Name: System hodowli folii jedwabnej do analizy in vitro i projektowania biomateriałów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Poznaj system hodowli folii jedwabnej do analizy in vitro i projektowania biomateriałów. Ta metoda umożliwia optymalizację kultur komórkowych przed zastosowaniami in vivo w badaniach biomedycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Finansowanie pochodzi z grantów NIH K08EY015829, R21EY019561, R24EY015656, P41 EB002520 oraz R01 EY020856 Research to Prevent Blindness Career Development Award, a także z Tri-Institutional Stem Cell Initiative. Linia komórkowa HCLE została udostępniona dzięki uprzejmości dr Ilene Gipson. Autorzy chcieliby podziękować dr Aihong Liu z Weill Cornell Medical College za pomoc techniczną i wskazówki dotyczące hodowli komórkowych, Anthony Labissiere z Hospital for Special Surgeries za pomoc techniczną przy obrazowaniu SEM, Tissue Engineering Resource Center (TERC) na Tufts University za wsparcie techniczne w opracowywaniu materiałów oraz Cornell Center for NanoScale Science and Technology Facility (CNF) za pomoc w produkcji wafli krzemowych.

1. Wykonanie form z gumy silikonowej
<ol>
	<li>Przygotować lub zakupić odpowiednią powierzchnię topograficzną do odlewu. W niniejszej publikacji opisany zostanie standardowy trawiony wafle krzemowy o średnicy 100 mm (Rycina 1).</li>
	<li>Odważyć polidimetylosiloksan (PDMS) – bazę (komponent A) oraz katalizator (komponent B) w stosunku 1:9 (9 g bazy i 1 g katalizatora), zgodnie z zestawem dostarczonym w zakupionym komplecie.</li>
	<li>Dokładnie wymieszać roztwory, aby rozpocząć proces utwardzania.</li>
	<li>Umieścić powierzchnię wafla krzemowego w naczyniu do odlewania.</li>
	<li>Nanieść 4,5 g roztworu PDMS na wafel krzemowy.</li>
	<li>Rozprowadzić roztwór PDMS tak, aby pokrył obszar o średnicy 100 mm powierzchni wafla.</li>
	<li>Przechylić wafel, aby równomiernie rozprowadzić roztwór PDMS.</li>
	<li>Przykryć wafel pokrywką od szalki Petriego o średnicy 100 mm.</li>
	<li>Umieścić zestaw do odlewania w piekarniku w temperaturze 60 °C na noc, upewniając się, że utwardzanie odbywa się na płaskiej powierzchni.</li>
	<li>Przed usunięciem umieścić utwardzony PDMS/wafel krzemowy w kąpieli z 70% etanolu.</li>
	<li>Rozpocząć usuwanie PDMS z wafla, używając żyletki do podważenia krawędzi (wzdłuż całego obwodu).</li>
	<li>Ostrożnie odciągnąć PDMS za pomocą pincety w kąpieli z 70% etanolu, uważając, aby nie rozerwać odlewu z gumy silikonowej.</li>
	<li>Wykrawać poszczególne formy PDMS za pomocą dziurkacza o średnicy 14 mm. Średnica ta została dobrana tak, aby pasowała do układu płytek 24-dołkowych.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworu jedwabiu
<ol>
	<li>Zagotować 2 L wody destylowanej (dH2O) w zlewce szklanej 7.</li>
	<li>Pokroić 5 g kokonów jedwabnika Bombyx mori na trzy części.</li>
	<li>Usunąć kokony silnie zanieczyszczone, co objawia się nadmierną ilością cząsteczek owadów pokrywających wewnętrzną powierzchnię kokonu.</li>
	<li>Odważyć 4,24 g węglanu sodu.</li>
	<li>Powoli dodawać węglan sodu do wrzącej wody dH2O, aby zapobiec wykipieniu, i odczekać do całkowitego rozpuszczenia przed kontynuacją.</li>
	<li>Dodać kawałki kokonów do wrzącej wody dH2O na 40 min., mieszając kokony podczas gotowania za pomocą mieszadła magnetycznego z powłoką teflonową.</li>
	<li>Po gotowaniu ostrożnie zlać dH2O do zlewu i ręcznie wycisnąć ekstrakt jedwabny, aby usunąć nadmiar wody.</li>
	<li>Przemyć ekstrakt jedwabny trzy razy po 20 min. każdy w 1 L dH2O w zlewce laboratoryjnej, używając mieszadła do cyrkulacji cieczy w zlewce.</li>
	<li>Po przemyciu ręcznie wycisnąć ekstrakt jedwabny i umieścić go w dygestorium w celu suszenia przez 12 h.</li>
	<li>Następnego dnia zważyć wysuszone włókna jedwabiu, których masa zazwyczaj wynosi ~3,5 g: ___________-g</li>
	<li>Przygotować roztwór LiBr 9,3 M dla 20% (m/v) roztworu jedwabiu. Wykorzystać następujące równania do obliczenia niezbędnej masy i objętości:
	<ol class="lalpha">
		<li>(Masa ekstraktu jedwabnego z kroku 10) x (4) = ___________-mL całkowitej objętości roztworu LiBr 9,3 M</li>
		<li>[(807,705) x (objętość LiBr z części 11.a)]/1000 = ___________ g LiBr do dodania do dH2O</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać odważoną masę LiBr do zlewki szklanej zawierającej następującą objętość dH2O:
	<ol class="lalpha">
		<li>(0,8) x (obliczona objętość z kroku 11.a) = ___________ mL dH2O</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przelać ten roztwór do odpowiedniej wielkości cylindra miarowego i uzupełnić roztwór do objętości końcowej obliczonej w części 11.a.</li>
	<li>Umieścić ekstrakt jedwabny w zlewce i zalać go roztworem LiBr, upewniając się za pomocą szpatułki laboratoryjnej, że włókna jedwabiu są całkowicie zanurzone w roztworze LiBr.</li>
	<li>Umieścić rozpuszczony jedwab w suszarce w temperaturze 60 °C na 4 h: 
	Godzina rozpoczęcia: ___________ 
	Godzina zakończenia: ___________</li>
	<li>Za pomocą odpowiedniej wielkości strzykawki pobrać 12 mL roztworu jedwabiu. Na końcówce strzykawki umieścić igłę 18G, a następnie wstrzyknąć roztwór do kasety dializacyjnej (cutoff 3 500 MW, Slide-A-Lyzer, Thermo Scientific). Po napełnieniu kasety odessać z niej pozostałe powietrze za pomocą opróżnionej strzykawki.</li>
	<li>Umieścić napełnioną kasetę dializacyjną w 1 L dH2O.</li>
	<li>Wymieniać dH2O po 1 h, 4 h, 8 h, a następnie co 12 h (3x), łącznie 6 wymian:
	<ol class="lalpha">
		<li>Start: ___________</li>
		<li>1 h: ___________</li>
		<li>4 h: ___________</li>
		<li>8 h: ___________</li>
		<li>12 h: ___________</li>
		<li>12 h: ___________</li>
		<li>12 h: ___________</li>
		<li>Koniec: ___________</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po dializie powoli zebrać roztwór jedwabiu z kaset za pomocą strzykawki. Przenieść roztwór do probówek wirówkowych przeznaczonych do 10 000 g.</li>
	<li>Wirować roztwór dwukrotnie przy 10 000 g w temperaturze 4 °C przez 20 min za każdym razem. Po każdym wirowaniu przenieść nadsącz do nowej probówki.</li>
	<li>Przechowywać roztwór jedwabiu w lodówce w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Pipetować 2 próbki po 0,5 mL roztworu jedwabiu do małych naczynek wagowych i umieścić je w suszarce w temperaturze 60 °C na 12 godzin lub do całkowitego wyschnięcia roztworu jedwabiu.</li>
	<li>Zważyć pozostałą stałą błonę jedwabną z obu próbek, aby zmierzyć procentowe stężenie białka w roztworze jedwabiu (masy do objętości):
	<ol class="lalpha">
		<li>Masa połączonych 2 próbek błony jedwabnej:___________ mg</li>
		<li>(Masa z 23.a) x (100) = ___________% jedwabiu</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie błon jedwabnych i konfiguracja systemu hodowli
<ol>
	<li>Przygotować powierzchnie do odlewania PDMS, oczyszczając je za pomocą przezroczystej taśmy w celu usunięcia kurzu.</li>
	<li>Oczyścić podłoża PDMS poprzez namoczenie w 70% EtOH i przemyć trzykrotnie dH2O.</li>
	<li>Umieścić 14 mm formy PDMS na płytce uchwytu, którą zazwyczaj jest pokrywa płytki 24-dołkowej.</li>
	<li>Aby uzyskać film o grubości 50 μm, rozprowadzić 70 μls 8% roztworu jedwabiu na formach PDMS za pomocą narzędzia do rozprowadzania cieczy, którym zazwyczaj jest końcówka strzykawki 1 mL 2.</li>
	<li>Pozostawić filmy jedwabne do wyschnięcia bez przykrycia w komorze z laminarnym przepływem powietrza przy ciśnieniu 150 Pa przez 90 min lub do czasu wyschnięcia filmów.</li>
	<li>Po wyschnięciu filmów umieścić cały zestaw, w tym formy PDMS, w komorze do wyżarzania w wodzie na &gt;4 h, aby uzyskać film nierozpuszczalny w wodzie. Zazwyczaj jest to pusta komora eksykatora z wodą w dolnym zbiorniku, w której wytworzono próżnię 25 kPa 15.</li>
	<li>Wyjąć filmy jedwabne z komory do wyżarzania w wodzie i umieścić je w komorze z laminarnym przepływem powietrza.</li>
	<li>Przygotować kąpiel z 70% EtOH w szalce Petriego 35 mm i umieścić w niej podłoża kontrolne (np. powierzchnie szklane lub plastikowe) oraz pierścienie ze stali nierdzewnej na co najmniej 10 min w celu sterylizacji.</li>
	<li>Wyjąć filmy jedwabne z form PDMS za pomocą pęsety, zanurzyć je w 70% EtOH i umieścić próbkę w płytce 24-dołkowej wypełnionej uprzednio 1 mL 70% EtOH, upewniając się, że strona wzorowana jest skierowana do góry, aby umożliwić adhezję komórek.</li>
	<li>Po umieszczeniu każdej próbki filmu jedwabnego w odpowiednim dołku, nałożyć na górę obciążniki w postaci pierścieni ze stali nierdzewnej (średnica wewnętrzna 11,65 mm, średnica zewnętrzna 15,45 mm i grubość 1,18 mm).</li>
	<li>Inkubować próbki z pierścieniami przez 10 minut, aby zapewnić sterylność.</li>
	<li>Usunąć EtOH i przemyć każdą próbkę 3x 1 mL PBS. Pozostawić każdy płukanie na 5 min, aby umożliwić pełną dyfuzję.</li>
	<li>Usunąć PBS za pomocą szklanej pipety aspiracyjnej, dbając o usunięcie większości pęcherzyków powietrza spod próbek filmu jedwabnego.</li>
	<li>Przygotować linię komórkową do wysiewu. Przykładowo, poddać linię komórek nabłonka rogówkowo-limbalnego człowieka (HCLE) trypsynizacji za pomocą 0,25% roztworu trypsyny i kwasu etylenodiaminooctowego (EDTA) przez 7 min. Dezaktywować trypsynę, dodając objętość 1:1 pożywki DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium) z dodatkiem 10% FBS. Odwirować trypsynizowane komórki HCLE, dodać 8 mL pożywki bezsurowiczej dla keratynocytów (K-SFM) do osadu komórkowego, delikatnie wymieszać w celu zdyspergowania komórek HCLE i przeprowadzić zliczanie komórek.</li>
	<li>Nanieść 500 μL zawiesiny HCLE na dołek, zazwyczaj stosując gęstość 10,000 cells/cm2.</li>
	<li>Umieścić hodowle w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 i przeprowadzić wybrany protokół eksperymentalny.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
<img alt="Schemat procesu oczyszczania fibroiny jedwabnej; przedstawiający etapy: gotowanie kokonów, rozpuszczanie w LiBr, dializę." src="/files/ftp_upload/3646/3646fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat blokowy przedstawiający podsumowany 10-etapowy proces produkcji filmu jedwabnego i przygotowania systemu hodowlanego.
<img alt="Wzorowany wafelek z mikrostrukturami; obrazy SEM pokazują topografię powierzchni; cechy 4μm, 2μm." src="/files/ftp_upload/3646/3646fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. (A) Macierz 21 barwników z topografiami powierzchni w formie wzorowanych linii, wytworzona na wafelku krzemowym o średnicy 90 mm z wykorzystaniem standardowych technik fotolitografii i trawienia suchego. (B) Filmy jedwabne zachowują oryginalne cechy wzoru równoległych linii po odlewaniu na powierzchniach form z PDMS. (C) Schemat przedstawiający projekt rozmiaru cech wybrany w celu promowania wyrównania komórkowego. (D) Przekrój poprzeczny filmu jedwabnego ilustrujący zachowaną wzorowaną powierzchnię z równoległymi liniami.
<img alt="Obraz z zasięgu skaningowej mikroskopii elektronowej; morfologia powierzchni; analiza mikrostrukturalna; powiększenie 5-20μm." src="/files/ftp_upload/3646/3646fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Mikrografie z skaningowej mikroskopii elektronowej linii komórek HCLE przylegających do (A) wzorcowanych i (B) płaskich filmów jedwabnych w 2. dniu hodowli. Hodowle HCLE nadal proliferują do momentu osiągnięcia konfluencji na (C) wzorcowanych i (D) płaskich powierzchniach do 8. dnia hodowli.
<img alt="Obrazy mikroskopowe hodowli komórkowych i wykresy słupkowe; wpływ podłoża na absorbancję i fluorescencję w czasie." src="/files/ftp_upload/3646/3646fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. (A, D, G) Wzorcowane i (B, E, H) płaskie błony jedwabne z hodowlą komórek HCLE w porównaniu do (C, F, I) szklanych podłoży kontrolnych w (A-C) 1. dniu, (D-F) 4. dniu oraz (G-I) 8. dniu hodowli. (J) Zawartość kwasów nukleinowych wyznaczona testem CyQuant oraz (K) dane z testu aktywności metabolicznej MTT (3-(4,5-dimetylotiazol-2-yl)-2,5-difenylotetrazolium bromide), wykazujące żywotność HCLE na obu typach podłoży z błon jedwabnych (wzorcowanych i płaskich) w porównaniu do szklanych powierzchni kontrolnych w czasie (paski skali = 100 μm).
Wideo 1. Obrazowanie w fazowym kontraście w trybie time-lapse przedstawiające migrację komórek HCLE po powierzchni wzorowanej błony jedwabnej w okresie 18 hr. Komórki wysiano z gęstością 10k/cm2 i inkubowano przez 2 hr. przed obrazowaniem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3646/3646movie1.MOV" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć film</a>.
Wideo 2. Obrazowanie w fazowym kontraście w trybie time-lapse komórek HCLE migrujących po płaskiej kontrolnej powierzchni TCP w okresie 18 hr. Komórki wysiano z gęstością 10k/cm2 i inkubowano przez 2 hr. przed obrazowaniem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3646/3646movie2.MOV" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć film</a>.

<ol><li>Rockwood, D., Preda, R. C., Yucel, T., Wang, X., Lovett, M. L., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Materials+Fabrication+from+Bombyx+mori+Silk+Fibroin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Materials Fabrication from Bombyx mori Silk Fibroin.</a> Nature protocols. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Lawrence, B., Omenetto, F., Chui, K., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+methods+to+control+silk+fibroin+film+biomaterial+features%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+materials+science%22%5BJournal%5D)">Processing methods to control silk fibroin film biomaterial features.</a> Journal of materials science. 43, 6967-6985 (2008).</li>
<li>Altman, G., Diaz, F., Jakuba, C., Calabro, T., Horan, R., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silk-based+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Silk-based biomaterials.</a> Biomaterials. 24, 401-416 (2003).</li>
<li>Hofmann, S., Wong, P. o, Foo, C., Rossetti, F., Textor, M., Vunjak-Novakovic, G., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silk+fibroin+as+an+organic+polymer+for+controlled+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Silk fibroin as an organic polymer for controlled drug delivery.</a> Journal of Controlled Release. 111, 219-227 (2006).</li>
<li>Demura, M., Asakura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+glucose+oxidase+with+Bombyx+mori+silk+fibroin+by+only+stretching+treatment+and+its+application+to+glucose+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Immobilization of glucose oxidase with Bombyx mori silk fibroin by only stretching treatment and its application to glucose sensor.</a> Biotechnology and bioengineering. 33, 598-603 (1989).</li>
<li>Cebe, P., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+enzymatic+degradation+of+beta-sheet+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Mechanism of enzymatic degradation of beta-sheet crystals.</a> Biomaterials. , (2010).</li>
<li>Lawrence, B., Cronin-Golomb, M., Georgakoudi, I., Kaplan, D., Omenetto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+silk+protein+biomaterial+systems+for+optical+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Bioactive silk protein biomaterial systems for optical devices.</a> Biomacromolecules. 9, 1214-1220 (2008).</li>
<li>Meinel, L., Hofmann, S., Karageorgiou, V., Kirker-Head, C., McCool, J., Gronowicz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+responses+to+silk+films+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The inflammatory responses to silk films in vitro and in vivo.</a> Biomaterials. 26, 147-155 (2005).</li>
<li>Vepari, C., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silk+as+a+biomaterial%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Silk as a biomaterial.</a> Progress in Polymer Science. 32, 8-9 (2007).</li>
<li>Li, M., Ogiso, M., Minoura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+degradation+behavior+of+porous+silk+fibroin+sheets%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Enzymatic degradation behavior of porous silk fibroin sheets.</a> Biomaterials. 24, 357-365 (2003).</li>
<li>Arai, T., Freddi, G., Innocenti, R., Tsukada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradation+of+Bombyx+mori+silk+fibroin+fibers+and+films%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Biodegradation of Bombyx mori silk fibroin fibers and films.</a> Journal of Applied Polymer Science. 91, 2383-2390 (2004).</li>
<li>Lawrence, B., Marchant, J., Pindrus, M., Omenetto, F., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silk+film+biomaterials+for+cornea+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Silk film biomaterials for cornea tissue engineering.</a> Biomaterials. 30, 1299-1308 (2009).</li>
<li>Ma, X., Cao, C., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biocompatibility+of+silk+fibroin+films+containing+sulfonated+silk+fibroin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+B%3A+Applied+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The biocompatibility of silk fibroin films containing sulfonated silk fibroin.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 78, 89-96 (2006).</li>
<li>Patel, A., Thakar, R., Chown, M., Ayala, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+mechanisms+of+single-cell+interactions+with+microtopographical+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical%22%5BJournal%5D)">Biophysical mechanisms of single-cell interactions with microtopographical cues.</a> Biomedical. , (2010).</li>
<li>Jin, H., Park, J., Karageorgiou, V., Kim, U., Valluzzi, R., Cebe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water-Stable+Silk+Films+with+Reduced+%CE%B2-Sheet+Content%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Water-Stable Silk Films with Reduced β-Sheet Content.</a> Advanced Functional Materials. 15, 1241-1247 (2005).</li>
<li>Lawrence, B., Wharram, S., Kluge, J., Leisk, G., Omenetto, F., Rosenblatt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Hydration+on+Silk+Film+Material+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Effect of Hydration on Silk Film Material Properties.</a> Macromolecular Bioscience. 10, 393-403 (2010).</li>
<li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+silk+fibroin+as+a+support+for+enzyme+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Natural silk fibroin as a support for enzyme immobilization.</a> Biotechnology Advances. 16, 961-971 (1998).</li>
<li>Cebe, P., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+enzymatic+degradation+of+beta-sheet+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Mechanism of enzymatic degradation of beta-sheet crystals.</a> Biomaterials. , (2010).</li>
<li>Shaw, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+the+fibroin+of+Bombyx+mori+with+trypsin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Fractionation of the fibroin of Bombyx mori with trypsin.</a> Biochemical Journal. 93, 45(1964).</li>
<li>Rice, W., Firdous, S., Gupta, S., Hunter, M., Foo, C., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+characterization+of+structure+and+morphology+of+silk+fibroin+biomaterials+using+non-linear+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Non-invasive characterization of structure and morphology of silk fibroin biomaterials using non-linear microscopy.</a> Biomaterials. 29, 2015-2024 (2008).</li>
<li>Chirila, T., Barnard, Z., Harkin, D., Schwab, I., Hirst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bombyx+mori+silk+fibroin+membranes+as+potential+substrata+for+epithelial+constructs+used+in+the+management+of+ocular+surface+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Bombyx mori silk fibroin membranes as potential substrata for epithelial constructs used in the management of ocular surface disorders.</a> Tissue Engineering Part A. 14, 1203-1211 (2008).</li>
<li>Hu, X., Shmelev, K., Sun, L., Gil, E. -S., Park, S. -H., Cebe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Silk+Material+Structure+by+Temperature-Controlled+Water+Vapor+Annealing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Regulation of Silk Material Structure by Temperature-Controlled Water Vapor Annealing.</a> Biomacromolecules. 12, 1686-1696 (2011).</li>
<li>Omenetto, F., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+route+for+silk%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">A new route for silk.</a> Nature Photonics. 2, 641-643 (2008).</li>
<li>Bray, L. J., George, K. A., Ainscough, S. L., Hutmacher, D. W., Chirila, T. V., Harkin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+corneal+epithelial+equivalents+constructed+on+Bombyx+mori+silk+fibroin+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Human corneal epithelial equivalents constructed on Bombyx mori silk fibroin membranes.</a> Biomaterials. 32, 5086-5091 (2011).</li>
<li>Wang, N., Tytell, J. D., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+at+a+distance%3A+mechanically+coupling+the+extracellular+matrix+with+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction at a distance: mechanically coupling the extracellular matrix with the nucleus.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 75-82 (2009).</li>
<li>Jaalouk, D. E., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+gone+awry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction gone awry.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 63-73 (2009).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Stosowanie regenerowanych błon jedwabnych jako podłoża do hodowli komórkowych zyskało popularność w ciągu ostatnich dwóch dekad dzięki szczegółowej charakterystyce właściwości materiałowych tego białka oraz zwiększonemu zrozumieniu jego użyteczności jako biomateriału 3,8. Opisany tutaj system hodowli stanowi nowatorski system testowy in vitro do oceny oddziaływań komórek z powierzchnią na wzorowanych podłożach z biomateriału w postaci błon jedwabnych 7. System ten umożliwia pogłębioną analizę oddziaływań komórkowych w czasie, którą można łatwo zaadaptować do wysokoprzepustowego gromadzenia danych. Jest to w dużej mierze możliwe dzięki temu, że błony jedwabne posiadają szereg regulowanych właściwości biomateriałowych, które można modyfikować, aby bezpośrednio wpływać na funkcje komórek 8,9,12, w tym: kontrolę mikro- i nanotopografii powierzchni 7; różnorodną chemię powierzchni poprzez modyfikację kowalencyjną lub adsorpcję biologicznie czynnych cząsteczek 13; wytrzymałe właściwości mechaniczne 15,16; kontrolę hydrofilowości/hydrofobowości materiału 16; ładowanie związków biologicznych w całej objętości materiału w celu ich uwalniania 4,8,17 oraz kontrolowane tempo rozpuszczania/degradacji enzymatycznej poprzez kontrolę struktury drugorzędowej (zawartości struktur beta-kartka) 11,18,19.
Przezroczystość filmów jedwabnych uzyskuje się poprzez wyżarzanie filmów przez określony czas w próżni w obecności pary wodnej 7,15. To podejście procesowe umożliwia formowanie wtórnej struktury harmonijki β, co sprzyja nierozpuszczalności materiału w wodzie, jednocześnie minimalizując dyfrakcję światła 15. Przezroczystość tych filmów jest kluczowa dla umożliwienia bezpośredniego obrazowania żywych komórek, które może być stosowane w wielu trybach obrazowania (np. szerokopolowym i fluorescencyjnym) z wykorzystaniem dowolnych systemów mikroskopowych 12,20. Oprócz obrazowania żywych komórek, filmy jedwabne można łatwo usunąć z układu hodowlanego, co pozwala na dodatkową fiksację i analizę. Tym samym szeroka gama bezpośrednich ocen eksperymentalnych, które można przeprowadzić w tym systemie, ma zastosowanie do wielu rodzajów źródeł komórek/tkanek w wielu dziedzinach technicznych 3,8,9,12,13,21. Wyniki obrazowania time-lapse ilustrują sposób gromadzenia danych z hodowli w czasie rzeczywistym i zostały wykorzystane jako przykład do pokazania, jak topografia powierzchni wpływa na interakcje komórkowe. Reprezentatywne wyniki demonstrują, w jaki sposób biomateriały z filmów jedwabnych mogą być wykorzystywane do wspierania wzrostu hodowli HCLE i że są one podatne na szereg standardowych testów proliferacji komórkowej i metabolicznych (Rys. 4). Dodatkowo, hodowle są fiksowane i przetwarzane do obrazowania za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej lub innych protokołów (Rys. 3).
Podłoża z błon jedwabnych są wytwarzane w laboratorium z wysoką precyzją i powtarzalnością, przy stosunkowo niskim koszcie (Rys. 1). Umożliwia to odtwarzalność zarówno w konfiguracji systemu hodowli, jak i w wynikach eksperymentalnych. Wykazano, że proces wyżarzania w wodzie pozwala na otrzymanie stabilnego materiału z błony jedwabnej do hodowli, który charakteryzuje się określonymi tempami degradacji zależnymi od stężenia proteaz w roztworze 2,15,22. W konsekwencji materiały te mogą być stosowane przez dłuższy czas w długoterminowych hodowlach komórkowych lub pozostawać zaimplantowane przez miesiące lub lata, w zależności od lokalizacji fizjologicznej 8. Ponadto niedawne prace wykazały, że zarówno struktura białkowa, jak i właściwości materiałowe wyżarzanych w wodzie błon jedwabnych są spójne między partiami, co pozwala na uzyskanie powtarzalnych wyników hodowli, co potwierdzono za pomocą różnych metod badań mechanicznych i biofizycznych 15,16. Dodatkowo powierzchnia materiału wykazała dużą jednorodność między partiami błon, co potwierdzono w badaniach SEM, mikroskopii sił atomowych (AFM) oraz badaniach hodowli komórkowych {Lawrence:2008wr, Omenetto:2008tc, Bray:2011kq}7,23,24. Stabilność i spójność materiału są istotnymi czynnikami wpływającymi na to, w jaki sposób komórka będzie wykrywać podłoże hodowlane poprzez różne szlaki mechanotransdukcji, co w ostateczności prowadzi do pożądanej lub niepożądanej odpowiedzi komórkowej 25,26.
Historyczne standardy podłoży hodowlanych, takie jak szkło lub plastik traktowany do hodowli tkankowej, zapewniają odpowiednie podłoża do adhezji komórek. Materiały te nie nadają się jednak do dalszego zastosowania in vivo. Można założyć, że biomateriał w postaci filmu jedwabnego może zostać dostosowany in vitro, a po osiągnięciu oczekiwanych rezultatów eksperymentalnych, tak zmodyfikowany film może zostać bezpośrednio przeniesiony do modelu in vivo. Takie powiązanie projektowania eksperymentów in vitro i in vivo stanowi ogromną zaletę implantowalnych biomateriałów jedwabnych w porównaniu z innymi podłożami rutynowo stosowanymi in vitro.

system hodowli na filmach jedwabnych do analiz in vitro i projektowania biomateriałów

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Filmy jedwabne są obiecującymi biomateriałami na bazie białek, które mogą być wytwarzane z wysoką precyzją i w sposób ekonomiczny w warunkach laboratorium badawczego 1,2 . Materiały te są pożądane, ponieważ posiadają wysoce kontrolowalne charakterystyki wymiarowe i materiałowe, są biokompatybilne i wspomagają adhezję komórek, mogą być modyfikowane poprzez nadawanie topografii powierzchni lub jej chemiczną modyfikację, a także mogą służyć jako repozytorium biologicznie czynnych cząsteczek w zastosowaniach związanych z dostarczaniem leków 3-8 . Ponadto filmy jedwabne są stosunkowo proste w projektowaniu specjalistycznym, mogą być opracowane tak, aby rozpuścić się w ciągu kilku minut lub degradować w ciągu wielu lat in vitro lub in vivo, a ich dodatkową zaletą jest naturalna przezroczystość, co czyni je bardzo odpowiednimi do zastosowań w obrazowaniu 9-13. Przedstawiona tutaj metodologia systemu hodowli stanowi skalowalne podejście do szybkiej oceny oddziaływań między komórkami a powierzchnią filmu jedwabnego. Szczególnie interesujące jest wykorzystanie jedwabnych filmów z wzorowaną powierzchnią do badania różnic w proliferacji komórek oraz ich odpowiedzi w zakresie orientacji przestrzennej 12,14 . Wysiane kultury hodowano zarówno na mikrowzorowanych, jak i płaskich podłożach z filmu jedwabnego, a następnie oceniano za pomocą obrazowania w fazowym kontraście w trybie time-lapse, skaningowej mikroskopii elektronowej oraz biochemicznej oceny aktywności metabolicznej i zawartości kwasów nukleinowych. Podsumowując, system hodowli in vitro na filmach jedwabnych oferuje konfigurowalny układ eksperymentalny odpowiedni do badania oddziaływań komórka-powierzchnia na podłożu biomateriałowym, który może zostać zoptymalizowany, a następnie przeniesiony do modeli in vivo. Obserwacje z wykorzystaniem prezentowanego tutaj systemu hodowli są obecnie stosowane w aplikacjach obejmujących zakres od podstawowych oddziaływań komórkowych po projektowanie urządzeń medycznych, przez co mają znaczenie dla szerokiego spektrum dziedzin biomedycznych.

Filmy jedwabne stanowią nową klasę biomateriałów, które można łatwo dostosować do szerokiego zakresu zastosowań biomedycznych. Przedstawiony system hodowli na filmach jedwabnych jest wysoce adaptowalny do różnorodnych analiz in vitro. System ten stanowi platformę projektowania biomateriałów, umożliwiającą optymalizację in vitro przed bezpośrednim przejściem do modeli in vivo.

System hodowli na filmach jedwabnych do analiz in vitro i projektowania biomateriałów

Filmy jedwabne są obiecującymi biomateriałami na bazie białek, które można wytwarzać z wysoką precyzją i w sposób ekonomiczny w warunkach laboratorium badawczego ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie systemu hodowli in vitro na błonie jedwabnej. Jest to realizowane poprzez wstępne przygotowanie roztworu jedwabiu niezbędnego do wytworzenia pożądanej błony. Drugim krokiem jest wylanie roztworu jedwabiu na formierską powierzchnię z gumy silikonowej i pozostawienie błony do wyschnięcia.Następnie błona jedwabna jest poddawana obróbce w celu przygotowania do hodowli komórkowej. W kolejnym kroku, z zachowaniem zasad aseptyki, montowany jest system hodowli. Ostatnim etapem jest wysianie na błony jedwabne pożądanego typu komórek.Ostatecznie powierzchnie hodowli na filmach jedwabnych mogą być obrazowane bezpośrednio lub poddawane analizom wewnątrz hodowli. Płytki lub próbki można usunąć w celu utrwalenia i dalszego przetwarzania, zgodnie z potrzebami. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak hodowla na standardowym plastiku do hodowli tkanek, jest fakt, że biomateriały z filmów jedwabnych charakteryzują się wysoką biozgodnością i mogą być łatwo przenoszone przez badaczy do dalszych zastosowań in vivo oraz in vitro.Tę metodę można wykorzystać do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii komórki i biomateriałów, takie jak: w jaki sposób topografia powierzchni może wpływać na odpowiedź komórkową? Choć metoda ta pozwala na analizę odpowiedzi nabłonka rogówki, może być ona zastosowana również do innych układów, w których wstępne eksperymenty in vitro mogą dostarczyć preliminarnych odpowiedzi dla bardziej złożonych układów in vivo. Aby rozpocząć wykonanie form z gumy silikonowej, należy przygotować pożądaną powierzchnię topograficzną do odlewu w ramach niniejszej demonstracji.W procesie wykorzystuje się standardowy wytrawiony wafle krzemowy o średnicy 100 milimetrów. Roztwór PDMS oraz katalizator przygotowuje się w stosunku dziewięć do jednego, zgodnie z instrukcją dołączoną do zakupionego zestawu. Roztwory należy dokładnie wymieszać, aby rozpocząć proces sieciowania.Po umieszczeniu powierzchni wafla krzemowego w formie odlewniczej, odważ i nanieś 4,5 g roztworu PDMS na wafel krzemowy. Gdy roztwór PDMS równomiernie rozprowadzi się po waflu, przykryj go pokrywką od szalki Petriego o średnicy 100 mm i poddaj działaniu próżni o ciśnieniu 10 mmHg przez dwie godziny. Aby usunąć pęcherzyki powietrza z roztworu PDMS, umieść zestaw odlewniczy na płaskiej powierzchni w piekarniku w temperaturze 60 °C na całą noc; następnego dnia umieść utwardzony wafel krzemowy z PDMS w kąpieli z 100% ethanol.Przed całkowitym usunięciem PDMS, rozpocznij odrywanie PDMS z wafla, używając żyletki do podważenia krawędzi obwodowej za pomocą pęsety. Ostrożnie ododerwij PDMS, zanurzając go w kąpieli z 100% etanolu. Uważając, aby nie rozerwać odlewu z gumy silikonowej, wycinaj pojedyncze formy z PDMS za pomocą dziurkacza o średnicy 14 mm. Średnica ta została dobrana tak, aby pasowała do dołków płytki 24-dołkowej.Aby przygotować roztwór jedwabiu, doprowadzić dwa litry wody destylowanej do wrzenia. W szklanym naczyniu pociąć pięć gramów kokonów jedwabnika bombex Maori na trzy części; kokony silnie zanieczyszczone, o czym świadczy nadmiar cząstek owadziego pochodzenia pokrywających wewnętrzną powierzchnię kokonu, należy odrzucić. Do wrzącej wody powoli dodać 4,24 grama węglanu sodu, aby zapobiec wykipieniu.Po rozpuszczeniu węglanu sodu należy dodać fragmenty kokonów do wrzącej wody i mieszać za pomocą mieszadełka teflonowego przez 40 minut. Po gotowaniu ostrożnie zlać wodę destylowaną do zlewu i ręcznie wycisnąć ekstrakt jedwabny, aby usunąć nadmiar wody. Następnie przemyć ekstrakt jedwabny, umieszczając go w plastikowym zlewce z jednym litrem wody destylowanej i mieszając przez 20 minut.Powtórz ten proces płukania świeżą wodą dwukrotnie. Odciśnij ręcznie wypłukany ekstrakt jedwabny i umieść go w dygestorium, aby wysychał przez 12 godzin. Następnego dnia zważ wysuszone włókna jedwabiu, których masa zazwyczaj wynosi około 3,5 gramów.Następnie, zgodnie z protokołem pisemnym, przygotować 9,3 M roztwór bromku litu dla 20% (w/v) roztworu jedwabiu. Po umieszczeniu ekstraktu z jedwabiu w zlewce, nalać na włókna jedwabiu roztwór bromku litu.Należy upewnić się, że włókna jedwabiu są całkowicie zanurzone w roztworze. Następnie, za pomocą szpatułki laboratoryjnej, należy przenieść rozpuszczony jedwab do pieca ustawionego na 60 °C na cztery godziny. Po upływie czterech godzin należy użyć strzykawki o odpowiedniej pojemności, aby pobrać 12 ml roztworu jedwabiu.Po wprowadzeniu igły o rozmiarze 18 G, wstrzyknij roztwór za pomocą strzykawki do kasety dializacyjnej. Po napełnieniu kasety, odessań pozostałe powietrze z niej za pomocą opróżnionej strzykawki.Umieść wypełnioną kasetę dializacyjną w jednym litrze wody destylowanej. Wymieniaj wodę po jednej godzinie, czterech godzinach, ośmiu godzinach, a następnie trzy razy co 12 godzin, łącznie sześć razy. Po dializie.Powoli zbierz roztwór jedwabiu z kaset za pomocą strzykawki i przenieś go do probówek do wirowania. Wirować roztwór przy 10, 000 g i temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Po wirowaniu przenieś supernatant do nowej probówki.Po powtórzeniu tego procesu drugi raz, pipetuj dwie próbki 0,5 ml roztworu jedwabiu do oddzielnych małych naczyń na serwatkę. Umieść naczynia w suszarce w temperaturze 60 °C na 12 godzin lub do czasu odparowania roztworu jedwabiu. Zbiorczy roztwór jedwabiu można przechowywać w temperaturze 4 °C.Zważ pozostałą stałą błonę jedwabną z obu próbek, aby zmierzyć gęstość stężenia białka jedwabnego w roztworze. Przygotuj powierzchnie do odlewania PDMS, używając przezroczystej taśmy do usunięcia kurzu. Następnie oczyść podłoża PDMS, mocząc je w 100% etanolu przez jedną minutę.Następnie należy je usunąć i pozostawić do wyschnięcia. Aby wytworzyć warstwę o grubości 50 µm, należy nanieść 70 µL 8% roztworu jedwabiu na formy PDMS. Używając narzędzia do rozprowadzania cieczy, takiego jak końcówka strzykawki o pojemności 1 ml, należy pozostawić filmy jedwabne do wyschnięcia bez przykrycia w komorze z laminarnym przepływem powietrza, przy ciśnieniu przepływu powietrza 150 Pa przez okres 90 minut lub do momentu wyschnięcia filmów.Po wyschnięciu filmów, umieść cały zestaw filmów wraz z formami z PDMS w komorze do wodnego wyżarzania na ponad cztery godziny, aby uzyskać film nierozpuszczalny w wodzie. Zazwyczaj jest to pusta, osuszona komora z wodą na dnie zbiornika, w której po wyjęciu filmów jedwabnych z komory do wodnego wyżarzania wytwarza się podciśnienie rzędu 25 kilopascals. Pracując w sterylnych warunkach w komorze z laminarnym przepływem powietrza, przygotuj kąpiel z 70% etanolu w 35 milimetrowej szalce Petriego.Następnie umieść wszystkie podłoża kontrolne oraz pierścienie ze stali nierdzewnej w naczyniu na co najmniej 10 minut w celu ich sterylizacji. Następnie za pomocą pęsety wyjmij błony jedwabne z form PDMS. Zanurz je w 70% etanolu, a następnie umieść każdą błonę w oddzielnej studzience płytki 24-dołkowej, uprzednio wypełnionej jednym mililitrem 70% etanolu.Należy upewnić się, że strona z wzorem jest skierowana do góry, aby umożliwić adhezję komórek. Aby zapewnić powodzenie tego etapu, ważne jest, aby filmy jedwabne zostały umieszczone w dołkach w sposób prawidłowy i sterylny. Umieść pierścienie ze stali nierdzewnej na filmach SILT i inkubuj przez 10 minut. Po przemyciu próbki filmu zgodnie z instrukcjami w tekście, przygotuj linię komórkową do osadzenia według tamtejszych wytycznych. W tej demonstracji wykorzystano ludzką linię komórkową nabłonka limbalnego rogówki. W ostatnim kroku nanieś 500 µL zawiesiny HCLE na dołek, zazwyczaj przy gęstości 10 000 komórek na cm², a następnie przeprowadź wybrany protokół eksperymentalny. Przedstawione tutaj mikrografie elektronowe skaningowe linii komórkowej HCLE ukazują komórki przylegające do wzorowanych i płaskich filmów jedwabnych w drugim dniu.W hodowli HCLE komórki nadal proliferują do osiągnięcia konfluencji na powierzchniach wzorowanych i płaskich do ósmego dnia. W tutejszej hodowli komórki HCLE na wzorowanych i płaskich filmach jedwabnych są porównywane z kontrolnymi podłożami szklanymi w pierwszym, czwartym i ósmym dniu. Ilościowe oznaczenia hodowli z wykorzystaniem zawartości kwasów nukleinowych SQU oraz testu aktywności metabolicznej MTT wykazują żywotność komórek HCLE na obu rodzajach podłoży z filmów jedwabnych (wzorowanych i płaskich) w porównaniu z kontrolnymi powierzchniami szklanymi w czasie.Przedstawiono tutaj obrazowanie w fazowym kontraście w trybie poklatkowym komórek HCLE migrujących po powierzchni wzorowanej filmu jedwabnego. W ciągu 18-godzinnego okresu komórki osadzono z gęstością 10 000 komórek na centymetr kwadratowy i hodowano przez dwie godziny przed obrazowaniem; dla porównania przedstawiono obrazowanie w fazowym kontraście w trybie poklatkowym komórek HCLE migrujących po płaskiej powierzchni kontrolnej w ciągu 18-godzinnego okresu w tych samych warunkach hodowli. Po przygotowaniu roztworu jedwabiu i formy silikonowej, technikę tę można przeprowadzić w ciągu ośmiu godzin, jeśli jest ona wykonywana prawidłowo zgodnie z opisaną procedurą.W celu lepszego zrozumienia odpowiedzi komórek na te różnorodne usługi projektowania spersonalizowanego można zastosować inne metody, takie jak skanowanie immunofluorescencyjne, mikroskopię elektronową i techniki biologii molekularnej, np. western blot i immunoanalizy, a także testy chemiczne, takie jak ocena żywotności komórek, proliferacji komórek i tempa metabolizmu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przygotować roztwór jedwabiu, stworzyć spersonalizowany wzór, filmy jedwabne oraz jak hodować dowolny typ komórek na tych podłożach.

silk-film-culture-system-for-in-vitro-analysis-and-biomaterial-design

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

System kultury filmu jedwabnego do analizy in vitro i projektowania biomateriałów

Zgłaszamy urządzenie i nową metodę badania komórek i embrionów. Pojedyncze komórki są precyzyjnie uporządkowane w układach mikrownękowych. Ich uwięzienie w 3D jest krokiem w kierunku środowisk 3D spotykanych w warunkach fizjologicznych i umożliwia orientację organelli. Kontrolując kształt komórki, ta konfiguracja minimalizuje zmienność zgłaszaną w standardowych testach.

Porządkowanie pojedynczych komórek i pojedynczych zarodków w zamknięciu 3D: nowe urządzenie do badań przesiewowych o wysokiej zawartości

Wgląd w złożone działania mózgu wymaga zaawansowanych narzędzi badawczych. Tutaj demonstrujemy nowatorski, oparty na jedwabnym kolagenie, zaprojektowany w 3D model tkanki nerwowej przypominający architekturę przypominającą mózg. Model może być wykorzystany do badania budowy sieci neuronalnej, prowadzenia aksonów, interakcji komórka-komórka i aktywności elektrycznej.

Zaprojektowany model 3D spolaryzowanej tkanki nerwowej oparty na jedwabiu

Pokazujemy metodę generowania 3D surogatek raka piersi, które mogą być hodowane za pomocą systemu bioreaktora perfuzyjnego do dostarczania tlenu i składników odżywczych. Po wzroście surogaty są utrwalane i przetwarzane na parafinę w celu oceny parametrów będących przedmiotem zainteresowania. Wyjaśniono ocenę jednego z takich parametrów, gęstości komórek.

Przygotowanie i analiza trójwymiarowych substytutów raka piersi in vitro

Ten artykuł opisuje szczegółową metodologię przygotowania matrycy Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) do wysokoprzepustowej manipulacji fizycznych i chemicznych sygnałów naśladujących mikrośrodowiska komórkowe in vivo oraz do identyfikacji optymalnego środowiska komórkowego dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) z profilowaniem pojedynczych komórek.

Wytwarzanie multipleksowanej sztucznej macierzy mikrośrodowiska komórkowego

Przedstawiono protokół procesu produkcji polimerowych cienkowarstwowych struktur kompozytowych o różnych modułach lub grubościach Younga. Folie są produkowane do zaawansowanych badań nad kulturami komórkowymi lub jako kleje do skóry.

Cienkowarstwowe kompozytowe elastomery krzemowe do hodowli komórkowych i zastosowań skórnych: produkcja i charakterystyka

Ten artykuł przedstawia protokół produkcji nowego typu substratu hodowlanego z setkami mikropojemników namm2, w których organoidy mogą być hodowane i obserwowane za pomocą mikroskopii o wysokiej rozdzielczości. Szczegółowo opisano również protokoły wysiewu komórek i barwienia immunologicznego.

Wysokoprzepustowa platforma do hodowli i obrazowania 3D organoidów

Tutaj szczegółowo opisujemy prosty, szybki i niezawodny protokół wspomagany wieloparametryczną cytometrią przepływową i nowotworem na chipie, aby monitorować i charakteryzować etapy składające się na cykl rak-odporność. Rzeczywiście, dogłębne zrozumienie wzajemnych zależności między rakiem a komórkami odpornościowymi dostarcza kluczowych informacji, które pozwalają przechytrzyć nowotwory i kierować opieką kliniczną.

Systemy kohodowli in vitro w celu odtworzenia cyklu rak-odporność

Ten protokół opisuje metodologie tworzenia prostego i efektywnego modelu implantacji zarodków in vitro do oceny istotnych cząsteczek wpływających na proces implantacji zarodka.

Opracowanie modelu implantacji zarodka in vitro

Wkładki do hodowli tkankowych z plastikowymi membranami są złotym standardem w laboratoriach hodowli komórkowych jako przepuszczalne nośniki do tworzenia warstw komórkowych i modeli tkanek barierowych. W niniejszym artykule przedstawiamy prostą metodę zastąpienia plastikowej membrany bardziej biologicznie istotną membraną wykonaną z rekombinowanego funkcjonalizowanego białka pajęczej nici.

Nanowłóknista błona podstawna naśladująca wykonana z rekombinowanej, funkcjonalizowanej nici pajęczej w niestandardowych wkładkach do hodowli tkankowych

Opisano nową metodę enkapsulacji pęcherzyków jajnikowych w trójwymiarowej sieci interpenetrującej z fibryny i alginianu. System ten łączy wsparcie strukturalne z degradacją proteolityczną, aby wspierać rozwój niedojrzałych pęcherzyków w celu wytworzenia dojrzałych oocytów. Metoda ta może być stosowana do hodowli agregatów komórkowych w celu utrzymania kontaktów międzykomórkowych bez ograniczania ekspansji.

Metoda enkapsulacji i hodowli pęcherzyków jajnikowych w proteolitycznie degradowalnym systemie trójwymiarowym

Poznaj system hodowli folii jedwabnej do analizy in vitro i projektowania biomateriałów. Ta metoda umożliwia optymalizację kultur komórkowych przed zastosowaniami in vivo w badaniach biomedycznych.

System hodowli na filmach jedwabnych do analiz in vitro i projektowania biomateriałów

Przeglądaj więcej filmów