Przygotowanie pojedynczych komór jajeczkowych Drosophila do obrazowania na żywo

Celem następującego eksperymentu jest rejestracja procesów dynamicznych w żywych miejscach U (U sites) u muszek owocówek drosophila. Osiąga się to poprzez wstępną izolację nienaruszonych jajników od dobrze odżywionych, dwudniowych samic much. W drugim kroku z jajników wyodrębnia się poszczególne owokule, aby obrazować komory jajowe.

Następnie, jeśli wykazują one ekspresję odpowiedniego białka fluorescencyjnego, poszczególne komory jajowe mogą być obrazowane bezpośrednio lub poddane dalszym manipulacjom, takim jak mikroiniekcja znaczników fluorescencyjnych przed obrazowaniem. Ostatecznie, dzięki analizie sekwencji filmowych, można ujawnić dynamiczne oddziaływania składników wewnątrzkomórkowych. Metoda ta pomogła nam odpowiedzieć na kilka kluczowych pytań z zakresu transportu RNA i translacji lokalnej.

Na przykład, w jaki sposób w żywym organizmie regulowana jest w czasie i przestrzeni ekspresja białek odpowiedzialnych za ustalenie planu budowy ciała? Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie będą napotykać trudności, ponieważ wymaga ona znacznej szybkości i zręczności. Lepsze wyniki zostaną osiągnięte dzięki praktyce.

Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ manipulacje w komorach jajeczkowych są trudne do opisania tekstem, a ponadto wymagają cierpliwości, biegłości technicznej i pewnej ręki. Rozpocznij procedurę, umieszczając małą kroplę oleju halokarbonowego na szkiełku nakrywce i odstawiając je na bok. Następnie znieczul przygotowane muchy dwutlenkiem węgla.

Używając ostrej pęsety precyzyjnej, chwyć tuczoną samicę muchy w przedniej części odwłoka. Nie chwytaj w centralnej części odwłoka. Przytrzymaj samicę mniej więcej dwa do trzech centymetrów nad przygotowanym szkiełkiem nakrywnym.

Używając drugiej pary pęsety, usuń tkankę z najbardziej tylnej części samicy. Zazwyczaj obejmie to tkanki jelita, które należy usunąć czystą pęsetą. Delikatnie masuj odwłok od końca przedniego do tylnego, podobnie jak przy wyciskaniu pasty z tubki.

Jajniki wyglądają jak duże, nieprzezroczyste struktury i będą przylegać do końcówki pęsety. Należy zebrać jajniki, dotykając nimi warstwy oleju węglowego halo na szkiełku. Następnie powtarza się ten proces, aż zostanie zebranych od czterech do sześciu jajników.

Przed wyizolowaniem narządów powietrznych należy dostosować źródło światła w mikroskopie tak, aby oświetlenie padało na preparat pod niewielkim kątem i tworzyło kontrastujące cienie na tkankach. Podczas przeprowadzania sekcji much bardzo ważne jest użycie odpowiednich narzędzi.

Używany przez nas wskaźnik nie jest zbyt ostry, aby nie uszkodzić tkanki, lecz wystarczająco tępy, abyśmy mogli uchwycić pęsetę. Podobnie pęsety nie są zbyt ostre, by nie uszkadzać tkanek, ale są na tyle precyzyjne, że pozwalają nam manipulować elementami bez wyginania narzędzia. Bardzo ważne jest również utrzymanie narzędzi w czystości, dlatego regularnie oczyszczamy je w trakcie procedury przy zamkniętych kleszczach.

Oddziel dwa jajniki, usuwając tkankę łączną na końcu tylnym. Koniec tylny zawiera najbardziej dojrzałe komory jajowe. Ułóż jajnik poziomo tak, aby najmłodsze komory jajowe były skierowane w stronę Twojej dominującej ręki.

Następnie delikatnie chwyć tylny koniec za pozostałą tkankę łączną i użyj sondy sekcyjnej lub igły wolframowej, aby oddzielić poszczególne oocyty; komory jajowe od stadium Jamar do stadium 10 oddzielą się od siebie, natomiast starsze komory jajowe pozostaną przytwierdzone do jajnika. Za pomocą sondy ostrożnie przeciągnij od 15 do 25 oddzielonych oocytów do centrum kropli oleju. Jeśli konieczne jest wypreparowanie więcej niż jednego jajnika, wybierz go z innej muchy.

Usuń nadmiar tkanki jajnika i pracuj szybko, ponieważ cyty zaczną wykazywać zmiany fenotypowe spowodowane stresem. Po 40 minutach od wycięcia z jajnika usuń nadmiar tkanki jajnika z oleju. Używając czystych narzędzi do wstrzykiwania cytów w stadium średnim, ustaw aeriale prostopadle do długiej osi szkiełka nakrywki. Aby wyizolować komory jaj w stadium późnym.

W przypadku chwytania tylnej części jajnika, zgodnie z wcześniejszym opisem, wymagana jest inna metoda. Wprowadź sondę do sekcji w tylną część jajnika w pobliżu pęsety. Aby uniknąć przebicia komór jajowych, wprowadź sondę pomiędzy komory jajowe w późnym stadium rozwoju.

Przesuń igłę sekcyjną przez jajnik, aż wyjdzie ona w obrębie komór jajowych we wczesnym stadium rozwoju. Przy prawidłowym wykonaniu zabiegu sonda usunie tkankę łączną utrzymującą w miejscu owulariów oraz komór jajowych w późnym stadium rozwoju. Powtarzaj ten krok, aż owularia zostaną rozłożone na szkiełku nakrywnym.

Krok ten jest zakończony, gdy komory jajowe nie są już ułożone jedna na drugiej. Za pomocą sondy sekcyjnej oddziel komory jajowe w późnym stadium, aby ułatwić obrazowanie w celu ustawienia stadium 14. Do chwycięcia wyrostków grzbietowych komór szyjnych należy użyć pęsety.

Przygotuj roztwory do wstrzyknięcia, krótko wirując je przy wysokiej prędkości. Pozwoli to na osadzenie wszelkich stałych złogów, które mogłyby zablokować igłę wtryskową. Następnie napełnij igłę wtryskową za pomocą końcówki ładującej i ostrożnie przymocuj napełnioną igłę do wtryskiwacza.

Teraz umieść mały kawałek szkła obok próbek i zamocuj preparas na stoliku mikroskopu. Szkło będzie służyć jako ścianka do przełamania lub odłączenia. Wyjmij igłę.

Przygotuj mikroskop i aparat do iniekcji do eksperymentu. Zachowaj ostrożność, aby nie złamać końcówki igły. Jeśli to możliwe, użyj zautomatyzowanego stolika z funkcją zapamiętywania punktów, aby zaznaczyć wszystkie cyty w stadium ósmym i dziewiątym przeznaczone do iniekcji.

Teraz opuść igłę wtryskową, aż dotknie ona oleju. Wybierz pierwszy punkt z listy zaznaczonych punktów i ustaw ostrość na cyt. Ręcznie obniżaj igłę, aż znajdzie się ona w tej samej płaszczyźnie ogniskowania co cyt.

Za pomocą sterowników manipulatora przesuń końcówkę igły wstrzykującej, aż znajdzie się ona w obszarze U. Szybki ruch wbijający jest często skuteczniejszy niż powolny. Po wprowadzeniu igły wstrzyknij niewielką objętość i wizualnie oceń efekty.

Konieczne jest powtórzenie procedury. Jeśli wtryskiwanie przebiegnie pomyślnie, cytoplazma wewnątrz komórki zostanie przemieszczona. Precyzyjne ilości wstrzykniętego płynu są trudne do określenia.

Aby zwiększyć objętość wtrysku, należy dostosować ciśnienie lub czas trwania impulsu wtrysku. Można złamać końcówkę igły, aby lekko powiększyć jej otwór, lub po prostu zastosować kilka impulsów wtrysku przed wybraniem kolejnego mark.Cyte. Unieść igłę wtryskową wystarczająco wysoko w oleju, aby nie uderzała ona o inne cytes.

Wielokrotne nakłuwanie lub zbyt długie pozostawienie igły wewnątrz cytu powoduje poważne uszkodzenie komory jaja. Należy zatem działać szybko. Iniekcja powinna zająć mniej niż 10 sekund.

W przypadku popełnienia błędu należy przejść do kolejnego oznaczonego miejsca. Nie należy tracić czasu na uszkodzone obszary. Gdy igła zostanie zapchana, należy przenieść ją do rozbitego kawałka szkła.

Kiedy szkło i igła znajdują się w tej samej płaszczyźnie ogniskowania, delikatnie wbij igłę w szkło. Sprawdź, czy igła nie jest zapchana, naciskając przycisk iniekcji i obserwując, czy z końcówki igły wypływa ciecz. Po wykonaniu iniekcji we wszystkich miejscach US, ręcznie wyjmij igłę z oleju i skieruj ją poza tor wiązki mikroskopu.

Należy upewnić się, że urządzenie jest ustawione w bezpiecznej orientacji, aby uniknąć uszkodzenia wzroku, a światła są wyłączone. W celu usprawnienia obrazowania fluorescencyjnego kluczowe znaczenie ma szybkość działania. Jeśli od momentu izolacji komór jajnika do iniekcji cytów upłynie godzina lub więcej, cyty będą trudne do zainiekowania i wykażą zmiany fenotypowe związane ze stresem.

Podobne problemy mogą wystąpić w przypadku gwałtownego obchodzenia się z komórkami lub wstrzyknięcia zbyt dużych objętości. Komory jajowe wykazujące ekspresję transgenicznych białek fluorescencyjnych można obrazować bez konieczności iniekcji. Markowanie endogennego RNA za pomocą MS2 można obrazować z dobrymi efektami, stosując procedury izolacji tkanek przy użyciu pełnego procesu syntezy in vitro.

Po wstrzyknięciu RNA Alexa, 5 46 kin do komory jajowej ME 31 BGFP, RNA zlokalizowało się w części grzbietowo-przedniej cyte i utworzyło czapkę wokół jądra. Po opanowaniu tej techniki, proces od momentu wypreparowania tkanki do rozpoczęcia obrazowania zajmuje około 10 minut. Podczas wykonywania tej procedury należy dbać o tkankę, pracując szybko, ale ostrożnie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak rejestrować dynamiczne procesy w żywych cyte Drosophila.