+autoimmunity%3A+is+the+%27glass+of+molecular+mimicry%27+half+full+or+half+empty%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Viral triggers for autoimmunity: is the 'glass of molecular mimicry' half full or half empty.</a> J. Autoimmun. 34, 38-44 (2010).</li>
<li>Krebs, P., Scandella, E., Odermatt, B., Ludewig, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+functional+exhaustion+and+deletion+of+CTL+following+immunization+with+recombinant+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rapid functional exhaustion and deletion of CTL following immunization with recombinant adenovirus.</a> J. Immunol. 174, 4559-4566 (2005).</li>
<li>Hintermann, E., Bayer, M., Pfeilschifter, J., Christen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+delivery+of+the+liver+autoantigen+cytochrome+P450+2D6+chronically+activates+hepatic+stellate+cells+and+induces+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Manuscript+Submitted%22%5BJournal%5D)">Adenoviral delivery of the liver autoantigen cytochrome P450 2D6 chronically activates hepatic stellate cells and induces fibrosis.</a> Manuscript Submitted. , (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W poprzednich badaniach często zgłaszano, że eksperymentalne zapalenie wątroby ma charakter jedynie przejściowy, a wiele obecnych modeli autoimmunologicznych chorób wątroby opiera się na dość złożonych protokołach indukcji choroby (przeglądy literatury patrz 3,5). Na przykład niektóre modele wykorzystują myszy transgeniczne wykazujące ekspresję specyficznych antygenów docelowych oraz adoptywnie przeniesione limfocyty T specyficzne dla antygenu docelowego, głównie transgeniczne TcR14,15. Często niezbędna jest dodatkowa infekcja wirusami hepatotropowymi, bakteriami lub pasożytami, aby wywołać chorobę16-18. Alternatywnie, w celu indukcji zapalenia wątroby stosuje się wakcynację DNA plazmidami kodującymi antygeny docelowe, w tym CYP2D619. Wymagana jest jednak dodatkowa wakcynacja plazmidami kodującymi cytokiny prozapalne, takie jak IL-1220. Niestety, z kilkoma wyjątkami15,20, zapalenie wątroby ma charakter jedynie przejściowy.
Model CYP2D66,21 wykorzystuje prostą metodę indukowania autoimmunologicznego zapalenia wątroby poprzez zakażenie myszy adenowirusem ekspresującym hCYP2D6, główny autoantygen w AIH-27,8. Dostarczenie CYP2D6 za pomocą konstrukcji adenowirusowej gwarantuje zarówno bezpośrednie celowanie w wątrobę, jak i miejscowy stan zapalny, który sprzyja przełamaniu tolerancji. Należy jednak zauważyć, że zarówno miano wirusa, jak i droga podania mają kluczowe znaczenie dla tego modelu. Z jednej strony Ad-2D6 jest wirusem z defektem replikacji, w związku z czym wymagane jest wystarczająco wysokie miano wirusa, aby wygenerować krytyczną ilość antygenu w wątrobie. Z drugiej strony zbyt wysokie miano może doprowadzić do śmiertelnej ostrej niewydolności wątroby. Ponadto wcześniej wykazano, że zakażenie myszy wysokimi mianami adenowirusa prowadzi do funkcjonalnego wyczerpania odpowiedzi immunologicznej22. W naszym modelu zastosowaliśmy połączenie zakażenia dożylnego i dosytchniczego, aby uzyskać zarówno przewlekłą infiltrację komórkową, jak i rozległą włóknicę. Zaobserwowaliśmy, że samo zakażenie dożylne nadal powoduje masywną infiltrację komórkową, ale nie wywołuje włóknicy w obszarze podtorebkowym, co wskazuje, że zapalenie otrzewnej spowodowane wstrzyknięciem dosytchniczym może być zaangażowane w ciągłą podtorebkową akumulację kolagenu (Hintermann &amp; Christen, manuskrypt w przygotowaniu). Należy jednak podkreślić, że obserwowana włóknica wątroby jest specyficzna dla antygenu, ponieważ nie stwierdzono aktywacji komórek gwiaździstych wątroby ani odkładania kolagenu po zakażeniu równymi mianami wirusów Ad-GFP lub Ad-Control23.
Model CYP2D6 odzwierciedla wiele aspektów ludzkiego AIH1,2, takich jak przewlekłe zapalenie wątroby charakteryzujące się uporczywą naciekowością komórkową i włóknieniem wątroby6. Ponadto obecność przeciwciał anty-CYP2D6 o wysokim mianie, z podobną specyficznością epitopową i rozprzestrzenianiem się13 do przeciwciał LKM-1 występujących u pacjentów z AIH-2, wskazuje na obecność wspólnej przewlekłej reaktywności autoimmunologicznej. CYP2D6 jest głównym antygenem w AIH-2, lecz nie jest rozpoznawany przez pacjentów z diagnozą częściej występującego typu 1 AIH. Ponadto pacjenci cierpiący na inne choroby wątroby o etiologii autoimmunologicznej, takie jak pierwotna marskość żółciowa (PBC) lub pierwotne stwardniałe zapalenie dróg żółciowych (PSC), wytwarzają charakterystyczne autoprzeciwciała specyficzne dla odrębnych autoantygenów wątrobowych, a ich wątroby wykazują inne cechy patologiczne, koncentrujące się na małych (PBC) lub dużych (PSC) drogach żółciowych. Niemniej jednak modele CYP2D6 dają możliwość analizy immunopatogennych mechanizmów zaangażowanych w przewlekłe procesy zapalne wątroby, jakie występują podczas autoimmunologicznych chorób wątroby, zidentyfikowania kluczowych czynników napędzających autoimmunologiczną destrukcję hepatocytów oraz oceny możliwych interwencji terapeutycznych w celu wyleczenia choroby.

<table><tbody><tr><td>igła 23G</td><td>BD Biosciences</td><td>300800</td><td></td></tr><tr><td>igła 27&amp;frac12;G</td><td>VWR international</td><td>612-0151</td><td></td></tr><tr><td>igła 30&amp;frac12; G</td><td>BD Biosciences</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>paski testowe do oznaczania aminotransferazy alaninowej (GPT/ALT)</td><td>Roche Group</td><td>10 745 138 202</td><td></td></tr><tr><td>paski testowe do oznaczania aminotransferazy asparaginianowej (GOT/AST)</td><td>Roche Group</td><td>10 745 120 202</td><td></td></tr><tr><td>urządzenie do znieczulenia Univentor 400</td><td><a href="http://www.agnthos.se" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AgnTho&amp;#8217;s</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>jednorazowe formy do osadzania, 37x24x10 mm</td><td>VWR international</td><td>720-0208</td><td></td></tr><tr><td>sitko do komórek 70 mm</td><td>VWR international</td><td>734-0003</td><td></td></tr><tr><td>kriostat</td><td>Leica Microsystems</td><td>CM1850 UV</td><td></td></tr><tr><td>kapilary heparynowane</td><td>Fisher Scientific</td><td>3123987</td><td></td></tr><tr><td>szkiełka przedmiotowe Superfrost Plus</td><td>Menzel-Glaser</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>probówki Microtainer SST</td><td>BD Biosciences</td><td>365951</td><td></td></tr><tr><td>płytki mikrotitracyjne z dnem w kształcie V</td><td>VWR international</td><td>391-1924</td><td></td></tr><tr><td>Reflotron Plus</td><td>Roche Group</td><td></td><td>Oznaczanie AST/ALT w surowicy</td></tr><tr><td>królicze przeciwciało anty-mysie przeciwkolagenowe typu I IgG,</td><td>Chemicon International</td><td>AB765P</td><td></td></tr><tr><td>biotynilowane kozie przeciwciało anty-królicze IgG</td><td>Vector Laboratories</td><td>VC-BA-1000-MC15</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-mysie CD8a koniugowane z FITC</td><td>SouthernBiotech</td><td>1550-02</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-mysie IFN&amp;#947; koniugowane z PE</td><td>BD Biosciences</td><td>554412</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-mysie CD16/CD32 koniugowane z PE (blokada FcR)</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Aquatex</td><td>VWR international</td><td>1.08562.0050</td><td></td></tr><tr><td>zestaw blokujący awidyna/biotyna</td><td>Vector Laboratories</td><td>VC-SP-2001-KI01</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldyna A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6542</td><td></td></tr><tr><td>kolagenaza IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138-100MG</td><td></td></tr><tr><td>zestaw substratu DAB 3&amp;rsquo;,3&amp;rsquo;-diaminobenzydyna</td><td>Vector Laboratories</td><td>VC-SK-4100-KI01</td><td></td></tr><tr><td>DNaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN-25</td><td></td></tr><tr><td>odczynnik Elite ABC</td><td>Vector Laboratories</td><td>VC-PK-7100-L050</td><td></td></tr><tr><td>roztwór eozyny G/Y</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>X883.1</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica cielęca (FCS)</td><td>Biochrom AG</td><td>S 0115</td><td></td></tr><tr><td>izofluran</td><td>Forene</td><td>B506</td><td></td></tr><tr><td>roztwór hematoksyliny Meyer&amp;rsquo;a</td><td>AppliChem</td><td>A4840,1000</td><td></td></tr><tr><td>związek OCT</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>formaldehyd 10% w buforze PBS</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>A146.3</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Amersham</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Histokit</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>6638.1</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen</td><td>61870</td><td></td></tr><tr><td>saponina z kory Quillaja</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7900</td><td></td></tr></tbody></table>

model zwierzęcy cyp2d6: jak indukować autoimmunologiczne zapalenie wątroby u myszy

The CYP2D6 Animal Model: How to Induce Autoimmune Hepatitis in Mice

Autoimmunologiczne zapalenie wątroby jest rzadką, lecz zagrażającą życiu autoimmunologiczną chorobą wątroby o nieznanej etiologii1,2. W przeszłości podejmowano wiele prób stworzenia modelu zwierzęcego odzwierciedlającego charakterystykę choroby ludzkiej 3-5. Jednak w różnych modelach indukcja choroby była dość złożona, a zapalenie wątroby często miało charakter przejściowy3-5. Opracowaliśmy zatem prosty model mysi, w którym jako czynnik wyzwalający wykorzystuje się główny ludzki autoantygen występujący w typie 2 autoimmunologicznego zapalenia wątroby (AIH-2), mianowicie hCYP2D66. Przeciwciała typu 1 przeciwko mikroksom wątrobowo-nerkowym (LKM-1) rozpoznające hCYP2D6 są znakiem rozpoznawczym AIH-27,8. Dostarczenie hCYP2D6 do myszy szczepów FVB lub C57BL/6 typu dzikiego odbywało się za pomocą konstruktu adenowirusowego (Ad-2D6), który zapewnia bezpośrednie dostarczenie wyzwalającego antygenu do wątroby. W ten sposób następujący po tym miejscowy stan zapalny tworzy podatne podłoże9 dla późniejszego rozwoju autoimmunizacji. Kombinacja wtryskiwania Ad-2D6 dożylnie i doszczelnie jest najskuteczniejszą drogą indukcji długotrwałych autoimmunologicznych uszkodzeń wątroby (sekcja 1). Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół indukcji autoimmunologicznej choroby wątroby w modelu CYP2D6 oraz sposoby oceny różnych aspektów uszkodzenia wątroby. Po pierwsze, stężenia w surowicy markerów wskazujących na destrukcję hepatocytów, takich jak aminotransferazy, a także miana przeciwciał przeciwko hCYP2D6 są określane poprzez pobieranie krwi z splotu żylnego oczodołowego (sekcja 2). Po drugie, odpowiedź limfocytów T swoistą dla hCYP2D6 jest charakteryzowana poprzez izolację limfocytów ze śledziony i wątroby. Aby uzyskać czyste limfocyty wątrobowe, wątroby są perfundowane PBS przez żyłę wrotną (sekcja 3), trawione kolagenazą i oczyszczane w gradiencie Percoll (sekcja 4). Częstotliwość występowania limfocytów T swoistych dla hCYP2D6 jest analizowana poprzez stymulację peptydami hCYP2D6 i identyfikację komórek produkujących IFNγ za pomocą cytometrii przepływowej (sekcja 5). Po trzecie, naciek komórkowy i włóknienie są określane za pomocą immunohistochemii przekrojów wątroby (sekcja 6). Taki schemat analizy musi być przeprowadzany w kilku punktach czasowych po zainicjowaniu choroby, aby udowodnić chroniczny charakter modelu. Wielkość odpowiedzi immunologicznej, charakteryzowana przez częstotliwość i aktywność swoistych dla hCYP2D6 limfocytów T i/lub B, oraz stopień uszkodzenia wątroby i włóknienia muszą zostać ocenione w celu późniejszej ewaluacji możliwych terapii zapobiegających, opóźniających lub znoszących autodestrukcyjny proces w wątrobie.

Zakażenie myszy adenowirusem wykazującym ekspresję głównego ludzkiego autoantygenu cytochromu P450 2D6 (hCYP2D6), rozpoznawanego przez surowice pacjentów cierpiących na autoimmunologiczne zapalenie wątroby typu 2, prowadzi do utrwalonej formy autoimmunologicznej choroby wątroby charakteryzującej się rozległym zapaleniem wątroby, włóknieniem oraz generowaniem swoistej odpowiedzi immunologicznej przeciwko CYP2D6.

Model zwierzęcy CYP2D6: Jak indukować autoimmunologiczne zapalenie wątroby u myszy

Autoimmunologiczne zapalenie wątroby to rzadka, lecz zagrażająca życiu autoimmunologiczna choroba wątroby o nieznanej etiologii1,2. W przeszłości podejmowano wiele prób w celu...

Ogólnym celem poniższych eksperymentów jest opracowanie i weryfikacja mysiego modelu autoimmunologicznego zapalenia wątroby – ludzkiej autoimmunologicznej choroby wątroby, która charakteryzuje się przewlekłym zapaleniem strefy ograniczającej miąższ wątroby, zapaleniem wątroby, hipergammaglobulinemią oraz produkcją charakterystycznych autoprzeciwciał. W pierwszej kolejności zwierzęta są zakażane konstruktem adenowirusowym wykazującym ekspresję autoantygenu wywołującego chorobę CYP 2D6, aby wywołać miejscowy stan zapalny w wątrobie. Następnie limfocyty wątrobowe są izolowane poprzez perfuzję wątroby i wirowanie w gradiencie gęstości. Ostatecznie uszkodzenie wątroby oraz identyfikację limfocytów T swoistych dla autoantygenu można ocenić odpowiednio za pomocą immunohistochemii oraz wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest fakt, że nasz model autoimmunologicznego zapalenia wątroby charakteryzuje się przewlekłym stanem zapalnym wątroby oraz swoistą dla autoantygenu odpowiedzią immunologiczną, która jest niemal identyczna z odpowiedzią obserwowaną u osób cierpiących na autoimmunologiczne zapalenie wątroby typu drugiego. Nasz model może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie autoimmunologicznych chorób wątroby, takie jak mechanizm postępującego niszczenia wątroby u pacjentów z autoimmunologicznym zapaleniem wątroby. Zazwyczaj w metodzie z użyciem fiolek mamy trudności z przeprowadzaniem infekcji dożylnej i pobieraniem krwi z zatoki żylnej ocznej, a także z perfuzją wątroby, podczas gdy technika porter wearing wymaga praktyki.Po znieczuleniu chwyć mysz za kark i naciągnij luźną skórę głowy kciukiem oraz środkowym palcem. Zauważ, że w tej pozycji oko lekko wystaje z powodu rozciągnięcia skóry sąsiadującej z okiem. Następnie wprowadź igłę do kąta wewnętrznego oka, w miejscu złączenia jednej z powiek najbliżej nosa zwierzęcia, i powoli wstrzyknij 100 µL roztworu wirusa 80 2D six.Następnie lekko wycofaj igłę i zamknij powieki. Rozpocznij od napełnienia pięciomililitrowej strzykawki zimnym PBS i przymocowania do niej igły o rozmiarze 27 G. Następnie, po uśmierceniu myszy, wykonaj nożyczkami nacięcie skóry i warstw mięśni około jednego centymetra od tylnych kończyn zwierzęcia, przecinając obie strony ciała w kierunku przepony.Po dotarciu do przepony, odciągnij skórę do tyłu i odetnij przeponę od żeber za pomocą nożyczek, a następnie wypreparuj żyłę główną dolną. Na tym etapie sekcji odsuń żołądek i jelita na bok, odsłaniając żyłę wrotną. Perfuzja wątroby jest najtrudniejszym elementem procedury, zwłaszcza gdy wątroba jest przewlekle zapalona lub nawet włóknista. Mysz jest dość mała, dlatego do dokładnego nakłucia żyły wrotnej wymagana jest pewna ręka.Ponadto ważne jest, aby PBS podawał powoli, w przeciwnym razie tkanka może ulec uszkodzeniu. Wprowadź wcześniej przygotowaną igłę do żyły wrotnej, a następnie delikatnie naciśnij tłok strzykawki, aby PBS powoli wypłukał krew z wątroby aż do zakończenia perfuzji. Usuń wątrobę, chwytając przeponę pęsetą i odcinając ją od ciała za pomocą nożyczek.Na koniec przenieś organ do szalki Petriego i usuń przeponę, pęcherzyk żółciowy oraz wszelkie inne tkanki wciąż połączone z wątrobą. Należy zauważyć, że wątroba zwierzęcia z autoimmunologicznym zapaleniem wątroby jest zwłókniała, a poszczególne płaty są zrośnięte. Rozpocznij od napełnienia szalki Petriego 10 milliliters świeżego PPS i umieszczenia jej na lodzie.Przenieś perfundowaną wątrobę do szalki i za pomocą nożyczek potnij tkankę na małe kawałki. Następnie przelej tkankę wraz z PBS do sitka komórkowego o oczkach 70 µm i za pomocą szklanego tłuczka przeciskaj kawałki wątroby przez sitko. Teraz ostrożnie wlej 10 mL zimnego buforu z kolagenazą na kawałki tkanki, kontynuując używanie tłuczka w razie potrzeby.Odwirować komórki przy 30 ×g przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść nadsącz do nowej probówki, pozostawiając pięć milimetrów cieczy nad osadem; wirować przy 650 ×g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzucić cały nadsącz z wyjątkiem ostatnich trzech milimetrów.Odwirować osad w 20 mililitrach buforu per call, a następnie po odwirowaniu komórek z prędkością 600 ×g przez 20 minut w temperaturze 4 °C, odlać nadsącz i ponownie zawiesić osad, energicznie potrząsając probówką w modelu CYP 2D six, w którym po zakażeniu myszy typu dzikiego adenowirusem 2D six rozwija się uporczywe autoimmunologiczne zapalenie wątroby. Wątroba wykazuje wyraźnie zmienioną morfologię, co widać na rysunku po prawej stronie. W szczególności płaty wątroby są zlane, co wskazują czarne groty strzałek, a hipertroficzne guzki, wskazane czarnymi strzałkami, są rozproszone w całej wątrobie; widoczne jest również masywne włóknienie torebkowe w porównaniu z kontrolą.Adenowirus niewyrażający ludzkiego CYP 2D6 nie wpływa na morfologię wątroby, co widać na rysunku po lewej stronie. Dalsze rozległe i trwałe nacieki komórkowe pojawiają się w obszarach okołoportalnych i miąższowych wątrób myszy zainfekowanych adenowirusem 2D6, ale nie w myszach zainfekowanych adenowirusem kontrolnym. Należy zwrócić uwagę na znaczące nacieki komórek jednojądrowych występujące tylko u myszy zainfekowanych adenowirusem 2D6, wskazane pojedynczymi czarnymi strzałkami.Potrójne strzałki wskazują na rozległe nacieki komórkowe w miąższu wątroby, tworzące mostki między sąsiednimi polami portalnymi. Na tej rycinie można zaobserwować, że włóknienie rozwija się głównie w obszarze podtorebkowym, z niektórymi pęczkami kolagenu wnikającymi do miąższu. Należy zwrócić uwagę na wielowarstwowe złogi kolagenu pod torebką wątroby, wskazane potrójnymi czarnymi strzałkami, z niektórymi pęczkami wnikającymi do miąższu, co zaznaczono pojedynczymi strzałkami, a także na obecność dużych skupisk naciekających komórek, wskazanych czarnymi grotami strzałek.Trzecią cechą trwałego autoimmunologicznego zapalenia wątroby u myszy zainfekowanych adenowirusem 2D6 jest przeważająca generacja limfocytów T CD4 i CD8 specyficznych dla ludzkiego CYP 2D6 z tropizmem do wątroby, co widać na tych reprezentatywnych wykresach kropkowych z barwienia cytokin wewnątrzkomórkowych; nocna stymulacja limfocytów wątrobowych immunodominującym peptydem ludzkiego CYP 2D6 dla CD4 lub CD8 wywołuje odpowiednio ekspresję interferonu gamma specyficzną dla limfocytów T CD4-dodatnich lub CD8-dodatnich. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że optymalna perfuzja wątroby jest krytycznym krokiem w celu uniknięcia zanieczyszczenia limfocytów wątrobowych monocytoidami krwi obwodowej. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak izolacja pierwotnych komórek steroidowych wątroby, aby zbadać stan aktywacji i potencjał migracyjny limfocytów T po ich rozwoju.Niniejszy model zwierzęcy powinien utorować drogę badaczom z dziedziny autoimmunologicznych chorób wątroby do zbadania kluczowych czynników napędzających przewlekły stan zapalny wątroby oraz do oceny możliwych metod leczenia pacjentów.

the-cyp2d6-animal-model-how-to-induce-autoimmune-hepatitis-in-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Model zwierzęcy CYP2D6: Jak wywołać autoimmunologiczne zapalenie wątroby u myszy

W niniejszym filmie przedstawiono sposób indukowania autoimmunologicznego zapalenia przysadki u myszy szczepu SJL oraz metodę oceny stopnia jego nasilenia za pomocą badania histopatologicznego.

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia przysadki u myszy szczepu SJL

Film demonstruje test z wykorzystaniem ludzkich komórek macierzystych CD8+ pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w celu zahamowania replikacji wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) u myszy. Te limfocyty T, zmodyfikowane za pomocą receptorów specyficznych dla HBV, są przenoszone do myszy transgenicznych. Kompetentne replikacyjnie plazmidy genomu HBV są następnie wstrzykiwane bezpośrednio do wątroby, umożliwiając wychwyt DNA wirusa. Gdy antygeny wirusowe ulegną...

Hamowanie replikacji wirusa zapalenia wątroby typu B za pomocą limfocytów T specyficznych dla antygenu wirusowego

Ten film demonstruje metodę generowania podwójnie humanizowanego modelu myszy z ludzkim układem odpornościowym i komórkami wątroby. Polega na przeszczepieniu ludzkich komórek wątroby oraz hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych transgenicznej myszy z niedoborem odporności poprzez wstrzyknięcie dośledzionowe, co prowadzi do wszczepienia komórek wątroby i rozwoju ludzkich komórek odpornościowych.

Opracowanie humanizowanego modelu myszy z ludzkimi komórkami wątroby i komórkami odpornościowymi

Transfer limfocytów bm12 do biorcy C57BL/6 jest ustalonym modelem tocznia rumieniowatego układowego. Tutaj opisujemy, jak zainicjować chorobę za pomocą tego modelu i jak scharakteryzować komórki pomocnicze pęcherzyków T, komórki B centrum rozrodczego i komórki plazmatyczne za pomocą cytometrii przepływowej.

Indukowany model tocznia rumieniowatego układowego (SLE) bm12 u myszy C57BL/6

Tutaj opisujemy powszechną metodę wywoływania przewlekłego uszkodzenia wątroby u myszy poprzez karmienie dietą ubogą w cholinę i uzupełnioną etyoniną (CDE). Pokazujemy monitorowanie stanu zdrowia, perfuzję wątroby, izolację i konserwację. Sześciotygodniowy przebieg może informować o uszkodzeniu wątroby, patohistologii, zwłóknieniu, zapaleniu i odpowiedziach komórek progenitorowych wątroby.

Model przewlekłego uszkodzenia wątroby z niedoborem choliny i etyoniną (CDE)

Tutaj prezentujemy protokół generowania ludzkiego chimerycznego mysiego modelu hipercholesterolemii rodzinnej wątroby przy użyciu ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych hepatocytów. Jest to cenny model do testowania nowych terapii hipercholesterolemii.

Rodzinny model myszy chimerycznej wątroby hipercholesterolemii przy użyciu indukowanych pluripotencjalnych hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych

Opisujemy model immunizacji in vivo, translacyjnego zapalenia wątroby u myszy BALB/c, który może być wykorzystany do badania patogenezy indukowanego lekami autoimmunologicznego zapalenia wątroby, w tym różnic płci obserwowanych w tej chorobie. Opiszemy, w jaki sposób model ten demonstruje powtarzalne analizy przy użyciu technik eksperymentalnych in vivo i in vitro.

Indukcja indukowanego przez leki, autoimmunologicznego zapalenia wątroby u myszy BALB/c w celu zbadania jego mechanizmów patogennych

Tutaj opisujemy rozwój klinicznie istotnego mysiego modelu raka wątroby, podsumowującego typowe cechy immunologiczne raka wątrobowokomórkowego (HCC).

Onkogenny, indukowany hepatocytami, ortotopowy mysi model raka wątrobowokomórkowego powstającego w warunkach zapalenia i zwłóknienia wątroby

Opisano prosty i niezawodny model gryzoni indukowany dietą dla niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby (NASH), osiągnięty dzięki trzymaniu zwierząt bez SPF i podawaniu specyficznej diety wysokotłuszczowej. Opisujemy identyfikację podzbiorów komórek odpornościowych wątroby i tkanki tłuszczowej w celu podsumowania ludzkich warunków immunologicznych poprzez wystawienie myszy na zarazki środowiskowe.

Zaawansowany mysi model niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby w połączeniu z cukrzycą typu 2

W tym raporcie prezentujemy protokół, który pozwala badaczowi na wygenerowanie mysiego modelu wewnątrzgałkowego zapalenia błony naczyniowej oka. Ten uznany model, częściej określany jako eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka (EAU), obejmuje wiele aspektów chorób u ludzi. W tym miejscu opiszemy, jak indukować i monitorować postęp choroby za pomocą kilku odczytów.

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka: wewnątrzgałkowy model zapalny myszy

Ustalono kilka typów zwierzęcych modeli zapalenia tarczycy Hashimoto, podobnie jak spontaniczne autoimmunologiczne zapalenie tarczycy u myszy NOD. Myszy H-2h4 to prosty i niezawodny model do indukcji HT. W tym artykule opisano to podejście i oceniono proces patologiczny w celu lepszego zrozumienia mysiego modelu SAT.

Generacja modelu spontanicznego autoimmunologicznego zapalenia tarczycy u myszy

Poznaj metodę wywoływania autoimmunologicznego zapalenia wątroby u myszy poprzez infekcję adenowirusem CYP2D6. Model ten pozwala badać mechanizmy choroby i odpowiedzi immunologiczne.

Model zwierzęcy CYP2D6: Jak indukować autoimmunologiczne zapalenie wątroby u myszy

Przeglądaj więcej filmów