Name: Hybrydyzacja in situ gruczołów ślinowych, jajników i zarodków komarów-wektorów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Poznaj metodę hybrydyzacji in situ do badania ekspresji genów w tkankach komarów i zarodkach. Technika ta pozwala wizualizować lokalizację transkryptów mRNA, wspierając badania genomiki funkcjonalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Marice Walters za pomoc w opracowaniu metod hybrydyzacji in situ dla tkanek miękkich oraz Yurymu Goltsevowi za omówienie protokołów hybrydyzacji in situ zarodków Anopheles gambiae, które zostały następnie zaadaptowane i zmodyfikowane w celu opracowania opisanego tutaj protokołu hybrydyzacji in situ zarodków Aedes i Culex. Dziękujemy również Adamowi Paré oraz Davidowi Kosmanowi za pomocne rekomendacje. Dziękujemy Osvaldo Marinotti za dyskusję naukową i redakcję tekstu protokołu.

<ol><li>Juhn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+mapping+of+gene+expression+in+the+salivary+glands+of+the+dengue+vector+mosquito%2C+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit.+Vectors%22%5BJournal%5D)">Spatial mapping of gene expression in the salivary glands of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti.</a> Parasit. Vectors. 4, 1(2011).</li>
<li>Coleman, J., Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+midgut+and+salivary+glands+from+Ae.+aegypti+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of midgut and salivary glands from Ae. aegypti mosquitoes.</a> J. Vis. Exp. (5), e228(2007).</li>
<li>Benedict, M. Q. Dissecting Plasmodium-infected Mosquitoes: Salivary Glands, Chapter. 5.4.2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBenedict%2C+MQ+%22Methods+in+Anopheles+Research%22">Methods in Anopheles Research</a>. , Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). (2007).</li>
<li>Sappington, T. W., Brown, M. R., Raikhel, A. S. Culture and analysis of insect ovaries, Chapter. 42.3. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSappington%2C+TW+%22The+Molecular+Biology+of+Insect+Disease+Vectors%3A+A+methods+manual%22">The Molecular Biology of Insect Disease Vectors: A methods manual</a>. , Chapman & Hall. London. (1997).</li>
<li>Goltsev, Y., Hsiong, W., Lanzaro, G., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+combinations+of+gap+repressors+for+common+stripes+in+Anopheles+and+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Different combinations of gap repressors for common stripes in Anopheles and Drosophila embryos.</a> Dev. Biol. 275, 435-446 (2004).</li>
<li>Benedict, M. Q. Anopheles Embryo Fixation, Chapter. 3.7. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBenedict%2C+MQ+%22Methods+in+Anopheles+Research.+Malaria+Research+and+Reference+Reagent+Resource+Center+%28MR4%29%22">Methods in Anopheles Research. Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4)</a>. , (2007).</li>
<li>Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((oskar+gene+expression+in+the+vector+mosquitoes%2C+Anopheles+gambiae+and+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">oskar gene expression in the vector mosquitoes, Anopheles gambiae and Aedes aegypti.</a> Insect Mol. Biol. 15, 363-372 (2006).</li>
<li>Juhn, J., Marinotti, O., Calvo, E., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+structure+and+expression+of+nanos+%28nos%29+and+oskar+%28osk%29+orthologues+of+the+vector+mosquito%2C+Culex+quinquefasciatus%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene structure and expression of nanos (nos) and oskar (osk) orthologues of the vector mosquito, Culex quinquefasciatus.</a> Insect Mol. Biol. 17, 545-552 (2008).</li>
<li>Raminani, L. N., Cupp, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Embryology+of+Aedes+aegypti+%28L.%29+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Insect+Morphol.+%26+Embryol%22%5BJournal%5D)">Early Embryology of Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae).</a> Int. J. Insect Morphol. & Embryol. 4, 517-528 (1975).</li>
<li>Raminani, L. N., Cupp, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryology+of+Aedes+aegypti+%28L.%29+%28Diptera%3A+Culicidae%29%3A+Organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Insect+morphol.+%26+Embryol%22%5BJournal%5D)">Embryology of Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae): Organogenesis.</a> Int. J. Insect morphol. & Embryol. 7, 273-296 (1978).</li>
<li>Ivanova-Kazas, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+development+of+Anopheles+maculipennis+Mg%5BTitle%5D)+AND+%22Izv.+Akad.+Nauk+SSSR+ser.+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic development of Anopheles maculipennis Mg.</a> Izv. Akad. Nauk SSSR ser. Biol. 2, 140-170 (1949).</li>
<li>Goltsev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+evolutionary+basis+for+drought+tolerance+of+the+Anopheles+gambiae+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental and evolutionary basis for drought tolerance of the Anopheles gambiae embryo.</a> Dev. Biol. 330, 462-470 (2009).</li>
<li>Papatsenko, D., Levine, M., Goltsev, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clusters+of+temporal+discordances+reveal+distinct+embryonic+patterning+mechanisms+in+Drosophila+and+Anopheles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Clusters of temporal discordances reveal distinct embryonic patterning mechanisms in Drosophila and Anopheles.</a> PLoS Biol. 9, e1000584(2011).</li>
<li>Davis, C. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+larval+embryogenesis+in+the+mosquito+Culex+fatigans+Wiedemann+%28Diptera%3A+Culicidae%29+and+the+sheep-fly+Lucilla+seriata+Meigen+%28Diptera%3A+Calliphoridae%29+I.+Description+of+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Aust.+J.+Zool%22%5BJournal%5D)">A comparative study of larval embryogenesis in the mosquito Culex fatigans Wiedemann (Diptera: Culicidae) and the sheep-fly Lucilla seriata Meigen (Diptera: Calliphoridae) I. Description of embryonic development.</a> Aust. J. Zool. 15, 547-579 (1967).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiony tutaj protokół hybrydyzacji in situ i barwienia kolorymetrycznego dla całych tkanek i embrionów komarów jest użyteczną techniką lokalizacji transkryptów w konkretnych organach i typach komórek. Procedury te stanowią udoskonalenie naszych wcześniej opisanych metod, zarówno pod kątem usprawnienia rozbudowanych etapów płukania, jak i dostarczenia dodatkowych szczegółów technicznych oraz źródeł odczynników.
 W naszym doświadczeniu kolorymetryczna detekcja sygnałów hybrydyzacji charakteryzuje się wyższą czułością i wyraźniejszym sygnałem hybrydyzacji w porównaniu do metod detekcji opartych na fluorescencji. Ponadto detekcja kolorymetryczna pozwala uniknąć problemów związanych z rozróżnianiem sygnałów w embrionach, które wykazują naturalną autofluorescencję. Ograniczenia w wykrywaniu sygnałów hybrydyzacji pojawiają się w przypadku celowania w rzadkie transkrypty oraz przy widocznym barwieniu tła. Stwierdzono, że zwiększenie temperatury hybrydyzacji do 65 °C redukuje tło sygnałów hybrydyzacji, jednak nie jest to zalecana alternatywa dla projektowania unikalnych sond RNA specyficznych dla danego celu.
Niniejszy protokół był stosowany do przeprowadzania hybrydyzacji in situ w całych gruczołach ślinowych Aedes aegypti oraz w jajnikach i embrionach Anopheles gambiae, Anopheles stephensi, Ae. aegypti oraz Culex quinquefasciatus. Metoda ta ma zastosowanie również do innych tkanek komarów, a prawdopodobnie także do tkanek innych owadów. Dodatkowo opracowaliśmy po raz pierwszy porównawcze wytyczne dotyczące etapowania rozwoju embrionalnego u trzech gatunków komarów wektorowych: Ae. aegypti, An. gambiae i Cx. fatigans. Opisano obserwacje dla konkretnych szczepów tych trzech gatunków, w określonych warunkach hodowli. Należy zauważyć, że przebieg czasowy rozwoju może się różnić w zależności od szczepu gatunku komara oraz warunków hodowlanych. Hybrydyzacje in situ uzupełniają prowadzone obecnie prace nad analizą transkryptomów komarów i innych stawonogów i mogą dostarczyć lepszego obrazu regulacji ekspresji genów w tych organizmach.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Ambion</td><td>AM9261</td><td> </td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl </td><td>Ambion</td><td>AM9855G</td><td>pH 8,0</td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>Ambion</td><td>AM9625</td><td> </td></tr><tr><td>20X SSC</td><td>Ambion</td><td>AM9763</td><td> </td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówki 1,5 ml</td><td>Ambion</td><td>AM12400</td><td>Mniej nieprzezroczyste niż standardowe probówki; ułatwia wizualizację próbek</td></tr><tr><td>Dejonizowany formamid</td><td>Ambion</td><td>AM9342</td><td>Przechowywać w 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Woda z DEPC</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td> </td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td> </td></tr><tr><td>5,25% podchloryn sodu</td><td>Austin&amp;#8217;s</td><td></td><td>Marka A-1</td></tr><tr><td>T3 RNA Polimeraza-Plus</td><td>Ambion</td><td>AM2733</td><td>Przechowywać w -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>T7 RNA Polimeraza</td><td>Ambion</td><td>AM2082</td><td>Przechowywać w -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>95% etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC61511-0040</td><td> </td></tr><tr><td>Jednorazowe polietylenowe pipety transferowe Fisherbrand</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td> </td></tr><tr><td>37% formaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>F79-500</td><td> </td></tr><tr><td>Metanol klasy HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-1</td><td> </td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Fisher Scientific</td><td>M87-500</td><td> </td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe do mikroskopu</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>n-Heptan</td><td>Fisher Scientific</td><td>H350-1</td><td> </td></tr><tr><td>p-ksylen</td><td>Fisher Scientific</td><td>O5082-500</td><td> </td></tr><tr><td>9-dołkowa płytka do nakrapiania Pyrex</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-748B</td><td>100 x 85 mm</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC32730-0025</td><td> </td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS255-1</td><td> </td></tr><tr><td>Kapturki do mikroskopu Superfrost/Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>25 x 75 x 1,0 mm</td></tr><tr><td>Taśma Davlyn Red Clear-liner Toupee</td><td>Hair Direct</td><td>RED-75R12</td><td>Materiał bazowy Poly/Skin, rolka taśmy 0,75 cala x 12 jardów</td></tr><tr><td>Zestaw do klonowania TOPOTA do sekwencjonowania z chemicznie kompetentnymi &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; One Shot Top10</td><td>Invitrogen</td><td>K457501 K457540</td><td>20 reakcji &lt;br/&gt; 40 reakcji</td></tr><tr><td>Sonikowane DNA z plemników łososia</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td>Przechowywać w -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Fragmenty Fab anty-digoksigenina-AP</td><td>Roche Applied Science</td><td>1093274</td><td>Przechowywać w 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Mieszanina do znakowania RNA DIG</td><td>Roche Applied Science</td><td>1277073</td><td>Przechowywać w -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Roztwór zapasowy NBT/BCIP</td><td>Roche Applied Science</td><td>1681451</td><td>Przechowywać w 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący Western</td><td>Roche Applied Science</td><td>11921673001</td><td>Przechowywać w 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Siatka poliestrowa Saatilene Hitech (330.130)</td><td>Saati Print</td><td>330.34 UO PW</td><td>330 nici/cal, średnica nici 34 mikrony, kolor pomarańczowy</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G6279-1</td><td>70% w PBT</td></tr><tr><td>Sód heparyny</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td> </td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379-500</td><td> </td></tr><tr><td>37% formaldehyd</td><td>Ted Pella</td><td>18508</td><td>Alikwoty 10 ml w bursztynowych ampułkach</td></tr><tr><td>Pojemniki Solo Paper 16 oz. z pokrywkami</td><td>The Paper Company</td><td>SOLOKH16AJ8000</td><td> </td></tr><tr><td>Borokrzemianowa fiolka scyntylacyjna z oddzielną zakrętką</td><td>VWR International</td><td>66022-128</td><td>Opakowanie 500 sztuk po 20 ml</td></tr><tr><td>Komórkowy materiał amortyzujący Sealed Air Bubble wrap</td><td>VWR International</td><td>500018-081</td><td>Rolka 10 stóp, grubość 0,188 cala</td></tr><tr><td>Surowica kurzyca</td><td></td><td></td><td>Krew pełną pobrano z żyły skrzydłowej lub poprzez punkcję serca młodego kurczaka. Krew inkubowano w 37 &amp;deg;C przez 1 h aż do koagulacji, a następnie umieszczono w lodzie na 30 min. Zebrano surowicę i odwirowano przy 3000 x g przez 10 min. Otrzymany nadosad (klarowna surowica) został zebrany i przechowywany w -20 &amp;deg;C do momentu użycia.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 4.&lt;/strong&gt; Wykaz specyficznych odczynników i sprzętu do hybrydyzacji &lt;em&gt;in situ&lt;/em&gt;.</td></tr></tbody></table>

hybrydyzacja in situ gruczołów ślinowych, jajników i embrionów komarów wektorowych

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Komary są wektorami dla różnorodnej grupy patogenów, w tym arbrowirusów, pierwotniaków i nicieni. Badanie transkryptów oraz regulatorów genów wykazujących ekspresję w tkankach, w których dochodzi do interakcji między gospodarzem (komarem) a patogenem, a także w narządach zaangażowanych w rozród, jest niezwykle istotne dla opracowania strategii ograniczania transmisji chorób przenoszonych przez komary oraz zaburzania rozwoju jaj. W celu zbadania i walidacji czasowej oraz tkankowo specyficznej regulacji ekspresji genów zastosowano szereg narzędzi. W niniejszym materiale opisujemy protokoły opracowane w celu uzyskania informacji przestrzennych, co pozwala lepiej zrozumieć, gdzie ekspresjonowane są określone geny i gdzie akumulują się ich produkty. Opisany protokół został wykorzystany do walidacji ekspresji oraz określenia wzorców akumulacji transkryptów w tkankach związanych z transmisją patogenów przenoszonych przez komary, takich jak gruczoły ślinowe samic, a także w przedziałach subkomórkowych jajników i embrionów, co odnosi się do rozrodu i rozwoju komarów.
 Poniższe procedury stanowią zoptymalizowaną metodologię, która zwiększa wydajność poszczególnych etapów protokołu bez utraty specyficznych sygnałów hybrydyzacji z celem. Wytyczne dotyczące przygotowania sond RNA, preparatyki tkanek miękkich oraz ogólną procedurę fiksacji i hybrydyzacji opisano w Części A, natomiast kroki specyficzne dla zbierania, fiksacji, prehybrydyzacji i hybrydyzacji embrionów komarów szczegółowo omówiono w Części B.

Analizy czasowej i przestrzennej ekspresji genów odgrywają kluczową rolę w genomice funkcjonalnej. Hybrydyzacja in situ całego preparatu jest przydatna do określania lokalizacji transkryptów w obrębie tkanek i przedziałów subkomórkowych. W niniejszym materiale przedstawiamy protokół hybrydyzacji in situ z modyfikacjami dla konkretnych tkanek docelowych u komarów.

Hybrydyzacja in situ gruczołów ślinowych, jajników i embrionów komarów wektorowych

Komary są wektorami dla szerokiej gamy patogenów, w tym arbrowirusów, pierwotniaków oraz nicieni. Badanie transkryptów i genów...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest przeprowadzenie hybrydyzacji in situ w celu określenia wzorców lokalizacji i akumulacji specyficznych transkryptów w tkankach i embrionach komarów. Osiąga się to poprzez uprzednie utrwalenie tkanek lub embrionów komarów, aby ultrastruktura tkanki oraz docelowe mRNA zostały zachowane i były dostępne do hybrydyzacji z antysensownymi sondami RNA. Następnie antysensowne sondy RNA są hybrydyzowane z docelowymi transkryptami w utrwalonych tkankach lub embrionach.Następnie przeprowadzono metody barwienia przeciwciałami kolorymetrycznymi w celu wykrycia wzorców lokalizacji i akumulacji docelowego mRNA. Uzyskano wyniki ukazujące przestrzenne wzorce akumulacji RNA w oparciu o hybrydyzację w C two oraz metody detekcji kolorymetrycznej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny genomiki funkcjonalnej, takie jak określenie, kiedy i gdzie produkty genów akumulują się w organizmie komara.Procedura ta pozwala również na uzyskanie informacji o lokalizacji przestrzennej, aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób regulowana jest ekspresja genów w procesach biologicznych, takich jak rozwój rozrodczy oraz interakcje komarów z patogenami. Aby przygotować tkanki komara do hybrydyzacji z sondami RNA znakowanymi digoksigeniną, należy rozpocząć od wypreparowania jajników i gruczołów ślinowych. Następnie tkankę należy utrwalić i w razie potrzeby potraktować proteinazą K.Po postutrwaleniu tkanek należy poddać je równoważeniu w 1 mL mieszaniny roztworu hybrydyzacyjnego PBT lub HIB PBT w stosunku 1:1 przez 30 minut przy mieszaniu; po tym czasie należy odczekać, aż tkanka opadnie, a następnie odlać jak najwięcej HIB PBT. Następnie do każdej probówki z próbką należy dodać 1 mL HIB. Probówkę z próbką należy owinąć szczelnym opakowaniem ochronnym przed powietrzem, np. folią bąbelkową, i umieścić w butelce do hybrydyzacji.Zamknij butelkę zakrętką do hybrydyzacji i inkubuj w temperaturze 55 °C przez 30 minut w rotacji. Po wyjęciu butelki z inkubatora i odczekaniu, aż tkanka opadnie, ostrożnie odlej bufor do prehybrydyzacji, pozostawiając w probówce 50 µL roztworu, aby zapobiec utracie próbki. Następnie dodaj 50 µL podgrzanego buforu do tej samej próbki i umieść ją w bloku grzejnym ustawionym na 55 °C; wcześniej przygotowaną sondę RNA zdenaturuj w temperaturze 85 °C przez pięć minut.Następnie natychmiast umieścić próbkę w lodzie na pięć minut. Dalej, nanieść pipetą sondę RNA do probówki z próbką. Sonda RNA będzie unosić się na powierzchni roztworu HI.Wymieszaj zawartość, delikatnie opukując probówkę. Próbki inkubuj ostrożnie w stałym statywie do mikrowirówki w piecu do hybrydyzacji w temperaturze 55 °C przez 16 do 24 godzin. Następnie przeprowadź obróbkę RNA oraz barwienie przeciwciałami zgodnie z opisem w protokole pisemnym.Przymocuj próbki tkanek, przenosząc je najpierw za pomocą końcówki do pipety 200 µL do poszczególnych okrągłych dołków płytki do testów Pyrex. Usuń jak najwięcej PBT i pokryj próbkę 70% glycerol w wodzie. Pozostaw próbkę w temperaturze 4 °C przez noc, aby glycerol mógł w niej spenetrować.Aby przygotować preparaty do mikroskopu, należy rozpocząć od oczyszczenia powierzchni szkiełka za pomocą chusteczek Kim wipes. Następnie, używając pędzla artystycznego, naklej dwa paski przezroczystej taśmy równolegle do siebie, tak aby utworzyły wąski kanał. Pobieraj próbki jedna po drugiej i układaj je wzdłuż kanału, dbając o to, aby każda próbka była ustawiona w tej samej orientacji względem osi przednio-tylnej i grzbietowo-brzusznej.Po ułożeniu każdej próbki, należy użyć tamponu z chusteczki Kim wipe, aby wchłonąć nadmiar roztworu glicerolu otaczającego tkanki. Usunięcie nadmiaru glicerolu jest istotne, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza podczas zabezpieczania zamontowanych próbek na szkiełku pod szkiełkiem nakrywką; ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe nad kanałem zawierającym wyrównane próbki. Używając bezbarwnego laku do paznokci, przymocuj szkiełko nakrywkowe półtrwale do szkiełka przedmiotowego, nakładając lakier punktowo na narożniki. Za pomocą pipety 200 µL powoli nanieś 70% glicerol na jeden koniec kanału, aby na stałe wypełnić kanał oraz obszar pod szkiełkiem nakrywkowym.Uszczelnij zamocowane preparaty, nakładając lakier do paznokci wzdłuż wszystkich czterech boków szkiełka nakrywkowego. Pozostaw lakier do całkowitego wyschnięcia przed obrazowaniem próbek. Po zebraniu embrionów z klatki zawierającej 300 zapłodnionych dorosłych samic komarów i doprowadzeniu ich do pożądanych stadiów rozwoju, przenieś je z pojemnika zbiorczego do rurki chwytnej z siatką tylene dla osiemdziesięciu embrionów.Umieść probówkę zbiorczą w zlewce wypełnionej wystarczającą ilością wody destylowanej, tak aby probówka zbiorcza była wypełniona w połowie. Za pomocą pędzla artystycznego oddziel zarodki od siatki tylene i przenieś je do wypełnionej wodą probówki zbiorczej. W przypadku dużej liczby zarodków oddziel siatkę tylene od pojemnika zbiorczego i ostrożnie złóż siatkę w kształt lejka, trzymając lejek z siatki jedną ręką.Drugą ręką rozpyl wodę wzdłuż ścianek lejka, aby wypłukać embriony do probówki zbierającej. Metodę tę można zastosować w przypadku embrionów z anomaliami, ponieważ nie posiadają one substancji adhezyjnej występującej na powierzchni zdrowych embrionów, która umożliwia przyleganie jaj do podłoży o odpowiedniej pozycji. Przygotuj 40 milliliters roztworu dekoracyjnego i wlej go do 100 millimeter szalki Petriego.Do zlewki o pojemności 100 ml należy wlać 50 ml wody destylowanej i odstawić ją na bok. Następnie zarodki należy umieścić w czynce Petri z roztworem do dekoracji. Za pomocą jednorazowej polietylenowej pipety transferowej należy przemyć zarodki, jednocześnie obracając probówkę z zarodkami, aby pozostały one zanurzone i wymieszane w roztworze do dekoracji.Dekoryzacja jest jednym z najczulszych etapów protokołu, a zbyt długi czas traktowania embrionów ze szczepu eighties podchlorynem sodu uniemożliwi prawidłowe pękanie endokorionu. Dla embrionów ze szczepu eighties wymagany jest czas maksymalnie 35 sekund, natomiast dla embrionów ze szczepu awfully in QX wystarczające jest 75 sekund. Pod mikroskopem stereoskopowym przy małym powiększeniu należy zweryfikować efekt dekoryzacji. W przypadku embrionów ze szczepu eighties zabraknie siatkowatego egzokorionu, a w przypadku embrionów ze szczepu anomaly's obecna będzie jedynie gładka, wypolerowana powierzchnia czarnego endokorionu.Po pokryciu embrionów struktury grzbietowe oraz wypływy egzochorialne znikną. Należy przejść do utrwalenia i przerwania ciągłości endochorionu zgodnie z procedurą opisaną w protokole pisemnym. Aby odkleić przerwany endochorion, należy umieścić kawałek dwustronnej taśmy do peruk w centrum trzydziestocentymetrowej szalki Petriego, używając końcówki do pipety 200 µL o szerokim otworze.Przenieś embriony z metanolu na taśmę dwustronną. Odczekaj od jednej do dwóch minut, aż embriony osiądą i przylegają do powierzchni taśmy, odlej nadmiar metanolu i pozostaw powierzchnię do lekkiego wyschnięcia na jedną do dwóch minut. Następnie dodaj do szalki Petriego 95% etanol, aby dodatkowo unieruchomić embriony na taśmie, pipetuj 600 µL wody destylowanej do etanolu i zamieszaj przez delikatne obracanie.Następnie, używając igły 27.5 przymocowanej do cylindra strzykawki o pojemności 1 ml, należy odwarstwić pęknięty endokurion. Po uwolnieniu białego embrionu z czarnych pozostałości endokurionu za pomocą pędzla artystycznego z cienką końcówką, bezzwłocznie przenieść embriony z taśmy do zbiornika z etanolem w szalce Petriego. Następnie, używając końcówki do pipety o rozmiarze 3 mm, przenieść embriony do probówki typu microfuge o pojemności 1,5 ml zawierającej 500 µL 100% etanolu. Na koniec przemyć embriony dwa do trzech razy w 100% etanolu i przechowywać je w czystym etanolu w temperaturze -20 °C.Na tym rysunku w części C dwie hybrydyzacje całych gruczołów ślinowych samic Aedes aegypti z sondami mRNA celującymi w amylazę 1D7S2 oraz 1D7L2 wykazują akumulację tych transkryptów odpowiednio w bocznych proksymalnych, bocznych dystalnych oraz boczno-przyśrodkowych dystalnych płatach. W tym eksperymencie całe cysty trzech gatunków komarów poddano hybrydyzacji z sondami mRNA specyficznie celującymi w odpowiednie autologiczne transkrypty Oscar. Tutaj w części C2 przeprowadzono hybrydyzację całych embrionów Anopheles gambiae, Aedes aegypti i Culex quinquefasciatus przy użyciu antysensownych sond RNA celujących w odpowiednie autologiczne transkrypty Oscar u tych komarów.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania eksperymentu hybrydyzacji in situ w celu określenia lokalizacji i akumulacji transkryptów w konkretnych tkankach lub embrionach komarów.

hybridization-situ-salivary-glands-ovaries-embryos-vector

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Hybrydyzacja in situ ślinianek, jajników i zarodków komarów-wektorów

Opisano metody wykorzystania systemów transdukcyjnych alfawirusów do ekspresji reporterów fluorescencyjnych in vitro oraz u dorosłych komarów. Technikę tę można dostosować w celu ekspresji dowolnego białka docelowego zamiast reportera lub dodatkowo do niego.

System transdukcji alfawirusów: narzędzia do wizualizacji infekcji w wektorach komarzych

Wśród trzech rodzajów komarów, mianowicie Anopheles, Aedes oraz Culex, techniki fizycznego mapowania genomu opracowano jedynie dla Anopheles, którego przedstawiciele posiadają czytelne chromosomy politeniczne. W przypadku rodzajów Aedes i Culex mapowanie cytogenetyczne pozostaje jednak wyzwaniem ze względu na niską jakość chromosomów politenicznych. Przedstawiamy tutaj uniwersalny protokół otrzymywania wysokiej jakości preparatów chromosomów mitotycznych oraz zoptymalizowany protokół FISH dla...

Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ na chromosomach mitotycznych komarów

Dla efektywnej kontroli przenoszenia wirusów przenoszonych przez komary, szczególnie interesująca jest wiedza na temat potencjału wektorowego poszczególnych komarów. Opisujemy wymuszone ślinotok jako metodę analizy kompetencji wektorowych Aedes albopictus i trzech różnych taksonów Culex pod kątem przenoszenia wirusa Zika.

Wymuszone wydzielanie śliny jako metoda analizy kompetencji wektorowych komarów

Ten protokół opisuje metodologię mikroiniekcji, którą ustandaryzowaliśmy i stosowaliśmy przez kilka lat, aby dostarczyć określone ilości kwasów nukleinowych bezpośrednio do hemolimfy komarów i much domowych. Protokół ten skutkuje minimalną śmiertelnością po wstrzyknięciach i umożliwia pomiary płodności skorelowane z dawką.

Powtarzalny test biologiczny mikroiniekcji dsRNA i składania jaj u komarów i much domowych

Ten protokół opisuje procedury mikroiniekcji dla zarodków Culex quinquefasciatus, które są zoptymalizowane do pracy z narzędziami do edycji genów CRISPR/Cas9. Technika ta może skutecznie generować specyficzne dla danego miejsca, dziedziczne mutacje linii zarodkowej, które można wykorzystać do budowy technologii genetycznych w tym niedostatecznie zbadanym wektorze choroby.

Techniki mikroiniekcji zarodków w celu skutecznej mutagenezy specyficznej dla miejsca w Culex quinquefasciatus

Biorąc pod uwagę ich prostą anatomię, jądra Anopheles oferują dobry model cytologiczny do badania spermatogenezy. Protokół ten opisuje hybrydyzację in situ z fluorescencją na całej górze, technikę stosowaną do badania tego procesu biologicznego, a także fenotyp szczepów transgenicznych zawierających mutacje w genach zaangażowanych w produkcję plemników.

Hybrydyzacja fluorescencji in situ w całości w celu zbadania spermatogenezy u komara Anopheles

Artykuł opisuje metody i odczynniki niezbędne do przeprowadzenia hybrydyzacji, reakcji łańcuchowej, fluorescencji RNA, hybrydyzacji in situ (HCR, RNA, WM-FISH), aby ujawnić wgląd w przestrzenną i komórkową rozdzielczość genów receptorów chemosensorycznych w czułku komara i palpie szczękowym.

Hybrydyzacja Reakcja łańcuchowa RNA Cała góra Fluorescencja in situ Hybrydyzacja genów chemosensorycznych w przydatkach węchowych komarów

Społeczności mikrobiologiczne u komarów są bardzo obiecujące dla strategii biokontroli wektorów. Większość symbiontów nie nadaje się do hodowli, co wymaga analiz metagenomicznych. Opisujemy metodę preparacji samic komarów i oddzielania jajników, jelita środkowego i gruczołów ślinowych, zapobiegając zanieczyszczeniu krzyżowemu, ułatwiając badania mikrobiomu na poziomie narządów i zwiększając zrozumienie roli mikroorganizmów w biologii komarów.

Rozwarstwienie jajników, jelita środkowego i gruczołów ślinowych komarów w celu analizy mikrobiomu na poziomie narządów

Niniejszy protokół opisuje prostą metodę opartą na zastosowaniu taśmy klejącej do pobierania próbek z powierzchni pomidorów oraz innych świeżych produktów rolnych, a następnie szybką detekcję całych komórek Salmonella przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH).

Połączenie pobierania próbek za pomocą taśmy klejącej i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w celu szybkiego wykrywania Salmonella na świeżych produktach rolnych

Opisujemy metodę przetwarzania i przesiewania komarów zebranych w terenie pod kątem różnorodnych wirusów za pomocą testu z hodowlą komórek Vero. Stosując tę technikę, wykryliśmy 9 różnych wirusów z 4 rodzin taksonomicznych w komarach zebranych w Connecticut.

Wykrywanie wirusów zakaźnych z komarów zebranych w terenie za pomocą testu hodowli komórek Vero

Poznaj metodę hybrydyzacji in situ do badania ekspresji genów w tkankach komarów i zarodkach. Technika ta pozwala wizualizować lokalizację transkryptów mRNA, wspierając badania genomiki funkcjonalnej.

Hybrydyzacja in situ gruczołów ślinowych, jajników i embrionów komarów wektorowych

Przeglądaj więcej filmów