Name: Znakowanie DiI neuronów DRG w celu zbadania rozgałęzień aksonalnych w całym przygotowaniu zarodka myszy do rdzenia kręgowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Poznaj metodę znakowania DiI neuronów DRG w całym przygotowaniu zarodka myszy do rdzenia kręgowego. Technika ta umożliwia wizualizację wzorców rozgałęzień aksonalnych w badaniach nad rozwojem układu nerwowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować dr. Alistairowi Garrattowi (Max Delbrück Center, Berlin) za pomocne uwagi. Praca ta była wspierana przez centrum badań kooperacyjnych (SFB665) Niemieckiej Fundacji Badawczej (DFG).

1. Procedura sekcji
Uwaga: Wykorzystanie myszy w eksperymentach powinno być zgodne z oficjalnie zatwierdzonymi wytycznymi dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych.
<ol>
	<li>Przed przystąpieniem do preparacji przygotować mikroskop stereoskopowy oraz rozłożyć narzędzia chirurgiczne niezbędne do sekcji, w tym duże i małe nożyczki, duże pęsety ząbkowane, pęsetę zakrzywioną oraz cztery zestawy pęset sekcyjnych Dumont No.5 (z czego dwie z polerowanymi wewnętrznie końcówkami) (szczegóły znajdują się w tabeli odczynników i sprzętu). Umieścić arkusz papieru filtracyjnego w 100-mm szalce Petri powlekanej Sylgardem. Nalać zimny PBS do dołków płytki 12-dołkowej, 100-mm szalki Petri oraz probówki 12-ml i pozostawić na lodzie. Pipetować 2ml buforu fiksacyjnego (4% paraformaldehyd w PBS, pH 7.4) do każdego dołka drugiej płytki 12-dołkowej i umieścić na lodzie.</li>
	<li>Po znieczuleniu uśmiercić ciężarną samicę w dniu E12.5 (wykrycie czopa pochwowego uznano za E0.5), położyć mysz stroną brzuszną do góry na trzech arkuszach ręcznika papierowego i nasączyć okolicę brzucha 70% etanolem.</li>
	<li>Otworzyć jamę brzuszną i miedniczną, wyizolować obustronne rogi macicy i przenieść je do jednej z 100-mm szalek z lodowatym PBS.</li>
	<li>Pod kontrolą mikroskopową wykonać nacięcie podłużne ściany macicy za pomocą małych, prostych nożyczek i odciąć każdy worek owodniowy od łożyska.</li>
	<li>Oddzielić worek owodniowy od każdego embrionu i odciąć pępowinę.</li>
	<li>Za pomocą małych nożyczek odciąć głowy embrionów i odłożyć je lub ich część w celu izolacji DNA genomowego, jeśli wymagane będzie genotypowanie. Następnie przenieść tułowia do odpowiednich dołków płytki 12-dołkowej z zimnym PBS.</li>
	<li>Zmoczyć papier filtracyjny w szalce z Sylgardem kilkoma kroplami PBS i ułożyć tułów embrionu stroną grzbietową do góry na papierze. Dla lepszej stabilności wyprostować ogon i kończyny z dala od ciała.</li>
	<li>Pracując pod mikroskopem stereoskopowym przy powiększeniu około 16x, ostrożnie chwycić skórę embrionu nad rdzeniem kręgowym dwiema parami pęset z cienkimi końcówkami i delikatnie ją rozerwać. Zaczynając od środka, kierować się najpierw w stronę ogona, a następnie powrócić do środka i kierować się w stronę przednią.</li>
	<li>Od czasu do czasu zwilżać embrion dwiema lub trzema kroplami PBS, aby zapobiec jego wysychaniu.</li>
	<li>Aby zapobiec oderwaniu zwojów rdzeniowych (DRG) od rdzenia kręgowego podczas jego usuwania z embrionu, oddzielić DRG i rdzeń kręgowy od otaczającej chrzęstnej kolumny kręgowej za pomocą poziomych ruchów ślizgowych ostrzem pęsety z polerowanymi wewnętrznie końcówkami. Zaczynając od środka prawej strony embrionu, kierować się w stronę ogona, a następnie ku końcowi przedniemu. Następnie powtórzyć procedurę po drugiej stronie. Należy uważać, aby nie wyrwać powiązanych DRG.</li>
	<li>Aby całkowicie oddzielić poluzowany rdzeń kręgowy od embrionu, chwycić jego część szyjną cienką pęsetą i wyciągnąć go w jednym kawałku w kierunku końca ogonowego.</li>
	<li>Zanurzyć wyizolowany rdzeń kręgowy z przytwierdzonymi DRG w dołku płytki 12-dołkowej wypełnionym buforem fiksacyjnym i przystąpić do preparacji rdzeni kręgowych z pozostałych embrionów.</li>
	<li>Fiksować rdzenie kręgowe przez co najmniej dwie godziny na lodzie.</li>
</ol>
2. Znakowanie neuronów zwojów korzeni grzbietowych (DRG) barwnikiem DiI
<ol>
	<li>Dla każdego rdzenia kręgowego przeznaczonego do znakowania należy przygotować dwie szklane igły za pomocą wyciągacza mikropipet. Stosujemy wyciągacz elektrod Sutter model P-97 (ustawienia programu: 1. HEAT=625, VEL= 35, TIME=175; 2. HEAT=600, VEL= 25, TIME=175; 3. HEAT=630, VEL= 30, TIME=150).</li>
	<li>Pod kontrolą mikroskopową należy zanurzyć końcówkę każdej szklanej igły od trzech do pięciu razy w 5% (w/v) roztworze DiI w etanolu. Odparowanie etanolu powoduje powstanie cienkiej warstwy kryształów DiI na igle.</li>
	<li>Pracując pod mikroskopem stereoskopowym przy powiększeniu około 40x, należy umieścić rdzeń kręgowy stroną brzuszną do góry na szkiełku. Za pomocą nożyczek sprężynowych należy otworzyć rdzeń od strony brzusznej na całej jego długości, przecinając płytkę dna, aby umożliwić późniejszy montaż preparatu w odwróconym trybie otwartej książki (patrz sekcja C).</li>
	<li>Należy ułożyć rdzeń kręgowy stroną grzbietową do góry na szkiełku. Następnie, korzystając z wizualizacji mikroskopowej, należy ręcznie zbliżyć pokrytą DiI końcówkę szklanej igły do rdzenia i ostrożnie przebić co drugi zwoj DRG po jednej stronie rdzenia kręgowego. W przebitym DRG nie powinny być widoczne prawie żadne ślady DiI, aby zapewnić znakowanie tylko niewielkiej liczby neuronów. Do drugiej strony rdzenia należy użyć drugiej igły. Celowanie w co drugi DRG pozwala uniknąć nakładania się znakowanych projekcji aksonalnych z sąsiednich DRG, co mogłoby utrudnić rozróżnienie poszczególnych aksonów.</li>
	<li>Rdzeń kręgowy należy przenieść z powrotem do buforu fiksacyjnego i inkubować w ciemności przez co najmniej sześć godzin w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4 °C, aby barwnik mógł zdyfundować wzdłuż aksonu w obrębie błony plazmatycznej. W przypadku chęci analizy wzrostu kolateralnego do rdzenia kręgowego należy przewidzieć dłuższy okres inkubacji (do dwóch dni w 4 °C).</li>
</ol>
3. Montowanie i analiza mikroskopowa
<ol>
	<li>Po dyfuzji barwnika umieść pojedynczy rdzeń kręgowy stroną grzbietową do dołu na szkiełku nakrywnym w kropli PBS. Należy zadbać o to, aby przymocowane zwoje rdzeniowe tylne (DRG) były prawidłowo zorientowane bocznie i nie nakładały się na siebie. Odessaj nadmiar płynu i rozpłaszcz rdzeń w trybie „otwartej księgi” (odwrócone rozłożenie), używając pęsety.</li>
	<li>Zamocuj preparat na szkiełku przedmiotowym, używając PBS.</li>
	<li>Aby zapobiec wzrostowi niepożądanego tła fluorescencyjnego, analiza mikroskopowa znakowanych projekcji aksonalnych powinna zostać przeprowadzona w dniu montażu. Do tego czasu przechowuj szkiełka w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
Rdzeń kręgowy myszy otrzymuje projekcje aferentne z 8 par szyjnych, 13 par piersiowych, 5 par lędźwiowych i 4 par krzyżowych zwojów rdzeniowych tylnych (DRG), co daje łącznie 60 zwojów rdzeniowych. Po pewnym treningu rdzeń kręgowy z większością wciąż przytwierdzonych zwojów DRG można wyizolować z embrionu w czasie krótszym niż pięć minut. Procedura ta jest odpowiednia do izolacji rdzeni kręgowych z przytwierdzonymi zwojami DRG z embrionów myszy od etapu E11.5 do E13.5. Jednak najlepsze wyniki uzyskuje się z etapu E12.5. Przykładowe efekty opisanej tutaj procedury znakowania przedstawiono na rysunku 3. Znakowanie zwojów DRG na całej długości rdzenia kręgowego może następnie posłużyć do ilościowej oceny zachowania rozgałęzień aksonalnych na różnych poziomach kręgów (Rys. 4).
<img alt="Schemat wzrostu neuronów; Procesy bifurkacji i rozgałęziania śródmiąższowego w rozwoju układu nerwowego." src="/files/ftp_upload/3667/3667fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat przedstawiający dwa główne tryby rozgałęziania aksonów. (A) Rozgałęzianie wynikające z aktywności stożka wzrostu, które może prowadzić do bifurkacji – jak wskazano tutaj – a także do powstania złożonych drzewek końcowych lub (B) tworzenie odgałęzień bocznych w trzonie aksonu (rozgałęzianie śródmiąższowe). Ten drugi tryb jest dominującym typem rozgałęziania dla projekcyjnych aksonów korowych i wzgórzowo-korowych6,7.
<img alt="Schemat rozgałęziania neuronów; bifurkacja aksonu, akson pnia, neuron z zwoju korzeniowego tylnego (DRG), drogi skórne." src="/files/ftp_upload/3667/3667fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Projekcje aferentne neuronów DRG do embrionalnego rdzenia kręgowego wykazują oba typy rozgałęziania aksonalnego: aksony rozgałęziają się najpierw w strefie DREZ poprzez bifurkację (1), a z powstałych gałęzi potomnych tworzą się kolaterale po okresie oczekiwania poprzez rozgałęzianie śródmiąższowe (2).
<img alt="Przekroje rdzenia kręgowego, schemat zwojów korzeni grzbietowych (DRG); morfologia neuronalna; analiza histologiczna." src="/files/ftp_upload/3667/3667fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Wizualizacja pojedynczych trajektorii aksonalnych neuronów DRG zarodka myszy. (A) Rdzeń kręgowy z przynależnymi DRG przygotowany z zarodka myszy w stadium E12.5. (Pasek skali, 1 mm.) (B-D) Przedstawiono widoki grzbietowe znakowanych DiI DRG myszy typu dzikiego przy coraz większym powiększeniu. W B każdy drugi DRG jest znakowany DiI. Obrazy fluorescencyjne są odwrócone, kierunek kaudalny znajduje się po lewej stronie, a w C i D kierunek boczny znajduje się na dole. W C znakowana jest niewielka liczba aksonów, a przy większym powiększeniu w strefie wejścia korzeni grzbietowych (DREZ) rdzenia kręgowego można zidentyfikować obecność rozgałęzień w kształcie litery T. (Paski skali, 250 μm (B), 100 μm (C) i 50 μm (D).)
<img alt="Wykres słupkowy przedstawiający dane dotyczące regionu rdzeniowego dla zakrętów typu C, zakrętów typu R i odgałęzień typu T; analiza myszy WT i mutantów." src="/files/ftp_upload/3667/3667fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Ilościowe określenie odgałęzień w kształcie litery T, pojedynczych zakrętów rostralnych lub kaudalnych u myszy typu dzikiego oraz myszy z niedoborem peptydu natriuretycznego typu C (CNP) w stadium E13.5. Liczba przeliczonych pojedynczych aksonów dla różnych poziomów tułowia dla każdego genotypu podano w nawiasach. Zakręty typu C lub R – wzrost odpowiednio wyłącznie w kierunku kaudalnym lub rostralnym.
<img alt="Schemat szlaku sygnalizacyjnego CNP wraz z obrazami fluorescencyjnymi zarodków myszy typu dzikiego i CNP-LacZ." src="/files/ftp_upload/3667/3667fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Szlak sygnalizacyjny cGMP wyzwala bifurkację aksonów sensorycznych w obrębie DREZ rdzenia kręgowego. (A) Schemat szlaku sygnalizacyjnego cGMP składającego się z liganda CNP, receptora cyklazy guanylowej Npr2 oraz kinazy serynowo-treoninowej cGKIα w embrionalnych neuronach zwojów korzeni grzbietowych (DRG). Npr2 generuje cGMP z GTP po stymulacji przez CNP. (B) Śledzenie pojedynczych aksonów neuronów DRG za pomocą DiI u myszy typu dzikiego i myszy z niedoborem CNP. (Pasek skali, 25 μm.)

<ol><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dil+and+diO%3A+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).</li>
<li>Acebes, A., Ferrus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+features+of+axon+collaterals+and+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular features of axon collaterals and dendrites.</a> Trends. Neurosci. 23 (11), 557-557 (2000).</li>
<li>Ozaki, S., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+trajectories+of+sensory+axons+toward+laminar+targets+in+the+developing+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Initial trajectories of sensory axons toward laminar targets in the developing mouse spinal cord.</a> J. Comp. Neurol. 380 (2), 215-215 (1997).</li>
<li>Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+receptor+guanylyl+cyclase+Npr2+is+essential+for+sensory+axon+bifurcation+within+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The receptor guanylyl cyclase Npr2 is essential for sensory axon bifurcation within the spinal cord.</a> J. Cell Biol. 179 (2), 331-331 (2007).</li>
<li>Gibson, D. A., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+axon+branching+in+the+vertebrate+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system.</a> Development. 138 (2), 183-183 (2011).</li>
<li>O'Leary, D. D., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+axons+branch+to+multiple+subcortical+targets+by+interstitial+axon+budding%3A+implications+for+target+recognition+and+%26quot%3Bwaiting+periods%26quot%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cortical axons branch to multiple subcortical targets by interstitial axon budding: implications for target recognition and &quot;waiting periods&quot;.</a> Neuron. 1 (10), 901-901 (1988).</li>
<li>Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+modes+of+axon+elaboration+in+the+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+Biol%22%5BJournal%5D)">Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex.</a> PLoS. Biol. 3 (8), e272-e272 (2005).</li>
<li>Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vital+imaging+and+ultrastructural+analysis+of+individual+axon+terminals+labeled+by+iontophoretic+application+of+lipophilic+dye%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye.</a> J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-13 (1999).</li>
<li>Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-type+natriuretic+peptide+%28CNP%29+is+a+bifurcation+factor+for+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">C-type natriuretic peptide (CNP) is a bifurcation factor for sensory neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (39), 16847-16847 (2009).</li>
<li>Zhao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulate+axon+branching+by+the+cyclic+GMP+pathway+via+inhibition+of+glycogen+synthase+kinase+3+in+dorsal+root+ganglion+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulate axon branching by the cyclic GMP pathway via inhibition of glycogen synthase kinase 3 in dorsal root ganglion sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience. 29 (5), 1350-1350 (2009).</li>
<li>Zhao, Z., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+axonal+development+by+natriuretic+peptide+hormones%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Regulation of axonal development by natriuretic peptide hormones.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (42), 18016-18016 (2009).</li>
<li>Schmidt, H., Rathjen, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+mechanisms+regulating+axonal+branching+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Signalling mechanisms regulating axonal branching in vivo.</a> Bioessays. , (2010).</li>
<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).</li>
<li>Livet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-56 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.

Stereotypowe wzorce projekcji obejmujące oba rodzaje tworzenia odgałęzień aksonalnych, w połączeniu z łatwością przygotowania oraz możliwością wykorzystania utrwalonej tkanki do znakowania DiI, sprawiają, że embrionalny rdzeń kręgowy z przylegającymi zwojami rdzeniowymi grzbietowymi (DRG) jest korzystnym modelem do badania rozgałęzień aksonalnych. Aplikacja śladowych ilości DiI przy użyciu powlekanych szklanych igieł pozwala – w przeciwieństwie do znakowania masowego DRG – na wizualizację małych grup neuronów DRG, a tym ...

<table><tbody><tr><td>Stereomikroskop Stemi DRC</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór buforowy fosforanowy (PBS)</td><td>Biochrom AG</td><td>L182-50</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>8.18715.1000</td><td></td></tr><tr><td>Standardowe nożyczki chirurgiczne</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-13</td><td></td></tr><tr><td>Standardowa pęseta ząbkowana</td><td>Fine Science Tools</td><td>11021-14</td><td></td></tr><tr><td>Bardzo precyzyjne nożyczki tęczówkowe</td><td>Fine Science Tools</td><td>14088-10</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta zakrzywiona</td><td>Fine Science Tools</td><td>11003-13</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta Dumont nr 5 z cienkimi końcówkami</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta Dumont nr 5 z lustrzanym wykończeniem</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-23</td><td></td></tr><tr><td>Sprężynowe nożyczki Vannas-T&amp;#252;bingen</td><td>Fine Science Tools</td><td>15008-08</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtracyjny</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB59041</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>SYLG184</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka Petriego 100 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>663102</td><td></td></tr><tr><td>Probówka polipropylenowa 12 ml</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>ECO3.1</td><td></td></tr><tr><td>Płytka hodowlana 12-dołkowa</td><td>BD Biosciences</td><td>35-3043</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>1.00983.2500</td><td></td></tr><tr><td>Wytwornica mikropipet Flaming/Brown P-97</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0066</td><td></td></tr><tr><td>DiI (1,1&amp;#8242;-dioctadecylo-3,3,3&amp;#8242;,3&amp;#8242;-tetrametylo&lt;strong&gt;-&lt;/strong&gt;indokarbocyjaniny nadchloran)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>468495</td><td></td></tr><tr><td>Przedmioty szkiełka SuperFrost Plus</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>H867.1</td><td></td></tr><tr><td>Szklane lamelle</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>1870.2</td><td></td></tr></tbody></table>

znakowanie neuronów ziewnięcia grzbietowego (drg) barwnikiem dii w celu badania rozgałęzień aksonalnych w preparacie całego rdzenia kręgowego zarodka myszy

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Prezentujemy technikę znakowania trajektorii niewielkich grup neuronów zzęgł zwojów korzeni grzbietowych (DRG) w embrionalnym rdzeniu kręgowym poprzez barwienie dyfuzyjne z użyciem lipofilnego znacznika 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)1. Porównanie przebiegów aksonalnych typu dzikiego z przebiegami u linii myszy z mutacjami genowymi pozwala na badanie funkcjonalnej roli białek kandydujących w kontroli rozgałęziania aksonów, co stanowi kluczowy mechanizm w tworzeniu połączeń układu nerwowego. Rozgałęzianie aksonalne umożliwia pojedynczemu neuronowi połączenie się z wieloma celami, zapewniając tym samym fizyczną podstawę do równoległego przetwarzania informacji. Ramifikacje w pośrednich obszarach docelowych wzrostu aksonów można odróżnić od arboryzacji terminalnej. Ponadto różne tryby formowania się odgałęzień aksonalnych można klasyfikować w zależności od tego, czy rozgałęzianie wynika z aktywności stożka wzrostu (podział lub rozgałęzianie opóźnione), czy z pączkowania kolaterali z trzonu aksonu w procesie zwanym rozgałęzianiem interstycjalnym2 (Rys. 1).
Centralne projekcje neuronów z zwojów rdzeniowych (DRG) stanowią przydatny układ eksperymentalny do badania obu typów rozgałęzień aksonalnych: gdy ich aksony doprowadzające docierają do strefy wejścia korzeni grzbietowych (DREZ) rdzenia kręgowego między 10. a 13. dniem embrionalnym (E10 - E13), wykazują one stereotypowy wzorzec bifurkacji w kształcie litery T lub Y. Dwa powstałe aksony potomne biegną następnie odpowiednio w kierunku rostralnym lub kaudalnym wzdłuż grzbietowo-bocznego brzegu rdzenia, a dopiero po pewnym czasie z tych aksonów pniowych wyrastają kolaterale, które penetrują istotę szarą (rozgałęzienie interstycjalne) i projektują się do neuronów przekaźnikowych w konkretnych blaszkach rdzenia kręgowego, gdzie ulegają dalszemu arboryzowaniu (rozgałęzienie terminalne)3. Śledzenie za pomocą barwnika DiI ujawniło stożki wzrostu w strefie wejścia korzeni grzbietowych rdzenia kręgowego, które zdawały się być w procesie podziału, co sugeruje, że bifurkacja jest spowodowana rozszczepieniem samego stożka wzrostu4 (Rys. 2), jednak rozważano również inne możliwości5.
W niniejszym materiale wideo zaprezentowano najpierw sposób wypreparowania rdzenia kręgowego myszy w stadium E12.5 z pozostawieniem przytwierdzonych zwojów rdzeniowych (DRG). Po utrwaleniu preparatu, za pomocą szklanych igieł wyciągniętych z kapilar, do DRG nanosi się niewielkie ilości barwnika DiI. Po etapie inkubacji, znakowany rdzeń kręgowy zostaje zamocowany jako preparat w układzie otwartej książki (inverted open-book preparation) w celu analizy poszczególnych aksonów przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.

Stereotypowe projekcje aferentów sensorycznych do rdzenia kręgowego gryzoni stanowią łatwo dostępny system eksperymentalny do badania rozgałęzień aksonalnych poprzez śledzenie pojedynczych aksonów.

Znakowanie neuronów ziewnięcia grzbietowego (DRG) barwnikiem DiI w celu badania rozgałęzień aksonalnych w preparacie całego rdzenia kręgowego zarodka myszy

Prezentujemy technikę znakowania trajektorii małych grup neuronów z zwojów korzeni grzbietowych (DRG) w embrionalnym rdzeniu kręgowym za pomocą barwienia dyfuzyjnego z wykorzystaniem...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja wzorców rozgałęzień pojedynczych aksonów neuronów z zwojów korzeni grzbietowych (DRG) w preparacie całego embrionalnego rdzenia kręgowego myszy. Aby zidentyfikować cząsteczki zaangażowane w rozgałęzianie aksonalne, projekcje neuronów DRG do rdzenia kręgowego myszy stanowią prosty, łatwy i dostępny system eksperymentalny do badania tego procesu. Gdy aksony ENT neuronów DRG docierają do strefy wejścia korzeni grzbietowych rdzenia, wykazują one stereotypowy wzorzec bifurkacji w kształcie litery T lub Y.Dwa powstałe aksony potomne kierują się następnie odpowiednio w stronę rostralną lub rdzeniową, wzdłuż grzbietowo-bocznego brzegu rdzenia. Dopiero po pewnym czasie z aksonów tych wyrastają pędy kolaterale, które penetrują istotę szarą i rzutują na neurony przekaźnikowe w konkretnych warstwach rdzenia kręgowego, gdzie dochodzi do arboryzacji końcowej. Niniejszy film demonstruje w pierwszej kolejności sposób preparowania rdzenia kręgowego.Po utrwaleniu preparatu z przyłączonym zwojem korzeni grzbietowych (DRG) myszy z 12,5 dnia embrionalnego, niewielkie ilości dii nanosi się na DRG za pomocą szklanych igieł wykonanych z rurek kapilarnych. Po etapie inkubacji, znakowany rdzeń kręgowy jest montowany jako preparat w układzie otwartej książki (inverted open book preparation) w celu analizy poszczególnych aksonów przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Rozgałęzianie się aksonów jest istotnym aspektem rozwoju łączności neuronalnej. Metoda przedstawiona w niniejszej pracy pozwala na porównanie wzorców rozgałęzień typu Y z wzorcami u myszy mutantów, co umożliwia identyfikację cząsteczek regulujących rozgałęzianie aksonalne.Najpierw należy przygotować stereomikroskop oraz rozłożyć narzędzia chirurgiczne niezbędne do sekcji. W szalce Petri o średnicy 100 mm pokrytej powłoką silk guard należy umieścić arkusz papieru filtracyjnego. Następnie do dołków płytki 12-dołkowej, szalki Petri o średnicy 100 mm oraz probówki o pojemności 12 ml należy nalać zimny PBS i pozostawić na lodzie.Do każdego dołka drugiej płytki 12-dołkowej pipetuj dwa mililitry 4% buforu utrwalającego z paraldehydem i umieść ją na lodzie. Po wyizolowaniu obustronnych rogów macicy myszy, przenieś je do 100 milimetrowego naczynia z lodowatym PBS. Po dekapitacji embrionów przenieś ich toci do płytki 12-dołkowej.Zwilż papier filtracyjny w szalce Strauβa kilkoma kroplami PBS i ułóż tułów embrionu stroną grzbietową do góry na papierze, aby zapewnić lepszą stabilność. Prostując ogon i kończyny z dala od ciała, pracuj pod mikroskopem stereoskopowym przy powiększeniu około 16-krotnym. Ostrożnie uchwyć skórę embrionu nad rdzeniem kręgowym za pomocą dwóch par pęset z cienkimi końcówkami, zaczynając od środka.Najpierw delikatnie rozetnij skórę w kierunku ogona, a następnie, zaczynając od środka, w kierunku przednim. Od czasu do czasu zwilżaj embrion dwiema lub trzema kroplami PBS, aby zapobiec jego wyschnięciu i upewnić się, że zwoje korzeni grzbietowych (DRG) nie zostaną oderwane od rdzenia kręgowego. Po odsłonięciu, oddziel DRG oraz rdzeń kręgowy od otaczającej chrzęstnej kolumny kręgosłupa, zaczynając od środkowej części prawej strony embrionu i kierując się ku ogonowi, a następnie ku końcowi przedniemu, aby całkowicie oddzielić poluzowany rdzeń kręgowy od embrionu.Chwyć część szyjną pęsetą anatomiczną i wyciągnij ją w całości w stronę rdzenia. Koniec. Zanurz wyizolowany rdzeń kręgowy z przymocowanymi zwojami korzeni grzbietowych (DRG) w dołku 12-dołkowej płytki wypełnionej buforem utrwalającym, a następnie przystąp do przygotowania rdzeni kręgowych z pozostałych embrionów.Utrwal rdzenie kręgowe przez co najmniej dwie godziny w lodzie dla każdego rdzenia przeznaczonego do znakowania, a następnie przygotuj dwie szklane igły za pomocą wyciągarki do mikrokapilar pod kontrolą mikroskopową. Zanurz końcówkę każdej szklanej igły od trzech do pięciu razy w 5% roztworze barwnika w etanolu, aby wytworzyć na igle cienką warstwę kryształków barwnika, pracując pod mikroskopem stereoskopowym przy powiększeniu około 40x. Za pomocą nożyczek sprężynowych umieść rdzeń kręgowy stroną brzuszną do góry na szkiełku przedmiotowym.Rozetnij rdzeń na całej długości od strony brzusznej, przecinając płytkę dna, aby umożliwić montaż w pozycji otwartej książki odwróconej. Umieść rdzeń kręgowy na szkiełku przedmiotowym stroną grzbietową do góry. Następnie zbliż końcówkę szklanej igły pokrytą dai do rdzenia i ostrożnie przebij co drugi zwoj grzbietowy (DRG) po jednej stronie rdzenia kręgowego.W przebitym zwoju korzenia grzbietowego (DRG) prawie nie powinno być widocznych śladów barwnika DiA, aby zapewnić znakowanie tylko niewielkiej liczby neuronów przy użyciu drugiej igły. Powtórz procedurę dla drugiej strony rdzenia, celując jedynie w co drugi DRG, aby uniknąć nakładania się znakowanych projekcji aksonalnych z sąsiednich zwojów, co mogłoby utrudnić rozróżnienie poszczególnych aksonów.Przenieś rdzeń kręgowy z powrotem do buforu utrwalającego i inkubuj w ciemności przez co najmniej sześć godzin w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C, aby umożliwić dyfuzję barwnika wzdłuż aksonu w obrębie błony plazmatycznej. Po dyfuzji barwnika umieść pojedynczy rdzeń kręgowy stroną grzbietową do dołu na szkiełku nakrywowym w kropli PBS, odciągnij nadmiar płynu i rozpłaszcz rdzeń w pozycji otwartej książki, używając pęsety.Należy zadbać o to, aby przytwierdzone zwoje korzeni grzbietowych (DRG) były prawidłowo zorientowane bocznie i nie nakładały się na siebie; preparat należy zamocować na szkiełku przedmiotowym, używając PBS, aby zapobiec zwiększeniu niepożądanego tła barwienia. Analizę mikroskopową fluorescencyjną znakowanych projekcji aksonalnych należy przeprowadzić w dniu zamocowania. Do tego czasu szkiełka należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C.Tutaj przedstawiono widoki grzbietowe z oznakowaniem Dai DRG u myszy typu dzikiego przy zwiększeniu powiększenia, zgodnie z opisem co sekundę. DRG zostało oznakowane za pomocą Dai. Tutaj oznakowano niewielką liczbę aksonów, a przy większym powiększeniu w strefie wejścia korzeni grzbietowych rdzenia kręgowego można zidentyfikować obecność rozgałęzień w kształcie litery T.Gałęzie w kształcie litery T. Liczba pojedynczych skrętów rostralnych R lub kordalnych C została tutaj określona na różnych poziomach kręgów u myszy typu dzikiego oraz myszy z niedoborem natriuretycznego peptydu typu C CMP. W stadium E 13.5.Całkowita liczba policzonych neuronów jest podana w nawiasie, a procentowy udział typu trajektorii jest wskazany poniżej. W przeciwieństwie do typu dzikiego, aksony neuronów DRG w mutantach sygnalizacji CMP skręcają tylko w jednym kierunku, zamiast rozgałęziać się w strefie wejścia korzenia grzbietowego rdzenia kręgowego. Metoda ta pomogła nam zidentyfikować kaskadę sygnalizacyjną CGP, która jest niezbędna dla rozgałęzienia aksonów sensorycznych w strefie wejścia korzenia grzbietowego.W przeciwieństwie do typów dzikich cgm, ruch sygnalizacji P odbywa się tylko w jednym kierunku, zamiast rozwidlać się w strefie wejścia korzenia grzbietowego. Badania te wykazały również, że formowanie co nie jest zaburzone u mutantów sygnalizacji CG P, co wskazuje na to, że drugi typ rozgałęziania aksonalnego obserwowany w neuronach DGen jest regulowany w inny sposób.

dii-labeling-drg-neurons-to-study-axonal-branching-whole-mount

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Oznaczanie DiI neuronów DRG w celu badania rozgałęziania aksonów w preparacie całego zarodka rdzenia kręgowego myszy

Prezentujemy zastosowanie pistoletu genowego do wprowadzania barwników fluorescencyjnych, takich jak DiI, do neuronów wyrytych z plastrów mózgu gryzoni oraz naczelnych innych niż człowiek w różnym wieku. W tym konkretnym przypadku wykorzystujemy dorosłe myszy (w wieku 3–6 miesięcy) oraz dorosłe makaki krabikowate (w wieku 9–15 lat). Technika ta, pierwotnie opisana przez laboratorium dr. Lichtmana (Gan et al., 2000), jest odpowiednia do badania rozgałęzień dendrytycznych oraz morfologii kolców...

DIOLISTYCzne znakowanie neuronów w skrawkach mózgu gryzoni i naczelnych niebędących ludźmi

Przedstawiono metodę sekcji in vivo brzusznego sznura nerwowego (VNC) dorosłego owada Drosophila. Ta konkretna metoda sekcji powoduje niewielkie uszkodzenia VNC, co umożliwia późniejsze znakowanie neuronów włókien olbrzymich barwnikiem fluorescencyjnym w celu uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości.

Przygotowanie całego preparatu brzusznego sznura nerwowego dorosłej Drosophila do wstrzykiwania barwnika do włókien olbrzymich

Neurony sensoryczne o arboryzacji dendrytycznej w obwodowym układzie nerwowym larw Drosophila stanowią użyteczne modele do wyjaśniania zarówno ogólnych, jak i specyficznych dla danej klasy neuronów mechanizmów różnicowania neuronów. Przedstawiamy praktyczny przewodnik po generowaniu i analizie mozaik genetycznych neuronów o arboryzacji dendrytycznej.

Analiza morfologiczna dendrytów i aksonów obwodowych neuronów sensorycznych larw Drosophila z wykorzystaniem mozaik genetycznych

Prezentujemy technikę oznaczania pojedynczych neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) zarodków Drosophila, która pozwala na analizę morfologii neuronów za pomocą światła przechodzącego lub mikroskopii konfokalnej.

Znakowanie pojedynczych komórek w ośrodkowym układzie nerwowym Drosophila melanogaster

Prezentujemy tutaj zoptymalizowany protokół genotypu, barwienia i przygotowania płodów myszy do obrazowania obwodowych projekcji aksonów nocyceptora u całego zwierzęcia, jako skuteczną metodę oceny fenotypów wzrostu aksonów czuciowych u genetycznie modyfikowanych myszy.

Obrazowanie w całości projekcji czuciowych aksonów zarodków myszy

Tutaj prezentujemy protokół hydraulicznego wytłaczania rdzenia kręgowego, jak również identyfikacji i izolacji specyficznych zwojów korzenia grzbietowego (DRG) u tego samego gryzonia. W porównaniu ze standardowymi metodami izolacji rdzenia kręgowego, metoda ta jest znacznie szybsza i zmniejsza ryzyko uszkodzenia tkanek.

Hydrauliczne wytłaczanie rdzenia kręgowego i izolacja zwojów korzenia grzbietowego u gryzoni

W tym raporcie, zalety kultur organotypowych i dysocjacji kultur pierwotnych zwojów korzenia grzbietowego pochodzących od myszy są podkreślone w celu zbadania szerokiego zakresu mechanizmów związanych z interakcją neuron-glej, neuroplastycznością, zapaleniem nerwów i reakcją na infekcję wirusową.

Dorosłe myszy DRG eksplantowane i zdysocjowane modele komórkowe w celu zbadania neuroplastyczności i reakcji na zniewagi środowiskowe, w tym infekcje wirusowe

Elektroporacja to skuteczne podejście do dostarczania interesujących genów do komórek. Stosując to podejście in vivo na neuronach zwoju korzenia grzbietowego dorosłej myszy (DRG), opisujemy model do badania regeneracji aksonów in vivo.

Badanie regeneracji aksonów ssaków: elektroporacja in vivo zwoju korzenia grzbietowego dorosłej myszy

Opisujemy metodę wstecznego śledzenia embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych.

Wsteczne śledzenie embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych

Prezentowany jest tutaj rozwój konsekwentnego pozyskiwania wysokiej jakości sekcji kriostatu zwoju korzenia grzbietowego.

Procedura kriosekcji kriosekcji zwoju korzenia grzbietowego myszy

Czubki korzeniowe grzbietowe (DRG) zawierają pierwotne ciała komórkowe neuronów czuciowych i przekazują obwodowe sygnały czuciowe do rdzenia kręgowego. Niniejszy protokół opisuje metodę rozpinania czupczyków korzeniowych grzbietowych u myszy, która wspiera standaryzowaną izolację strukturalnie nietkniętych czupczyków, identyfikację anatomiczną segmentów, intuicyjną instrukcję dla początkujących użytkowników oraz zmniejszone uszkodzenie tkanki podczas procedury.

Sekcja i odizolowanie klastrów czuciowych rdzenia kręgowego myszy

Poznaj metodę znakowania DiI neuronów DRG w całym przygotowaniu zarodka myszy do rdzenia kręgowego. Technika ta umożliwia wizualizację wzorców rozgałęzień aksonalnych w badaniach nad rozwojem układu nerwowego.

Znakowanie neuronów ziewnięcia grzbietowego (DRG) barwnikiem DiI w celu badania rozgałęzień aksonalnych w preparacie całego rdzenia kręgowego zarodka myszy

Przeglądaj więcej filmów