Name: Zastosowanie testu immunopunktowego sprzężonego z interferonem-γ do scharakteryzowania nowych epitopów komórek T wirusa brodawczaka ludzkiego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 41 s
Description: Poznaj metodę izolacji i charakteryzacji klonów komórek T specyficznych dla antygenów HPV z próbek pacjentów. Technika wykorzystuje test immunopunktowy sprzężony z interferonem-γ do identyfikacji epitopów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsze badanie było wspierane przez American Cancer Society Scholars Award (RSG-06-180-01-MBC) oraz granty NIH (R01 CA143130 i UL1RR029884).

<ol><li>Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+favorable+clinical+trend+is+associated+with+CD8+T-cell+immune+responses+to+the+human+papillomavirus+type+16+e6+antigens+in+women+being+studied+for+abnormal+pap+smear+results%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Low.+Genit.+Tract+Dis%22%5BJournal%5D)">A favorable clinical trend is associated with CD8 T-cell immune responses to the human papillomavirus type 16 e6 antigens in women being studied for abnormal pap smear results.</a> J. Low. Genit. Tract Dis. 14, 124-129 (2010).</li>
<li>Walls, E., Crawford, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalls%2C+E+%22Lymphocytes%3A+A+practical+approach%22">Lymphocytes: A practical approach</a>. Klaus, G. G. B. , IRL Press. 149-149 (1987).</li>
<li>Nakagawa, M., Kim, K. H., Moscicki, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+CD8+T-cell+epitopes+within+the+human+papillomavirus+type+16+%28HPV+16%29+E6+protein+among+young+women+whose+HPV+16+infection+has+become+undetectable%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Diagn.+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Patterns of CD8 T-cell epitopes within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 protein among young women whose HPV 16 infection has become undetectable.</a> Clin. Diagn. Lab Immunol. 12, 1003-1005 (2005).</li>
<li>Wang, X., Santin, A. D., Bellone, S., Gupta, S., Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+CD4+T-cell+epitope+described+from+one+of+the+cervical+cancer+patients+vaccinated+with+HPV+16+or+18+E7-pulsed+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol.+Immunother%22%5BJournal%5D)">A novel CD4 T-cell epitope described from one of the cervical cancer patients vaccinated with HPV 16 or 18 E7-pulsed dendritic cells.</a> Cancer Immunol. Immunother. 58, 301-308 (2009).</li>
<li>Larsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recombinant+vaccinia+virus+based+ELISPOT+assay+detects+high+frequencies+of+Pol-specific+CD8+T+cells+in+HIV-1-positive+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">A recombinant vaccinia virus based ELISPOT assay detects high frequencies of Pol-specific CD8 T cells in HIV-1-positive individuals.</a> AIDS. 13, 767-777 (1999).</li>
<li>Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T+lymphocyte+responses+to+E6+and+E7+proteins+of+human+papillomavirus+type+16%3A+relationship+to+cervical+intraepithelial+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T lymphocyte responses to E6 and E7 proteins of human papillomavirus type 16: relationship to cervical intraepithelial neoplasia.</a> J. Infect. Dis. 175, 927-931 (1997).</li>
<li>Wang, X., Moscicki, A. B., Tsang, L., Brockman, A., Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+T+cells+specific+for+novel+human+papillomavirus+type+16+%28HPV16%29+E6+epitopes+in+women+whose+HPV16+infection+has+become+undetectable%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Memory T cells specific for novel human papillomavirus type 16 (HPV16) E6 epitopes in women whose HPV16 infection has become undetectable.</a> Clin. Vaccine Immunol. 15, 937-945 (2008).</li>
<li>Evans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+processing+defects+in+cervical+carcinomas+limit+the+presentation+of+a+CTL+epitope+from+human+papillomavirus+16+E6%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen processing defects in cervical carcinomas limit the presentation of a CTL epitope from human papillomavirus 16 E6.</a> J. Immunol. 167, 5420-5428 (2001).</li>
<li>Shi, Y., Smith, K. D., Kurilla, M. G., Lutz, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+CD8%2B+T+cells+recognize+EBV+antigen+but+poorly+kill+autologous+EBV-infected+B+lymphoblasts%3A+immunodominance+is+elicited+by+a+peptide+epitope+that+is+presented+at+low+levels+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic CD8+ T cells recognize EBV antigen but poorly kill autologous EBV-infected B lymphoblasts: immunodominance is elicited by a peptide epitope that is presented at low levels in vitro.</a> J. Immunol. 159, 1844-1852 (1997).</li>
<li>Varadarajan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+single-cell+analysis+of+human+CD8%2B+T+cell+functions+reveals+discordance+for+cytokine+secretion+and+cytolysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis.</a> The Journal of Clinical Investigation. , (2011).</li>
<li>Nakagawa, M., Kim, K. H., Moscicki, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+methods+of+identifying+new+antigenic+epitopes+of+human+papillomavirus+type+16+E6+and+E7+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Diagn.+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Different methods of identifying new antigenic epitopes of human papillomavirus type 16 E6 and E7 proteins.</a> Clin. Diagn. Lab Immunol. 11, 889-896 (2004).</li>
<li>Nakagawa, M., Kim, K. H., Gillam, T. M., Moscicki, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA+class+I+binding+promiscuity+of+the+CD8+T-cell+epitopes+of+human+papillomavirus+type+16+E6+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">HLA class I binding promiscuity of the CD8 T-cell epitopes of human papillomavirus type 16 E6 protein.</a> J. Virol. 81, 1412-1423 (2007).</li>
<li>Brown, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+epitope+%22hotspots%22+on+the+HIV+Type+1+gp120+envelope+protein+overlap+with+tryptic+fragments+displayed+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res.+Hum.+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">T cell epitope "hotspots" on the HIV Type 1 gp120 envelope protein overlap with tryptic fragments displayed by mass spectrometry.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 21, 165-170 (2005).</li>
<li>Masemola, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+and+promiscuous+CTL+epitopes+in+conserved+regions+of+Gag+targeted+by+individuals+with+early+subtype+C+HIV+type+1+infection+from+southern+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Novel and promiscuous CTL epitopes in conserved regions of Gag targeted by individuals with early subtype C HIV type 1 infection from southern Africa.</a> J. Immunol. 173, 4607-4617 (2004).</li>
<li>Walker, B. D., Korber, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+control+of+HIV%3A+the+obstacles+of+HLA+and+viral+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune control of HIV: the obstacles of HLA and viral diversity.</a> Nat. Immunol. 2, 473-475 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tradycyjnie immunolodzy starali się charakteryzować nowe epitopy limfocytów T poprzez stymulację zainteresowanych limfocytów T in vitro oraz przeprowadzenie eksperymentu rozcieńczeń ograniczających w celu izolacji klonów limfocytów T specyficznych dla danego epitopu. Następnie klony limfocytów T charakteryzowano za pomocą testu uwalniania chromu 8,9. Jednak wiele prób zakończyło się niepowodzeniem, ponieważ częstość występowania limfocytów T mogła być zbyt niska, aby można było je wyizolować, lub poni...

<table><tbody><tr><td>Zestaw do izolacji limfocytów T CD8</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-156</td><td></td></tr><tr><td>Fitohemaglutynina</td><td>Remel, Thermo Fisher Scientific</td><td>R-30852801</td><td>2mg/vial</td></tr><tr><td>Pożywka Yssel&amp;rsquo;s</td><td>Gemini Bio Products</td><td>400-102</td><td>1% pooled human serum</td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa z okrągłym dnem</td><td>BD Biosciences</td><td>08-772-17</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka IL-2</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>202-IL-050</td><td>50&amp;#x03BC;g</td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa</td><td>Corning</td><td>07-200-84</td><td></td></tr><tr><td>Fosforanowy bufor solny (PBS)</td><td>Cellgro</td><td>MT-21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pierwotne przeciwciało monoklonalne anty-IFN-&amp;#947; (D1K)</td><td>Mabtech</td><td>3420-3-1000</td><td></td></tr><tr><td>Biotynilowane przeciwciało monoklonalne anty-IFN-&amp;#947; (7B-6)</td><td>Mabtech</td><td>3420-6-1000</td><td></td></tr><tr><td>Płytka Multiscreen HA ELISPOT</td><td>EMD Millipore</td><td>MAHA S45 10</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>100 ml bottle</td></tr><tr><td>Surowica ludzka pulowana</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S40510H</td><td>Inaktywowana termicznie</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Cellgro</td><td>MT-10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Vectastain Elite ABC</td><td>Vector Laboratories</td><td>NC9313719</td><td></td></tr><tr><td>Stabilna diaminobenzydyna</td><td>Open Biosystems</td><td>MBI 1241</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik AID EliSpot Reader Classic</td><td>Autoimmun Diagnostika GmbH</td><td>ELR06</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie testu enzyme-linked immunospot (elispot) dla interferonu $\gamma$ do charakterystyki nowych epitopów limfocytów t wirusa papilomawirusa ludzkiego

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Opracowano protokół pozwalający przezwyciężyć trudności w izolowaniu i charakteryzowaniu rzadkich limfocytów T specyficznych dla patogenów wywołujących zakażenia miejscowe, takich jak wirus brodawczaka ludzkiego (HPV). Etapy procedury obejmują identyfikację regionu lub regionów białek HPV zawierających epitopy dla limfocytów T u badanego, selekcję limfocytów T specyficznych dla peptydów na podstawie sekrecji interferonu-γ (IFN-γ) oraz hodowlę i charakteryzację klonów limfocytów T (Rys. 1). Osoba 1 była pacjentką, u której niedawno w biopsji zdiagnozowano wysokostopniową dysplazję wewnątrznabłonkowa łуskawkową i która w dniu pobrania limfocytów T poddała się zabiegowi pętlowej ekscyzji elektrycznej w ramach leczenia1. Region w białkach E6 i E7 wirusa brodawczaka ludzkiego typu 16 (HPV 16) zawierający epitop dla limfocytów T zidentyfikowano za pomocą testu immunospot (ELISPOT) dla IFN-γ, przeprowadzonego z użyciem nakładających się peptydów syntetycznych (Rys. 2). Dane z tego testu posłużyły nie tylko do identyfikacji regionu zawierającego epitop dla limfocytów T, ale także do oszacowania liczby specyficznych dla epitopu limfocytów T i ich izolacji na podstawie sekrecji IFN-γ przy użyciu dostępnych komercyjnie kulek magnetycznych (zestaw do izolacji limfocytów T CD8, Miltenyi Biotec, Auburn CA). Wyselekcjonowane limfocyty T wydzielające IFN-γ rozcieńczono i hodowano pojedynczo w obecności mieszaniny napromieniowanych komórek zasilających (feeder cells), aby wspomóc wzrost pojedynczego limfocytu T na dołek. Klony limfocytów T przesiewano za pomocą testu IFN-γ ELISPOT w obecności peptydów pokrywających zidentyfikowany region oraz autologicznych limfoblastoidalnych komórek B (LCL) transformowanych wirusem Epsteina-Barr (LCL, uzyskanych zgodnie z opisem Walls i Crawforda)2, aby zminimalizować liczbę potrzebnych komórek klonalnych limfocytów T. Zamiast stosować 1 x 105 komórek na dołek, co jest typowe dla testów ELISPOT1,3, zastosowano 1 000 komórek klonalnych limfocytów T w obecności 1 x 105 autologicznych LCL, co drastycznie zmniejszyło liczbę wymaganych komórek klonalnych. Autologiczne LCL służyły nie tylko do prezentacji antygenów peptydowych komórkom klonalnym limfocytów T, ale także do utrzymania wysokiej gęstości komórek w dołkach, co umożliwiło specyficznym dla epitopu klonalnym limfocytom T sekrecję IFN-γ. Zapewnia to pomyślne przeprowadzenie testu IFN-γ ELISPOT. Podobnie testy IFN-γ ELISPOT wykorzystano do scharakteryzowania minimalnej i optymalnej sekwencji aminokwasowej epitopu limfocytów T CD8 (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) oraz jego elementu restrykcyjnego HLA klasy I (B58). Test IFN-γ ELISPOT przeprowadzono również z użyciem autologicznych LCL zainfekowanych wirusem ospy krowiej (vaccinia virus) ekspresującym białko E6 lub E7 HPV 16. Wynik wykazał, że epitop limfocytów T E6 był przetwarzany endogennie. Wykazano również krzyżowe rozpoznawanie homologicznego epitopu limfocytów T innych typów HPV wysokiego ryzyka. Metoda ta może być również stosowana do opisu epitopów limfocytów T CD44.

Charakterystyka epitopów limfocytów T patogenów wywołujących infekcje miejscowe, takich jak wirus brodawczaka ludzkiego, stanowi wyzwanie ze względu na ograniczoną liczbę krążących limfocytów T. Opisano metodę, w której rzadkie limfocyty T zostały wyizolowane i scharakteryzowane, zaczynając od bardzo małej liczby komórek.

Wykorzystanie testu Enzyme-linked Immunospot (ELISpot) dla interferonu $\gamma$ do charakterystyki nowych epitopów limfocytów T wirusa papilomawirusa ludzkiego

Opracowano protokół pozwalający przezwyciężyć trudności związane z izolacją i charakterystyką rzadkich limfocytów T specyficznych dla patogenów, takich jak ludzkie...

Ogólnym celem tej procedury jest izolacja, hodowla i analiza klonów limfocytów T specyficznych dla antygenu HPV pochodzących od pacjentów. W pierwszej kolejności należy utworzyć linię limfocytów T CD8, przeprowadzić test SBOT oraz oszacować częstotliwość występowania limfocytów T specyficznych dla antygenu. Po wyizolowaniu klonów limfocytów T specyficznych dla antygenu na podstawie sekrecji interferonu gamma, należy przeprowadzić wysokoprzepustowy screening z wykorzystaniem testu SBOT dla interferonu gamma w celu zidentyfikowania klonów limfocytów T specyficznych dla epitopu.Należy kontynuować charakterystykę klonów limfocytów T dla minimalnego optymalnego peptydu. Sekwencje epitopów determinują również to, czy epitop jest przetwarzany endogennie. Należy zidentyfikować element restrykcji HLA oraz ocenić reakcje krzyżowe wobec innych typów HPV wysokiego ryzyka.Ostatecznym celem jest opisanie nowych i istotnych klinicznie epitopów T-komórkowych HPV poprzez screening i charakterystykę swoistych dla antygenu limfocytów T pobranych od pacjentów. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak wykorzystanie testu ELISPOT do identyfikacji swoistych dla antygenu limfocytów T, jest znacznie większe prawdopodobieństwo sukcesu. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu immunologii, takie jak to, które fragmenty HPV są rozpoznawane przez limfocyty T. Zastosowania tej techniki rozciągają się na terapię lub diagnostykę raka szyjki macicy, ponieważ na podstawie wiedzy o swoistości limfocytów T można opracowywać szczepionki i immunoterapie.Metoda ta może dostarczyć informacji na temat epitopów limfocytów T CD8 i może być również stosowana w innych układach, takich jak epitopy limfocytów T CD4; analiza ELISPOT dla interferonu gamma z wykorzystaniem linii limfocytów T CD8 wywodzącej się od badanego nr 1 wykazała, że region 46–70 białka E6 HPV16 zawiera epitop limfocytów T. Te swoiste dla epitopu limfocyty T wyselekcjonowano na podstawie sekrecji interferonu gamma. Przygotować mieszaninę komórek wspomagających (feeder cells) składającą się z napromieniowanych allogenicznych mononuklearnych komórek krwi obwodowej, limfoblastów B oraz fytohemaglutyniny w pełnej pożywce dla komórek E.Następnie, stosując seryjne rozcieńczenia wyizolowanych limfocytów T specyficznych dla epitopu w mieszaninie komórek karmicielskich, przygotuj stężenie pięciu komórek na mililitr, używając pipety wielokanałowej. Rozlej 100 µL rozcieńczonych limfocytów T specyficznych dla epitopu do każdego dołka 96-dołkowej płytki z okrągłym dnem. Inkubuj przez pięć dni w temperaturze 37 °C i 5% CO2, a w 11. do 14. dnia stymuluj komórki rekombinowaną ludzką interleukiną 2.Wizualnie zidentyfikuj rosnące klony limfocytów T jako duże osady na dnie dołków płytki. Czasami pożywka zmienia kolor na żółty. Przygotuj nową mieszaninę komórek karmicieli i uzupełnij pożywkę ecel, dodając jedną porcję 1 mL na każdy dołek płytki 24-dołkowej.Powodzenie eksperymentu zależy od możliwości izolacji i hodowli klonów limfocytów T za pomocą mikropipety 200 µL. Przenieś poszczególne klony limfocytów T do oddzielnych studzienek zawierających pleatowane komórki karmionki. Powtarzaj czynność, aż wszystkie klony limfocytów T zostaną przeniesione.Do studzienek sterylnych płytek sbot nanieść po 50 µL przeciwciała monoklonalnego przeciwko interferonowi gamma w stężeniu 5 µg/mL. Inkubować przez jedną godzinę w temperaturze 4 °C. Przemyć trzy razy 200 µL PBS.Następnie zablokuj nieswoiste wiązania, dodając 50 µL 5% połączonego surowicy ludzkiej w pożywce RPMI 1640. Zawsze usuwaj duże pęcherzyki powietrza, przebijając je sterylną igłą. Inkubuj przez godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO2.Następnie dodaj 1 × 10⁵ autologicznych LCL w 50 µL RPMI 1640 z 5% ludzką surowicą. Wymieszaj komórki każdego klonu limfocytów T za pomocą pipety 1 ml i przenieś 100 µL do sterylnej probówki typu Eppendorf. Rozcieńcz w 500 µL RPMI 1640 zawierającego 5% puli ludzkiej surowicy.Następnie odwiruj komórki w celu uzyskania osadu, odlej nadsącz i resuspenduj komórki w 110 µL pożywki RPMI 1640 zawierającej 5% ludzkiej surowicy. Teraz nanieś 50 µL każdej klonalnej zawiesiny komórek do identycznie rozmieszczonych studni w dwóch płytkach Ellis spot w celu szybkiego przesiewania dla studni z dodatnią kontrolą PHA. Połącz pozostałe medium z kilku probówek typu einor i nanieś po 50 µL do kolejnych, identycznie rozmieszczonych studni.Przygotuj również studzienki kontroli negatywnej z 50 µL medium. Następnie, w przypadku płytki testowej, dodaj 50 µL peptydów znajdujących się w obszarze pozytywnym do studzienek kontroli pozytywnej. Do płytki zawierającej tylko medium dodaj 10 µL roztworu stokowego PHA oraz 40 µL RPMI 1640.Dodaj 50 µL pożywki RPMI 1640 z 5% połączonym surowicą ludzką i inkubuj płytki Ellis spot przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Nie przesuwaj płytek przez cały okres inkubacji. Odlej pożywkę, a następnie wypłucz dołki trzy razy, używając 200 µL PBS zawierającego 0,05% tween 20.Następnie należy dodać 50 µL biotynilowanego przeciwciała monoklonalnego przeciwko interferonowi gamma i inkubować przez dwie godziny. Próbki należy przemyć trzykrotnie 200 µL PBS zawierającego 0,1% tween 20. Następnie należy dodać 50 µL świeżo przygotowanej awidyny związanej z biotynilowaną peroksydazą chrzanową i inkubować płytki w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez jedną godzinę. Po trzykrotnym przemyciu PBS zawierającym 0,1% tween 20, należy dodać 50 µL stabilizatora.Pozostaw płytkę na pięć minut w temperaturze pokojowej w celu wywołania barwy. Następnie przemyj trzy razy 200 µL wody dejonizowanej. Pozostaw płytkę do całkowitego wyschnięcia.Policz plamki za pomocą automatycznego czytnika plamek ELISPOT. Wybierz klony limfocytów T do potwierdzenia specyficzności epitopu. Następnie przeprowadź test ELISPOT z użyciem 10³ klonalnych limfocytów T w celu oceny reaktywności względem każdego z trzech peptydów zawartych w regionie epitopu.Przygotować autologiczne linie LCL zainfekowane rekombinowanym wirusem vaccinia typu dzikiego, a także autologiczne linie LCL zainfekowane rekombinowanym wirusem vaccinia wykazującym ekspresję białka HPV 16 E6 lub E7. Ponownie zastosować test ELISpot na wybranych klonach komórek T, aby porównać reaktywność wobec autologicznych linii LCL zainfekowanych rekombinowanym wirusem vaccinia typu dzikiego oraz reaktywność wobec autologicznych linii LCL zainfekowanych rekombinowanym wirusem vaccinia wykazującym ekspresję białka HPV 16 E6 lub E7 w wybranych klonach limfocytów T. W pierwszej kolejności przeprowadzić test ELISpot, wykorzystując serię nakładających się dziewięciomerowych peptydów obejmujących region epitopu.Następnie należy przeprowadzić test plamkowy LY w celu oceny reaktywności wobec serii peptydów o różnej długości. Kontynuuj test plamkowy, stosując zakres stężeń dla kilku peptydów. Najprawdopodobniej pozwolą one wyznaczyć minimalną i optymalną sekwencję aminokwasową.Przygotować allogeniczne LCL wyizolowane od badanego pacjenta, dzielące jedną lub dwie cząsteczki HLA klasy I. Wybrać dobrze namnażające się klony limfocytów T. Przeprowadzić test ELISpot, używając 10⁵ allogenicznych LCL, 10³ komórek klonu limfocytów T oraz minimalnego i optymalnego peptydu w stężeniu 10 µM.Po scharakteryzowaniu klonów limfocytów T specyficznych dla epitopu można zbadać ich reaktywność krzyżową wobec innych typów HPV wysokiego ryzyka. Wystarczy przeprowadzić przesiew wybranych klonalnych limfocytów T za pomocą testu ELISpot w celu sprawdzenia reaktywności z peptydami zawierającymi homologiczne sekwencje aminokwasowe z innych typów HPV wysokiego ryzyka. Pierwszy pacjent to 22-letnia kobieta rasy afroamerykańskiej z niedawną historią zmian nabłonkowych wewnątrznabłonkowych o wysokim stopniu złośliwości zdiagnozowanych w biopsji.W dniu zabiegu elektrycznej ekscyzji LU pobrano od pacjentki limfocyty T. Wyniki testu Elispot dla jej linii limfocytów T CD8 wskazują, że region E6 46-70 wirusa HPV 16 zawiera epitop limfocytów T, na co wskazuje poziom sekrecji interferonu gamma wynoszący 1,2 × 10⁵. Limfocyty T specyficzne dla epitopu wyselekcjonowano metodą rozcieńczeń ograniczających z jednej piątej wybranych komórek.Ziobrano 262 klony limfocytów T. Pozostałe wyselekcjonowane komórki nie zostały wykorzystane, ponieważ pierwsza próba klonowania limfocytów T zakończyła się sukcesem. Przesiewowy test Ellis spot przeprowadzony na 94 z tych klonów pozwolił zidentyfikować 62 klony dodatnie w badaniu przesiewowym.Pozostałe klony limfocytów T nie zostały przebadane, ponieważ pierwsza analiza metodą Ellis Spott zidentyfikowała peptydowo-specyficzne klony limfocytów T. Specyficzność epitopowa ośmiu dobrze rosnących, pozytywnych w przesiewie klonów została potwierdzona z użyciem trzech peptydów 15 MER pokrywających ten region indywidualnie.Wszystkie klony limfocytów T wykazały reakcję pozytywną z peptydami HPV 16 E6 51-65. Sześć z ośmiu klonów było pozytywnych w przypadku peptydu E6 46-60, natomiast żaden z klonów nie był pozytywny dla peptydu E6 56-70. Przedstawiono tutaj testy ELISpot z autologicznymi liniami LCL zainfekowanymi rekombinowanym wirusem ospy krowiej wykazującym ekspresję białka HPV 16 E6 lub białka E7.Wyniki te wykazują, że klony limfocytów T rozpoznają endogennie przetworzony epitop E6; zastosowanie serii nakładających się nonamerów peptydowych obejmujących region HPV 16 46–65 ułatwiło określenie minimalnej i optymalnej sekwencji epitopu limfocytów T. Najsilniejszą odpowiedź uzyskano w przypadku peptydu E6 53–61; analiza nakładających się epitopów peptydowych najczęściej wskazała decamer E6 52–61 jako sekwencję minimalną i optymalną. Co ciekawe, peptyd E6 53–61 wywołał równie silną odpowiedź klonu limfocytów T.Krzywe zależności dawka-odpowiedź nr 79 wskazują, że peptyd E 6 52–61 zachował pozytywny wynik znacznie skuteczniej niż peptyd E 6 53–61 przy niższych stężeniach peptydu. W tym przykładzie analizowano osobę A, u której wykryto minimalną i optymalną sekwencję E 6 75–83, pod kątem restrykcji cząsteczki HLA klasy pierwszej dla epitopu limfocytów T CD8. Wysoka pozytywność jest widoczna w przypadku LCL wykazującego ekspresję cząsteczek B 62 i CW trzy. Podczas gdy pozytywność tła jest widoczna w LCL wykazującym ekspresję CW trzy, niektóre regiony genomu HPV są dobrze zachowane.Na przykład sekwencje homologiczne do regionów E 6 52–61 HPV 16 zidentyfikowane u pierwszego badanego wystąpiły u 13 innych typów HPV wysokiego ryzyka. Zgodnie z tym wykazano silne rozpoznawanie krzyżowe dla ośmiu z 13 typów HPV wysokiego ryzyka. Po opanowaniu ta technika może zostać przeprowadzona w ciągu siedmiu tygodni od dnia pobrania krwi, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Należy pamiętać o stosowaniu techniki sterylnej przez cały czas trwania procedury.Należy pamiętać, że praca z jakimkolwiek wirusem może być niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie odzieży ochronnej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak charakteryzować nowe limfocyty T.

use-interferon-enzyme-linked-immunospot-assay-to-characterize-novel-t

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Zastosowanie testu immunosplotu związanego z enzymem interferonu-γ do scharakteryzowania nowych epitopów limfocytów T wirusa brodawczaka ludzkiego

Identyfikacja mikrobiologicznych celów odporności adaptacyjnej w chorobach idiopatycznych może zostać przeprowadzona przy użyciu testu ELISpot (enzyme-linked immunospot assay).

Test immunospot z enzymatycznym sprzężeniem (ELISPOT): Ilościowe oznaczenie komórkowych odpowiedzi immunologicznych Th-1 przeciwko antygenom mikrobiologicznym

Ten film demonstruje test immunofluorescencyjny przeznaczony do pomiaru neutralizacji ludzkiego wirusa cytomegalii (HCMV). Przeciwciała specyficzne dla wirusa miesza się z wirusem i inkubuje z ludzkimi komórkami fibroblastów. Przeciwciała neutralizują wirusa, uniemożliwiając mu infekowanie komórek gospodarza, podczas gdy niezneutralizowane wirusy infekują komórki. Po inkubacji stopień neutralizacji określa się poprzez ilościowe oznaczanie komórek zakażonych wirusem za pomocą immunofluorescencji.

Metoda immunofluorescencyjna do pomiaru neutralizacji ludzkiego wirusa cytomegalii

Ten artykuł skupia się na identyfikacji wysoce pewnych zestawów danych interakcji między białkami gospodarza i patogenu przy użyciu kombinacji dwóch ortogonalnych metod: drożdży dwuhybrydowych, a następnie wysokoprzepustowego testu interakcji w komórkach ssaków o nazwie HT-GPCA.

Podejście porównawcze do scharakteryzowania krajobrazu interakcji białko-białko gospodarz-patogen

Nowatorskie generacje testów funkcjonalnych, takich jak interferon gamma (IFN-γ) ELISpot, które wykrywają produkcję cytokin na poziomie pojedynczej komórki i zapewniają zarówno ilościową, jak i jakościową charakterystykę odpowiedzi limfocytów T, mogą być używane do oceny komórkowych odpowiedzi immunologicznych skierowanych przeciwko wirusowi ospy wietrznej i półpaśca (VZV).

Opracowanie testu ELISpot IFN-γ do oceny odporności komórkowej specyficznej dla wirusa ospy wietrznej i półpaśca po przeszczepieniu krwi pępowinowej

Długoterminowy test immunologiczny związany z interferonem γ enzymem jest używany jako miara odpowiedzi pamięci centralnej i koreluje z ochronnymi odpowiedziami na szczepionkę przeciw prątkom. Dzięki temu testowi komórki jednojądrzaste krwi obwodowej są stymulowane antygenami prątkami i interleukiną-2 przez 14 dni, umożliwiając różnicowanie i ekspansję limfocytów T pamięci centralnej.

Zastosowanie długotrwale hodowanego testu immunologicznego związanego z enzymem interferonu γ do oceny odpowiedzi efektorowych i pamięciowych limfocytów T u bydła

Opisujemy tutaj metodę izolacji w celu uzyskania ludzkich śródnabłonkowych limfocytów wewnątrzszyjkowych do analizy śródnabłonkowych limfocytów T gamma delta. Protokół ten można rozszerzyć o oczyszczanie komórek T gamma delta szyjki macicy za pomocą kulek magnetycznych lub sortowania komórek.

Izolacja i analiza cytometryczna przepływowa ludzkich komórek T gamma Delta w obrębie szyjki macicy

Tutaj prezentujemy protokół opisujący rozwój i walidację cyfrowego testu ELISA z pojedynczą matrycą molekuł, który umożliwia ultraczułe wykrywanie wszystkich podtypów IFN-α w próbkach ludzkich.

Opracowanie i walidacja ultraczułego, cyfrowego testu immunoenzymatycznego z pojedynczą matrycą cząsteczek dla ludzkiego interferonu-α

Rozwój testu interferon-gamma ELISpot dla PBMC świnek morskich pozwala na scharakteryzowanie odpowiedzi limfocytów T w tym bardzo istotnym modelu do badania chorób zakaźnych. Zastosowaliśmy test do pomiaru odpowiedzi limfocytów T związanych z śródskórnym dostarczaniem szczepionek DNA.

Zoptymalizowany test ELISpot interferonu gamma do pomiaru odpowiedzi limfocytów T w modelu świnki morskiej po szczepieniu

Na podstawie matrycy peptydowej pochodzącej z wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV), odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficzne dla HBV mogą być oceniane równolegle z identyfikacją epitopów limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV.

Analiza odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV i identyfikacja epitopów komórek T CD4 ograniczonych do HLA-DR na podstawie matrycy peptydowej

Ten manuskrypt opisuje, jak ocenić in vivo immunogenność pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z komórek nowotworowych (EVs) za pomocą cytometrii przepływowej. EV pochodzące z nowotworów poddawanych immunogennej śmierci komórek indukowanej leczeniem wydają się szczególnie istotne w nadzorze immunologicznym nad nowotworami. Protokół ten stanowi przykład oceny EV guza immunostymulującego indukowanego oksaliplatyną, ale można go dostosować do różnych ustawień.

In vivo (in vivo) Badania przesiewowe immunogenności pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z guza za pomocą cytometrii przepływowej limfocytów T śledziony

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania epitopów neutralizacji na cząsteczkach wirusopodobnych wyświetlających antygen (VLP). Immunoprecypitację VLP pochodzących z ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) przeprowadza się przy użyciu przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla glikoprotein otoczkowych sprzężonych z kulkami magnetycznymi sprzężonymi z białkiem G. Przechwycone VLP są następnie poddawane analizie SDS-PAGE i Western blot przy użyciu przeciwciał specyficznych dla białka rdzenia...

Wykrywanie epitopów wrażliwych na neutralizację w antygenach wyświetlanych na szczepionkach opartych na cząsteczkach wirusopodobnych (VLP) za pomocą testu wychwytywania

Poznaj metodę izolacji i charakteryzacji klonów komórek T specyficznych dla antygenów HPV z próbek pacjentów. Technika wykorzystuje test immunopunktowy sprzężony z interferonem-γ do identyfikacji epitopów.

Zastosowanie testu immunopunktowego sprzężonego z interferonem-γ do scharakteryzowania nowych epitopów komórek T wirusa brodawczaka ludzkiego (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie testu Enzyme-linked Immunospot (ELISpot) dla interferonu $\gamma$ do charakterystyki nowych epitopów limfocytów T wirusa papilomawirusa ludzkiego

Przeglądaj więcej filmów