Name: Przygotowanie indywidualnych komór jajowych Drosophila do obrazowania na żywo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Naucz się przygotowywać komórki jajowe Drosophila do obrazowania na żywo w celu badania lokalizacji mRNA. Ta metoda umożliwia rejestrację dynamicznych procesów w żywych tkankach z wysoką rozdzielczością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niniejsza praca została sfinansowana ze stypendium Senior Research Fellowship przyznanego I. Davis przez Wellcome Trust.

1. Przygotowanie Drosophila przed sekcją (według E. Gavis, Princeton University)
<ol>
	<li>Usuń dorosłe osobniki z rzadko zasianej butelki i przenieś butelkę do temperatury 25 °C przed rozpoczęciem eksperymentu. Gdy zaczną wykluwać się nowe osobniki dorosłe, odczekaj dwa dni.</li>
	<li>Weź fiolkę z muchami zawierającą około 10ml stałej pożywki i dodaj 0,5-0,7 grama suchych drożdży (patrz tabela), trzymając fiolkę pod kątem 45 stopni. Nie zasypuj drożdżami całej powierzchni pożywki.</li>
	<li>Dodaj do drożdży kilka kropel wody, wystarczającą do ich nawilżenia (Rycina 1A). Ustaw fiolkę pod kątem 45 stopni i odczekaj około 3 minut, aż drożdże wchłoną wodę (Rycina 1B).</li>
</ol>
Uwaga: Alternatywnie można przygotować pastę drożdżową w osobnym pojemniku, a następnie przenieść ją do fiolki za pomocą szpatułki.
<ol start="4">
	<li>Znieczul muchy w fiolce poprzez wstrzyknięcie gazu CO2. Gdy przestaną się poruszać, przenieś nieprzytomne muchy na podkładkę do sortowania z CO2 (Rycina 1C).</li>
	<li>Wyizoluj 10-15 samic i 5 samców pożądanego genotypu pod stereomikroskopem, używając pędzelka z cienkim włosiem (Rycina 1D). Samce są łatwo rozpoznawalne po obecności chwytników, ciemnych wystających struktur w części tylnej ciała.</li>
	<li>Przenieś wybrane muchy do fiolki z pożywką drożdżową (Rycina 1E). Inkubuj w temperaturze 25 °C przez 24-60 godzin. Stosuj krótsze okresy inkubacji, aby uzyskać większy odsetek komór jajowych we wczesnej i średniej fazie, oraz dłuższe okresy dla komór jajowych w późnej fazie.</li>
</ol>
2. Disekcja jajnika Drosophila
<ol>
	<li>Nanieś małą kroplę oleju halowęglowego na szkiełko nakrywkowe nr 1,5 o wymiarach 22 x 50 mm (Rycina 2A). Odstaw przygotowane szkiełko nakrywkowe w miejsce, w którym nie będzie przeszkadzać.</li>
	<li>Uśpij muchy w fiolce z drożdżami poprzez wstrzyknięcie gazu CO2 i przełóż je na podkładkę z CO2.</li>
	<li>Za pomocą ostrych pęsety z cienkimi końcówkami chwyć pojedynczą, dobrze odżywioną samicę w przedniej części odwłoka (nie pomiędzy odwłokiem a tułowiem) (Rycina 2B-C).</li>
	<li>Przytrzymaj samicę pęsetą i obejrzyj pod mikroskopem stereoskopowym, mniej więcej 2-3 cm nad przygotowanym szkiełkiem nakrywowym.</li>
	<li>Nadal trzymając samicę za przednią część, użyj drugiej pęsety, aby usunąć tkankę z samego końca odwłoka (Rycina 2D). Uwaga: tkanka jelita zazwyczaj zostanie wyciągnięta wraz z końcem odwłoka. Wytrzyj usuniętą tkankę z pęsety.</li>
	<li>Trzymając nadal samicę za przednią część, użyj oczyszczonej pęsety, aby delikatnie ścisnąć lub masować odwłok, przesuwając się od przodu ku tyłowi. Masuj odwłok w taki sam sposób, w jaki wyciska się pastę do zębów z tubki.</li>
	<li>Z odwłoka zostaną wypchnięte dwie duże, nieprzezroczyste struktury, które przykleją się do końcówki pęsety (Rycina 2E-F). Są to sparowane jajniki.</li>
	<li>Dotknij jajnikami kropli oleju halowęglowego na szkiełku poniżej.</li>
	<li>Powtórz sekcję 1-2 razy, aby uzyskać łącznie 4-6 jajników w oleju na szkiełku nakrywowym (Rycina 2G).</li>
</ol>
3. Izolacja ovariol
Uwaga: Każdy jajnik zawiera około 16 owarioli składających się z 6 do 10 komór jajowych na różnych etapach rozwoju, ułożonych podobnie jak paciorki na sznurku10.
Uwaga: Przed izolacją owariol należy dostosować źródło światła w mikroskopie stereoskopowym tak, aby oświetlenie padało na próbkę pod małym kątem. Zapewnia to kontrast i umożliwia wizualizację komór jajowych we wczesnym stadium rozwoju.
<ol>
	<li>W oleju oddziel dwa jajniki, usuwając tkankę łączną na końcu tylnym (w przypadku starszych stadiów) za pomocą zamkniętej pęsety (Rycina 3A).</li>
	<li>Zorientuj pojedynczy jajnik tak, aby najstarsze stadia znajdowały się po lewej stronie, a najmłodsze po prawej. Komory jajeczne w stadium młodym są przezroczyste i tworzą bardziej zaostrzony koniec jajnika.</li>
	<li>Trzymając pęsetę w dominującej dłoni, delikatnie chwyć tylną część jajnika, najlepiej za pozostałości tkanki łącznej. Przytrzymując jajnik pęsetą, użyj sondy sekcyjnej (lub igły wolframowej), aby wyizolować poszczególne owariolami (Rycina 3B-D).</li>
</ol>
Uwaga: Poszczególne ovaria będą pękać w przypadku wczesnych stadiów (od germarium do stadium 10), ponieważ starsze stadia są zbyt duże, aby można było je oddzielić od całego jajnika.
Uwaga: Przebicie oocytu w późnym stadium rozwoju za pomocą sondy do mikrodysekcji spowoduje wyciek cytoplazmy do oleju, co znacznie utrudni wyodrębnienie poszczególnych owarioli. W przypadku przebicia oocytu w późnym stadium należy przejść do pracy z nowym jajnikiem.
<ol start="4">
	<li>Po oddzieleniu owarioli od jajnika, za pomocą sondy do sekcji przesuń ją na środek kropli oleju i ustaw w pozycji wymaganej do przeprowadzenia eksperymentu. Uwaga: Owariole w oleju osiadają i przylegają do szkła.</li>
	<li>Powtarzaj ten proces (3.3-3.4), aż uzyskasz 15-25 pojedynczych owarioli. Uwaga: Może to wymagać sekcji wielu jajników. Cały proces powinien zająć mniej niż 15 minut.</li>
</ol>
Uwaga: Zaleca się wypreparowanie po jednym jajniku z kilku much, zamiast obu jajników z mniejszej liczby osobników, aby zwiększyć liczbę n much w eksperymencie.
Uwaga: Nieostrożne obchodzenie się z owariolą spowoduje uszkodzenie oocytów i może doprowadzić do powstania artefaktów w eksperymencie.
Uwaga: Oocyty zaczną wykazywać zmiany fenotypowe wynikające ze stresu 40 minut po wyizolowaniu z jajnika (porównaj rysunek 7E z F).
<ol start="6">
	<li>Gdy owariole znajdą się w odpowiedniej orientacji (Rycina 3E), należy użyć sondy sekcyjnej i zamkniętej pęsety, aby usunąć nadmiar tkanki jajnika z oleju. Materiał ten można zebrać z pęsety za pomocą ręcznika papierowego.</li>
</ol>
4. Izolowanie pojedynczych komór jajowych w późnym stadium (według E. Gavis, Princeton University)
<ol>
	<li>Trzymając pęsetę w dominującej dłoni, chwyć tylną część wyizolowanego jajnika, najlepiej za pozostałości tkanki łącznej. Przytrzymując jajnik pęsetą, wprowadź sondę sekcyjną do tylnego końca jajnika w pobliżu pęsety (Rysunek 4A). Unikaj przebijania komór jajowych, wprowadzając sondę pomiędzy komory jajowe w późnym stadium rozwoju.</li>
	<li>Przeciągnij igłę sekcyjną przez jajnik, aż wyjdzie ona w obrębie komór jajowych we wczesnym stadium (Rysunek 4B). Jeśli czynność zostanie wykonana prawidłowo, sonda usunie tkankę łączną utrzymującą ovaria i komory jajowe w późnym stadium na miejscu.</li>
	<li>Powtarzaj krok 4.2, aż ovaria zostaną rozłożone na szkiełku nakrywce. Uwaga: Krok ten jest zakończony, gdy komory jajowe nie będą już ułożone jedna na drugiej.</li>
	<li>Za pomocą sondy sekcyjnej rozdziel późne oocyty, aby umożliwić łatwe obrazowanie (Rysunek 4C).</li>
</ol>
Uwaga: Przebicie oocytu podczas sekcji komór jajowych w późnych stadiach nie jest tak krytyczne, jak w przypadku sekcji poszczególnych owarioli w stadiach młodszych.
Uwaga: W przypadku komór jajowych w stadium 14 należy użyć pęsety, aby uchwycić wyrostki grzbietowe w celu ich zorientowania.
5. Przygotowanie do iniekcji
Uwaga: W przypadku iniekcji oocytów w stadium średnim, należy zorientować owariole prostopadle do długiej osi szkiełka podstawowego.
<ol>
	<li>Włącz mikroskop obrazujący [w naszym przypadku DeltaVision Core od Applied Precision] i załaduj odpowiednie ustawienia obrazowania (rycina 5A-B).</li>
	<li>Włącz aparat do iniekcji (rycina 5C).</li>
	<li>Napełnij igłę iniekcyjną za pomocą końcówki do ładowania (rycina 5D-E). Roztwory przeznaczone do iniekcji należy krótko odwirować z dużą prędkością, aby uniknąć powstania osadów, które mogłyby zablokować igłę iniekcyjną.</li>
	<li>Przymocuj napełnioną igłę iniekcyjną do injektora. Należy uważać, aby nie złamać igły (rycina 5F).</li>
	<li>Aby ułatwić udrażnianie igieł, umieść mały kawałek szkła 2x10 mm z pociętej lub pękniętej lamielki z jednej strony kropli oleju zawierającej ovariola. Upewnij się, że fragment szkła jest pokryty olejem. Szkło to będzie służyć do uderzania końcówką igły w celu jej przełamania lub udrożnienia.</li>
</ol>
6. Iniekcja fluorescencyjnego RNA
Przed rozpoczęciem: Przygotuj aparat do iniekcji oraz sterowniki mikromanipulatora w taki sposób, aby igła iniekcyjna znajdowała się nad środkiem pola widzenia.
<ol>
	<li>Zamocuj próbkę do wstrzyknięcia na stole mikroskopu.</li>
	<li>Wybierz obiektyw 20x. Można również zastosować obiektywy o większym lub mniejszym powiększeniu.</li>
</ol>
Uwaga: W przypadku korzystania z zautomatyzowanego stolika z funkcją odwiedzania punktów zaleca się zaznaczenie wszystkich oocytów w stadium 8-9 przeznaczonych do iniekcji przed rozpoczęciem pracy. Umożliwia to łatwe lokalizowanie i iniekcję wybranych oocytów.
<ol start="3">
	<li>Obniż igłę do iniekcji, aż dotknie ona oleju. Wycentruj końcówkę igły nad obiektywem.</li>
	<li>Wyłącz światło w pomieszczeniu i włącz oświetlenie w polu jasnym mikroskopu. Wybierz pierwszy punkt (oocyt) z listy zaznaczonych punktów. Patrząc przez okulary, ustaw ostrość na oocycie (Rysunek 6A).</li>
	<li>Obniż igłę ręcznie, aż znajdzie się ona w tej samej płaszczyźnie ostrości co oocyt i będzie widoczna obok niego.</li>
	<li>Za pomocą sterowników manipulatora przesuń końcówkę igły do iniekcji, aż znajdzie się ona wewnątrz oocytu. Szybki ruch wbijający jest często skuteczniejszy niż powolne posuwanie. Po wprowadzeniu igły wstrzyknij niewielką objętość i wizualnie oceń efekty, powtarzając czynność w razie potrzeby. Jeśli iniekcja przebiegła pomyślnie, cytoplazma wewnątrz oocytu zostanie przemieszczona; jeśli nie jest to widoczne, powtórz proces. Obrazowanie fluorescencyjne nie jest konieczne do stwierdzenia, czy materiał został wstrzyknięty. Po iniekcji wyjmij igłę z wnętrza oocytu (Rysunek 6B-G).</li>
	<li>Dokładna ilość wstrzykniętego płynu jest trudna do ilościowego określenia. Aby zwiększyć objętość iniekcji, należy dostosować ciśnienie lub czas impulsu wtrysku, lekko odłamać końcówkę igły w celu zwiększenia otworu lub zastosować wielokrotne impulsy iniekcji.</li>
</ol>
Uwaga: Cały proces iniekcji, jeśli zostanie wykonany prawidłowo, powinien trwać mniej niż 10 sekund. Wielokrotne nakłuwanie lub zbyt długie pozostawianie igły wewnątrz oocyta spowoduje poważne uszkodzenie komory jaja.
<ol start="8">
	<li>Przed wybraniem kolejnego oznakowanego oocytu, unieś igłę do iniekcji wystarczająco wysoko w oleju, aby nie dotknęła ona innych oocytów na drodze przemieszczania się.</li>
	<li>Przy nowym oocycie powtórz krok 6.6. Postępuj w ten sposób, aż wszystkie wymagane oocyty zostaną zainiektowane.</li>
</ol>
Uwaga: W przypadku popełnienia błędu podczas iniekcji, należy przejść do następnego oznakowanego oocyta. Nie należy tracić czasu na uszkodzone oocyty.
Uwaga: Igła może zostać zapchana podczas sesji iniekcji. W takim przypadku należy przesunąć igłę obok odłamka szkła znajdującego się w oleju na szkiełku nakrywkowym. Gdy szkło i igła znajdą się w tej samej płaszczyźnie ogniskowania, należy delikatnie uderzyć igłą w szkło (rycina 6H). Aby sprawdzić, czy igła została odblokowana, należy nacisnąć przycisk iniekcji i zweryfikować, czy z końcówki igły wypływa ciecz.
<ol start="10">
	<li>Po zainiekowaniu wszystkich oocytów ręcznie przesuń igłę w górę, wyjmując ją z oleju, i ustaw ją poza drogą wiązki światła mikroskopu. Upewnij się, że znajduje się ona w bezpiecznej pozycji, aby uniknąć uszkodzenia wzroku.</li>
</ol>
Uwaga: Jeśli między izolacją komory jajowej a iniekcją do oocytu upłynął dłuższy czas, oocyty będą trudne do iniekcji i wykażą zmiany fenotypowe związane ze stresem. Podobne problemy mogą wystąpić w przypadku nieostrożnego obchodzenia się z oocytem lub iniekcji zbyt dużych objętości (por. Ryciny 6I, J, K).
7. Projekt eksperymentu obrazowania na żywo
<ol>
	<li>Wybierz z listy pierwszy zainfekowany oocyt. Sprawdź, czy iniekcja została wykonana wewnątrz oocytu, wykonując obrazowanie jednej klatki w fluorescencji (jak na Rysunku 6G).</li>
	<li>Skonfiguruj parametry eksperymentalne, w tym: długość fali wzbudzenia, ścieżkę emisji, czas wzbudzenia, stos Z (Z-stack) oraz odstępy czasowe między pomiarami. Uwaga: Więcej informacji na ten temat znajduje się w pracy Parton R., et al. (2010) 2.</li>
	<li>Zbierz zestaw danych.</li>
</ol>
8. Reprezentatywne wyniki
In vitro syntetyzowane RNA grk znakowane Alexa-546 wstrzyknięte do komory jajowej Me31B::GFP (Rysunek 7A). RNA lokalizuje się w przednio-grzbietowej części oocytu i tworzy czapkę wokół jądra (Rysunek 7B). Więcej przykładów lokalizacji RNA znajduje się w pracy MacDougall N., et al. (2003) 11.
Oocyty w stadium średnim i późnym, wykazujące ekspresję białka znakowanego fluorescencyjnie (Tau-GFP, rysunek 7C) lub systemów znakowania RNA (grk*mCherry, rysunek 7D), mogą być obrazowane bez konieczności iniekcji.
<img alt="Układ badania genetycznego Drosophila z mikroskopem; badanie i sortowanie much do eksperymentu analizy cech." src="/files/ftp_upload/3679/3679fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1.
 
<img alt="Proces unieruchamiania muchy za pomocą mikropipety na szkiełku; obejmuje pęsetę; zestaw mikroskopowy." src="/files/ftp_upload/3679/3679fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2.
 
<img alt="Mikroskopia: proces transferu komórek, konfiguracja mikroiniekcji, kroki wysokoprecyzyjnej manipulacji komórkowej." src="/files/ftp_upload/3679/3679fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3.
 
<img alt="Obraz mikroskopowy procesu sekcji tkanki i eksperymentu izolacji komórek z oznakowanymi próbkami A-C." src="/files/ftp_upload/3679/3679fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4.
 
<img alt="Układ mikroskopowy do wzbudzania optycznego z zastosowaniem metodologii mikroiniekcji." src="/files/ftp_upload/3679/3679fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5.
 
<img alt="Sekwencja mikroiniekcji zarodków; mikroskopia w polu jasnym, analiza ekspresji genów, badanie rozwoju." src="/files/ftp_upload/3679/3679fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6.
 
<img alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej; struktury komórkowe, białka; analiza porównawcza w biologii komórki." src="/files/ftp_upload/3679/3679fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7.

<ol><li>Arias, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+and+the+development+of+biology+in+the+20th+century%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster and the development of biology in the 20th century.</a> Methods Mol. Biol. 420, 1-25 (2008).</li>
<li>Parton, R. M., Valles, A. -M., Dobbie, I. D., Davis, I. Pushing the Limits of Live Cell Imaging in Drosophila. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aParton%2C+RM+%22Live+Cell+Imaging%3A+A+Laboratory%22">Live Cell Imaging: A Laboratory</a>. Goldman, R. D., Swedlow, J. R., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 387-418 (2010).</li>
<li>Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+messages%3A+the+intracellular+localization+of+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Moving messages: the intracellular localization of mRNAs.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (5), 363-375 (2005).</li>
<li>Jansen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+Localization%3A+Message+on+the+Move%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">mRNA Localization: Message on the Move.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 247-256 (2001).</li>
<li>Van De Bor, V., Hartswood, E., Jones, C., Finnegan, D., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gurken+and+the+I+factor+retrotransposon+RNAs+share+common+localization+signals+and+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">gurken and the I factor retrotransposon RNAs share common localization signals and machinery.</a> Dev. Cell. 9 (1), 51-62 (2005).</li>
<li>Delanoue, R., Herpers, B., Soetaert, J., Davis, I., Rabouille, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Squid%2FhnRNP+helps+Dynein+switch+from+a+gurken+mRNA+transport+motor+to+an+ultrastructural+static+anchor+in+sponge+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila Squid/hnRNP helps Dynein switch from a gurken mRNA transport motor to an ultrastructural static anchor in sponge bodies.</a> Dev. Cell. 13 (4), 523-538 (2007).</li>
<li>Jaramillo, A. M., Weil, T. T., Goodhouse, J., Gavis, E. R., Schupbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+fluorescently+labeled+endogenous+gurken+mRNA+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">The dynamics of fluorescently labeled endogenous gurken mRNA in Drosophila.</a> J. Cell. Sci. 121 (Pt. 6), 887-894 (2008).</li>
<li>Forrest, K. M., Gavis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+endogenous+mRNA+reveals+a+diffusion+and+entrapment+mechanism+for+nanos+mRNA+localization+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Live imaging of endogenous mRNA reveals a diffusion and entrapment mechanism for nanos mRNA localization in Drosophila.</a> Curr. Biol. 13, 1159-1168 (2003).</li>
<li>Bertrand, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Mol. Cell. 2 (4), 437-445 (1998).</li>
<li>Spradling, A. C. Developmental genetics of oogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpradling%2C+AC+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Martinez-Arias, A. 1, Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor. 1-70 (1993).</li>
<li>MacDougall, N., Clark, A., MacDougall, E., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+gurken+%28TGFalpha%29+mRNA+localizes+as+particles+that+move+within+the+oocyte+in+two+dynein-dependent+steps%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila gurken (TGFalpha) mRNA localizes as particles that move within the oocyte in two dynein-dependent steps.</a> Dev. Cell. 4 (3), 307-319 (2003).</li>
<li>Tekotte, H., Tollervey, D., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+migrating+border+cell+cluster+in+living+Drosophila+egg+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Imaging the migrating border cell cluster in living Drosophila egg chambers.</a> Dev. Dyn. 236 (10), 2818-2824 (2007).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R., Davis, I., Gavis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+bicoid+mRNA+anchoring+highlight+conserved+mechanisms+during+the+oocyte-to-embryo+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Changes in bicoid mRNA anchoring highlight conserved mechanisms during the oocyte-to-embryo transition.</a> Curr. Biol. 18, 1055-1061 (2008).</li>
<li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nat. Protoc. 2 (10), 2467-2473 (2007).</li>
<li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Obrazowanie żywych komórek jest potężną metodą badania procesów komórkowych w czasie rzeczywistym. Poza prostą obserwacją w polu jasnym, zastosowanie znaczników fluorescencyjnych w białkach i RNA stało się podstawą wielu przełomowych odkryć. W niniejszym materiale przedstawiliśmy protokół obrazowania poszczególnych żywych oocytów, który może być wykorzystywany w połączeniu z analizami genetycznymi i biochemicznymi.
 W niniejszym protokole wyjaśniamy również, jak eksperymentalnie manipulować żywymi oocytami za pomocą iniekcji. Istnieje wiele możliwości w kwestii materiału do wstrzykiwania, w tym syntetyzowany in vitro RNA znakowany fluorescencyjnie, aby ocenić zdolność struktury drugorzędowej do kierowania lokalizacją RNA (Ball i Davis, niepublikowane) oraz przeciwciała hamujące funkcję białek 6. W przyszłych badaniach prawdopodobnie wprowadzone zostaną do żywych oocytów inne komponenty znakujące oraz machineria komórkowa, co umożliwi testowanie mechanizmów molekularnych.
 Zachowanie żywotności i zdrowia tkanki jest kluczowe podczas pracy z żywymi komórkami. W niniejszym protokole wskazujemy szereg etapów, które mogą prowadzić do stresu komory jajowej. Na przykład, mimo że olej jest lepszy do obrazowania, przedłużona hodowla w oleju może wywołać stres komory jajowej. Można to łatwo monitorować w świetle przechodzącym, badając morfologię i położenie jąder komórkowych oraz błonę oocytu, która w warunkach stresu ulega zniekształceniu i pęcherzykowaniu (porównaj Rycina 7E (brak stresu) z Rycina 7F (stres)). Komory jajowe w stadium 9 wykazują lokalizację RNA i migrację komórek brzeżnych 12 przez wiele godzin. Jednak komora jajowa w stadium 7/8 zaczyna wykazywać negatywne skutki przebywania w oleju halokarbonowym po około 40 minutach od usunięcia jajnika z samicy. Komory jajowe w późniejszych stadiach, od 11 do 14, mogą rozwijać się prawidłowo zarówno w oleju, jak i w mediach wodnych ze względu na wydzielanie skorupki jaja przez komórki pęcherzyka na tych etapach 13. Doniesiono, że dodatek insuliny do wodnego medium dla owadów może utrzymać oocyty w stadium 9 do 6 godzin 14, a germaria do 14 godzin 15. We wszystkich przypadkach należy unikać gwałtownych manipulacji komorą jajową, ponieważ powoduje to stres oocytów i zmniejsza ich żywotność. Obrazowanie mniejszej liczby komór jajowych i dbałość o delikatne obchodzenie się z każdą z nich jest najlepszym sposobem na zapewnienie optymalnej żywotności.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Narzędzia używane podczas sekcji powinny być czyste, ale nie muszą być autoklawowane. Przed rozpoczęciem przemyć narzędzia ETOH i pozostawić do wyschnięcia.</td></tr><tr><td>Pędzel z cienkim końcem (Artists Sable, okrągły, rozmiar 00 lub 0)</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td>Ważne jest zastosowanie pędzla dobrej jakości</td></tr><tr><td>Halocarbon Products Corporation, Series 95</td><td>Halocarbon Products Corp.</td><td></td><td>Europejski dystrybutor:&lt;br/&gt; Solvadis (GMBH)&lt;br/&gt; Należy pamiętać o napowietrzeniu poprzez przepuszczanie powietrza przez olej.</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe - nr 1.5, 22 x 50mm</td><td>International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm</td><td>Menzel-Glaser-22-40mm-MNJ 400-070T</td><td></td></tr><tr><td>Dumont No.5 - Dumostar</td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-20</td><td>Końcówka „Biologie” jest również dobra, ale bardziej delikatna</td></tr><tr><td>Sonda sekcyjna</td><td>Fine Science Tools</td><td>10140-01</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop sekcyjny</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Podkładka CO2</td><td><a href="http://www.flystuff.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Genesee Scientific</a></td><td>59-114 (789060 Dutscher)</td><td>Europejski dystrybutor:&lt;br/&gt; Dutscher &lt;a href="http://www.dutscherscientific.com"&gt;www.&lt;strong&gt;dutscherscientific&lt;/strong&gt;.com&lt;/a&gt;/&lt;br/&gt; Własnoręczne wykonanie podkładek do much jest również stosunkowo łatwe</td></tr><tr><td>KimCare</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>KLEW3020</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop- DeltaVision</td><td>Applied Precision</td><td>DC-CORE</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Burleigh</td><td>Burleigh PCS-5000 series, TS-5000-300</td><td>http://www.ldgi-burleigh.com/ (dawniej Exfo)</td></tr><tr><td>Aparat do iniekcji</td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>MINJ-1</td><td>Zmodyfikowany o uchwyt do końcówek Eppendorf Femptotips</td></tr><tr><td>Igła do iniekcji</td><td>Eppendorf</td><td>930000043</td><td>Różne końcówki są lepiej dopasowane do różnych zastosowań</td></tr><tr><td>Końcówki do nakładania 20&amp;mu;l</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td></td></tr><tr><td>Suche drożdże aktywne</td><td>Fleischman&amp;rsquo;s </td><td>#2192</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie pojedynczych komór jajeczkowych drosophila do obrazowania na żywo

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Obrazowanie żywych komórek jest istotną techniką stosowaną w wielu tkankach Drosophila, które służą jako modele do badania zagadnień takich jak specyfikacja osi, różnicowanie komórkowe i organogeneza 1. Prawidłowe przygotowanie próbek doświadczalnych jest kluczowym, często pomijanym etapem. Celem przygotowania jest zapewnienie istotności fizjologicznej oraz ustanowienie optymalnych warunków obrazowania. Aby zachować żywotność tkanek, krytyczne jest unikanie odwodnienia, hipoksji, przegrzania lub degradacji medium 2.
 Komora jajowa Drosophila jest dobrze ugruntowanym systemem do badania zagadnień związanych, lecz nie ograniczonych do, wzorowania ciała, lokalizacji mRNA oraz organizacji cytoszkieletu 3,4. W przypadku komór jajowych we wczesnych i środkowych stadiach rozwoju, montaż w oleju halowęglowym sprzyja przeżywalności, ponieważ umożliwia swobodną dyfuzję tlenu, zapobiega odwodnieniu i hipoksji oraz posiada doskonałe właściwości optyczne do mikroskopii. Obrazowanie białek fluorescencyjnych jest możliwe dzięki wprowadzeniu transgenów do komory jajowej lub fizycznemu wstrzyknięciu znakowanego RNA, białek lub przeciwciał 5-7. Na przykład dodanie konstruktów MS2 do genomu zwierząt umożliwia obserwację mRNA w oocycie w czasie rzeczywistym 8. Konstrukty te pozwalają na znakowanie mRNA in vivo poprzez wykorzystanie oddziaływania pętli spinki RNA bakteriofaga MS2 z jego białkiem kapsydu 9.
 W niniejszym materiale przedstawiamy protokół ekstrakcji jajników oraz izolacji pojedynczych ovarioli i komór jajowych u samicy Drosophila. Szczegółowy opis oogenezy u Drosophila można znaleźć w pracy Allana C. Spradlinga (1993, przedruk 2009) 10.

Komora jajowa Drosophila stanowi doskonały model do badania mechanizmów lokalizacji mRNA. Aby uchwycić dynamiczne zdarzenia leżące u podstaw procesów lokalizacji, wymagane jest szybkie obrazowanie tkanek żywych w wysokiej rozdzielczości. W niniejszym materiale przedstawiamy protokół preparatyki i obrazowania żywych próbek przy minimalnej ingerencji w ich strukturę.

Przygotowanie pojedynczych komór jajeczkowych Drosophila do obrazowania na żywo

Obrazowanie żywych komórek jest ważną techniką stosowaną w wielu tkankach Drosophila wykorzystywanych jako modele do badania zagadnień takich jak specyfikacja osi, ...

Celem poniższego eksperymentu jest rejestracja procesów dynamicznych w żywych miejscach U (U sites) u drozofili. Osiąga się to poprzez wyizolowanie najpierw nienaruszonych jajników z dobrze odżywionych, dwudniowych samic much. W drugim kroku z jajników wyekstrahowane są poszczególne owulariach w celu obrazowania komór jajeczkowych.Następnie, jeśli wykazują one ekspresję odpowiedniego białka fluorescencyjnego, poszczególne komory jajowe mogą być obrazowane bezpośrednio lub poddane dalszym manipulacjom, takim jak mikroiniekcja markerów fluorescencyjnych przed obrazowaniem. Ostatecznie, poprzez analizę sekwencji filmowych, można ujawnić dynamiczne interakcje komponentów wewnątrzkomórkowych. Metoda ta pomogła nam odpowiedzieć na niektóre kluczowe pytania w dziedzinie transportu RNA i translacji lokalnej.Na przykład, w jaki sposób w żywym organizmie regulowana jest w czasie i przestrzeni ekspresja białek ustalających plan budowy ciała? Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie będą napotykać trudności, ponieważ wymaga ona znacznej szybkości i zręczności. Lepsze wyniki zostaną osiągnięte dzięki praktyce.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ manipulacje w komorach jajowych są trudne do przekazania w tekście, a wymagają one cierpliwości, wiedzy technicznej i pewności w ruchach. Rozpocznij procedurę od naniesienia małej kropli oleju halokarbonowego na szkiełko nakrywkę i odstaw je na bok. Następnie znieczul przygotowane muchy dwutlenkiem węgla.Używając ostrych pęsety z cienkimi końcami, chwyć tuczoną samicę muchy w przedniej części odwłoka. Nie chwytaj w środkowej części odwłoka. Trzymaj samicę mniej więcej dwa do trzech centymetrów nad przygotowanym szkiełkiem nakrywką.Używając drugiej pary pęsety, usuń tkanki z najdalej położonej części tylnej samicy. Zazwyczaj obejmie to tkanki jelitowe; użyj do tego czystej pęsety. Delikatnie masuj odwłok od końca przedniego w stronę tylnej, podobnie jak przy wyciskaniu pasty z tubki.Jajniki wyglądają jak duże, nieprzezroczyste struktury i będą przylegać do końcówki pęsety. Zbierz jajniki, dotykając nimi warstwy oleju węglowego na szkiełku. Następnie powtórz ten proces, aż do zebrania od czterech do sześciu jajników.Przed izolacją narządów głowowych należy dostosować źródło światła w mikroskopie tak, aby oświetlenie padało na preparat pod niewielkim kątem, tworząc kontrastujące cienie na tkankach. Podczas sekcji much bardzo ważne jest użycie odpowiednich narzędzi.Używany przez nas wskaźnik nie jest zbyt ostry, aby nie uszkodzić tkanki, lecz dość tępy, co pozwala na uchwycenie używanych pęset. Podobnie, nie są one zbyt ostre, by nie uszkodzić tkanek, ale na tyle precyzyjne, aby umożliwić manipulację bez wyginania narzędzia. Bardzo ważne jest również zachowanie czystości narzędzi, dlatego regularnie czyścimy je w trakcie procedury, używając zamkniętych kleszczyków.Oddziel oba jajniki, usuwając tkankę łączną na ich tylnym końcu. W tylnej części znajdują się najbardziej dojrzałe komory z jajeczkami. Ułóż jajnik poziomo tak, aby najmłodsze komory z jajeczkami znajdowały się po stronie ręki dominującej.Następnie delikatnie uchwyć tylny koniec za pozostałą tkankę łączną i użyj sondy sekcyjnej lub igły wolframowej, aby wyizolować poszczególne owulariów; komory jajowe od stadium Jamar do stadium 10 oddzielą się od siebie, natomiast starsze komory jajowe pozostaną przytwierdzone do jajnika. Za pomocą sondy ostrożnie przesuń od 15 do 25 oddzielonych owulariów do centrum kropli oleju. Jeśli konieczne jest wypreparowanie więcej niż jednego jajnika, wybierz go z innej muchy.Usunąć nadmiar tkanki jajnika i pracować szybko, ponieważ cyty zaczną wykazywać zmiany fenotypowe wynikające ze stresu. Po 40 minutach od wycięcia z jajnika, usunąć nadmiar tkanki jajnika z oleju. Używając czystych narzędzi do iniekcji cytów w stadium średnim, zorientować aeriale prostopadle do długiej osi szkiełka nakrywki. Aby wyizolować komory jajowe w stadium późnym.W przypadku uchwycenia tylnej części jajnika, zgodnie z wcześniejszym opisem, wymagana jest inna metoda. Wprowadź sondę sekcyjną do tylnego końca jajnika w pobliżu pęsety. Aby uniknąć przebicia komór jajowych, wprowadź sondę pomiędzy komory jajowe w późnym stadium rozwoju.Przesuń igłę sekcyjną przez jajnik, aż wyjdzie ona w obrębie komór jajowych na wczesnym etapie rozwoju. Przy prawidłowym wykonaniu zabiegu sonda usunie tkankę łączną utrzymującą owulariów oraz komory jajowe na późnym etapie rozwoju w miejscu. Powtarzaj ten krok, aż owulariów zostaną rozłożone na szkiełku nakrywce.Krok ten jest zakończony, gdy komory jajowe nie są już ułożone jedna na drugiej. Za pomocą sondy do sekcji oddziel późne stadia komór jajowych, aby ułatwić obrazowanie i ustawienie stadium 14. Do chwycenia wyrostków grzbietowych komór szyjnych użyj pęsety.Przygotuj roztwory do wstrzyknięcia, krótko wirując je przy wysokiej prędkości. Pozwoli to na odwirowanie wszelkich osadów stałych, które mogłyby zablokować igłę wstrzykującą. Następnie pobierz roztwór do igły za pomocą końcówki do ładowania i ostrożnie przymocuj napełnioną igłę do wtryskiwacza.Teraz umieść mały kawałek szkła obok próbek i zamocuj preparat na stoliku mikroskopu. Szkło będzie służyć jako ścianka do przerywania lub rozdzielania. Wyjmij igłę.Przygotuj mikroskop oraz aparat do mikroiniekcji do przeprowadzenia eksperymentu. Należy uważać, aby nie złamać końcówki igły. Jeśli to możliwe, użyj zautomatyzowanego stolika z funkcją zapamiętywania punktów, aby oznaczyć wszystkie cyty na etapie ósmym i dziewiątym przeznaczonych do iniekcji.Teraz należy opuścić igłę wstrzykującą, aż dotknie ona oleju. Wybierz pierwszy punkt z listy zaznaczonych punktów i ustaw ostrość na komórce. Ręcznie opuść igłę, aż znajdzie się ona w tej samej płaszczyźnie ostrości co komórka.Używając sterowników manipulatora, przesuń końcówkę igły wstrzykującej, aż znajdzie się ona w obszarze U. Szybki ruch wbijania jest często skuteczniejszy niż ruch powolny. Po wprowadzeniu igły, wstrzyknij niewielką objętość z igły i dokonaj wizualnej oceny efektów.Wymagane jest powtórzenie czynności. Jeśli iniekcja przebiegnie pomyślnie, cytoplazma wewnątrz cyty zostanie przemieszczona. Precyzyjna ilość wstrzykniętego płynu jest trudna do określenia.Aby zwiększyć objętość iniekcji, należy dostosować ciśnienie lub czas trwania impulsu wstrzykiwania. Można złamać końcówkę igły, aby nieznacznie powiększyć jej otwór, lub po prostu zastosować kilka impulsów iniekcyjnych przed wybraniem kolejnego mark.Cyte. Unieś igłę iniekcyjną w oleju na tyle wysoko, aby nie uderzała ona o inne cytes.Wielokrotne nakłuwanie lub zbyt długie pozostawianie igły wewnątrz cyty powoduje poważne uszkodzenie komory jajeczka. Należy zatem działać szybko. Iniekcja powinna trwać mniej niż 10 sekund.W przypadku popełnienia błędu, przejdź do kolejnego punktu oznaczenia. Nie marnuj czasu na uszkodzone miejsca. Gdy igła zostanie zapchana, przenieś ją do rozbitego kawałka szkła.Gdy szkło i igła znajdą się w tej samej płaszczyźnie ogniskowania, ostrożnie wbij igłę w szkło. Sprawdź, czy igła nie jest zapchana, naciskając przycisk wtrysku i obserwując, czy z końcówki igły wypływa płyn. Po wstrzyknięciu we wszystkie miejsca US ręcznie wyjmij igłę z oleju i odsuń ją z toru wiązki światła mikroskopu.Upewnij się, że próbka jest ustawiona w bezpiecznej orientacji, aby uniknąć uszkodzenia oczu, a światła są wyłączone. W celu usprawnienia obrazowania fluorescencyjnego kluczowe jest zachowanie szybkości pracy. Jeśli od momentu izolacji komór jajowych do iniekcji cytów upłynie godzina lub więcej, cyty będą trudne do iniekcji i wykażą zmiany fenotypowe związane ze stresem.Podobne problemy mogą wystąpić w przypadku gwałtownego obchodzenia się z cyte lub wstrzyknięcia nadmiarowych objętości. Komory jajowe wykazujące ekspresję trenchgenicznych białek fluorescencyjnych mogą być obrazowane bez konieczności iniekcji. Markowanie endogennego RNA metodą MS two można obrazować z dobrymi wynikami, stosując procedury izolacji tkanek z wykorzystaniem pełnego procesu syntezy in vitro.Do komory jajowej ME 31 BGFP wstrzyknięto RNA Alexa, 5 46 kin; RNA zlokalizowało się w przednio-grzbietnej części cyty i utworzyło czapkę wokół jądra. Po opanowaniu ta technika może zostać przeprowadzona w około 10 minut, od momentu sekcji do rozpoczęcia obrazowania. Podczas wykonywania tej procedury należy dbać o tkankę, pracując szybko, ale uważnie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak rejestrować dynamiczne procesy w żywych cytach Drosophila.

preparing-individual-drosophila-egg-chambers-for-live-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przygotowywanie pojedynczych komór jajowych Drosophila do obrazowania na żywo

Przedstawiono prostą, niedrogą i skuteczną metodę przygotowania embrionów Drosophila do analizy za pomocą obrazowania na żywo. Nasz protokół zapewnia wilgotność i wymianę gazową oraz nie powoduje kompresji embrionu Drosophila. Metoda ta jest odpowiednia do obrazowania na żywo embrionów Drosophila w oparciu o GFP z wykorzystaniem stereomikroskopu lub pionowego mikroskopu złożonego.

Przygotowanie zarodków Drosophila do obrazowania na żywo z wykorzystaniem protokołu wiszącej kropli

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Niniejszy protokół opisuje trzy preparaty Drosophila: 1) wypreparowanie mózgu dorosłego osobnika, 2) wypreparowanie siatkówki dorosłego osobnika oraz 3) wypreparowanie kompleksów rozwijającego się krążka oka i mózgu. Szczególny nacisk położono na specjalne techniki przygotowania i warunki obrazowania żywych tkanek, choć wszystkie preparaty mogą być wykorzystane do immunohistochemii tkanek utrwalonych.

Przygotowanie rozwijających się oraz dorosłych mózgów i siatkówek Drosophila do obrazowania na żywo

Opisano protokół obrazowania na żywo białek lub struktur autofluorescencyjnych oznaczonych GFP w pojedynczych oocytach Drosophila.

Obrazowanie na żywo białek znakowanych GFP w oocytach Drosophila

Metoda obrazowania pionowego opisana w tym protokole pozwala na szczegółową wizualizację biegunów rozwijającego się jaja Drosophila melanogaster.  Ten widok od początku zapewnia nową perspektywę na rozmieszczenie i morfologię wielu typów komórek w nabłonku pęcherzykowym.

Obrazowanie pionowe komór jajowych Drosophila

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji i jednoczesnego obrazowania wielu zarodków Drosophila podczas rozwoju embrionalnego za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości na płytce.

Przygotowanie zarodków Drosophila i mikroiniekcja do mikroskopii żywych komórek wykonana przy użyciu automatycznego analizatora o wysokiej zawartości

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych jest najcenniejszym narzędziem w biologii rozwoju. Głównym problemem w badaniach porównawczych jest wariancja otoczenia. Nasz protokół opisuje eksperymentalne ramy do jednoczesnego obrazowania na żywo wielu próbek i dlatego aktywnie rozwiązuje ten problem.

Jednoczesne obrazowanie na żywo wielu zarodków owadów w mikroskopach fluorescencyjnych z arkuszami świetlnymi w komorze na próbki

Celem tego protokołu jest wykorzystanie obrazowania na żywo do wizualizacji wpływu uszkodzeń oksydacyjnych na lokalizację i dynamikę struktur subkomórkowych w jajnikach Drosophila.

Wizualizacja wpływu uszkodzeń oksydacyjnych na komory jajowe Drosophila za pomocą obrazowania na żywo

U Drosophila, jądro oocytu ulega migracji zależnej od mikrotubul podczas oogenezy. W tym miejscu opisujemy protokół, który został opracowany w celu śledzenia migracji poprzez wykonywanie obrazowania na żywo w komorach jajowych ex vivo. Nasza procedura utrzymuje komory jajowe przy życiu przez 12 godzin, aby uzyskać wielopozycyjne filmy poklatkowe 3D za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem.

Migracja jądrowa w oocycie Drosophila

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół do wykonywania na żywo obrazowania asymetrycznego podziału komórek macierzystych linii zarodkowej (GSC) w niszy jajnikowej Drosophila. Używamy linii transgenicznej, która wszechobecnie ulega ekspresji fuzji białka zielonej fluorescencji (GFP) białka spektrosomu Par-1.

Rozszerzone obrazowanie na żywo nisz komórek macierzystych linii zarodkowej Drosophila melanogaster

Naucz się przygotowywać komórki jajowe Drosophila do obrazowania na żywo w celu badania lokalizacji mRNA. Ta metoda umożliwia rejestrację dynamicznych procesów w żywych tkankach z wysoką rozdzielczością.

Przygotowanie pojedynczych komór jajeczkowych Drosophila do obrazowania na żywo

Przeglądaj więcej filmów